本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種酶法制備艾沙度林中間體的方法。
背景技術(shù)：
伊盧多啉(Eluxadoline)又稱為艾沙度林，其化學(xué)名稱為4-(氨基羰基)-N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-2,6-二甲基-L-苯丙氨酸，商品名為Viberzi，2015年5月27日獲FDA批準(zhǔn)上市，用于治療腹瀉性腸易激綜合癥，據(jù)權(quán)威機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，這種病癥的患者在歐洲和美國(guó)高達(dá)2800萬(wàn)，市場(chǎng)前景廣闊。艾沙度林結(jié)構(gòu)式如下所示
其中化合物I為伊盧多啉制備過(guò)程中所需的關(guān)鍵中間體，該中間體收率、成本直接影響伊盧多啉的產(chǎn)品純度和成本，故化合物I的制備方法已引起科研工作者的高度重視。
Chaozhong Cai等人描述了一種制備化合物I的方法(Tetrahedron,2005,61,6836-6838.)，其合成路線如下所示：
該方法以N-Boc-2,6-二甲基-L-酪氨酸為原料經(jīng)4步反應(yīng)得到化合物I，但是存在起始物料價(jià)格昂貴、總收率低等缺點(diǎn)。
現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的化合物I的制備方法均為化學(xué)法制備，存在反應(yīng)條件苛刻、收率較低、環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題，工業(yè)化生產(chǎn)受到極大阻礙。與化學(xué)合成法相比，生物合成法具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)近年來(lái)受到廣泛關(guān)注，目前未見(jiàn)生物法制備艾沙度林中間體的公開(kāi)文獻(xiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺陷，本發(fā)明公開(kāi)了一種酶法制備艾沙度林中間體的方法。
具體工藝路線如下所示：
化合物V在腈水合酶的作用下進(jìn)行酶催化反應(yīng)得到化合物I，其中R1選自C1-C6的烷基、芐基或氫原子，優(yōu)選為氫原子；R2選自Boc(叔丁氧羰基)、Cbz(芐氧羰基)、Fmoc(芴甲氧羰基)、Teoc(三甲基硅乙氧羰基)或氫原子，優(yōu)選為叔丁氧羰基。
進(jìn)一步說(shuō)，腈水合酶為市場(chǎng)上可以購(gòu)得的NHT101～NHT124，來(lái)自尚科生物醫(yī)藥(上海)有限公司。
進(jìn)一步說(shuō)，腈水合酶以酶粉形式、含腈水合酶的細(xì)胞破碎液或全細(xì)胞的形式加入，優(yōu)選以酶粉形式加入。
進(jìn)一步說(shuō)，該酶法反應(yīng)在溫度為30～40℃，pH＝6～8條件下進(jìn)行。
進(jìn)一步說(shuō)，該酶法反應(yīng)將化合物V、腈水合酶和緩沖液按一定比例混合反應(yīng)得到產(chǎn)物，其中化合物V的濃度為30～100g/L，腈水合酶的濃度為5～10g/L和所述緩沖液的濃度為10～100mM。
進(jìn)一步說(shuō)，化合物V的制備方法包括如下步驟：
步驟a)：化合物II與鋅粉在有機(jī)溶劑中反應(yīng)生成化合物III；
步驟b)：化合物III與化合物IV在鈀催化劑和膦配體的催化下反應(yīng)得到化合物V；
其中化合物II、III、V、I的R1和R2所代表的基團(tuán)相同。
進(jìn)一步說(shuō)，所述有機(jī)溶劑為二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺，優(yōu)選為二甲基甲酰胺。
進(jìn)一步說(shuō)，鈀催化劑為Pd2(dba)3，膦配體為三(鄰甲苯基)膦。
進(jìn)一步說(shuō)，步驟b)中鈀催化劑與化合物IV的質(zhì)量比為0.001～0.1，膦配體與化合物IV的質(zhì)量比為0.001～0.1。
一種酶法制備下式化合物(I-A)的方法，
所述方法包括，
步驟a)：化合物II-A與鋅粉在有機(jī)溶劑中反應(yīng)生成化合物III-A；所述有機(jī)溶劑為二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺，優(yōu)選為二甲基甲酰胺。
步驟b)：化合物III-A與化合物IV在鈀催化劑和膦配體的催化下反應(yīng)得到化合物V-A；鈀催化劑為Pd2(dba)3，膦配體為三(鄰甲苯基)膦。
步驟c)：化合物V-A經(jīng)過(guò)堿性條件下酯的水解和腈水合酶作用下氰基還原制備化合物I-A，所述堿性條件為L(zhǎng)iOH，NaOH或KOH，所述腈水合酶選自尚科生物醫(yī)藥(上海)有限公司自有的腈水合酶酶庫(kù)，即NHT101～NHT124。
與現(xiàn)有化學(xué)合成方法相比，本發(fā)明提供了一種制備艾沙度林中間體的綠色技術(shù)方案，該方案反應(yīng)條件溫和，收率較高，對(duì)環(huán)境友好，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容作進(jìn)一步的闡述，其目的是為了更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。
實(shí)施例1
(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V)的制備
將鋅粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反應(yīng)瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯硅烷(0.13g),將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(化合物II，7.1克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反應(yīng)體系，攪拌1小時(shí)。25℃保溫反應(yīng)過(guò)夜得鋅試劑，直接用于下一步反應(yīng)。
將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(鄰甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反應(yīng)瓶中，加熱至90℃，滴入上述制備的鋅試劑，0.5小時(shí)滴加完。TLC顯示原料反應(yīng)完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，攪拌，分層，有機(jī)相用飽和氯化銨溶液(20毫升)洗滌、水(20毫升)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V，3.29克，收率90％)。
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I)的制備
于30mL反應(yīng)容器中加入10mM的磷酸鹽緩沖液(10mL，pH＝7.0)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0，加入上述制備得到的化合物V(1.5克)，攪拌均勻后加入腈水合酶酶粉NHT101(0.15克)定容至15mL，30℃下磁力攪拌敞口反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中用NaOH(3M)控制反應(yīng)pH在7.0左右，TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后70℃保溫2h使反應(yīng)液中蛋白質(zhì)變性，過(guò)濾去除蛋白質(zhì)，加NaOH(3M)調(diào)節(jié)pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I，1.55g，收率98％)，HPLC檢測(cè)S型產(chǎn)物ee值為99.1％。
實(shí)施例2
百克級(jí)(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V)的制備
將鋅粉(216.6克)、DMF(540毫升)和1,2-二溴乙烷(36克)加入反應(yīng)瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯硅烷(13克)，將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(化合物II，710克)的DMF(540毫升)溶液在20℃下滴加入反應(yīng)體系，攪拌1.5小時(shí)。25℃保溫反應(yīng)過(guò)夜得鋅試劑，直接用于下一步反應(yīng)。
將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(280克)、三(鄰甲苯基)膦(2克)、Pd2(dba)3(3克)和DMF(600毫升)加入反應(yīng)瓶中，加熱至90℃，滴入上述制備的鋅試劑，1.5小時(shí)滴加完。TLC顯示原料反應(yīng)完全，冷卻至15～20℃。向反應(yīng)液中加入硅膠(100克)，攪拌1小時(shí)過(guò)濾。濾液中加入飽和氯化銨溶液(4500毫升)，攪拌1小時(shí)過(guò)濾，濾餅烘干得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V，333克，收率92％)。
百克級(jí)(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I)的制備
向帶夾套的玻璃反應(yīng)釜(5L)中加入10mM的磷酸鹽緩沖液(2L，pH＝7.0)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0，加入上述制備得到的化合物V(150克)，攪拌均勻后加入腈水合酶酶粉NHT101(10克)定容至3L，30℃下磁力攪拌敞口反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中用NaOH(3M)控制反應(yīng)pH在7.0左右，TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后70℃保溫2h使反應(yīng)液中蛋白質(zhì)變性，過(guò)濾去除蛋白質(zhì)，加NaOH(3M)調(diào)節(jié)pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I，151.8克，收率96％)，HPLC檢測(cè)S型產(chǎn)物ee值為99.3％。
實(shí)施例3
(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物V)的制備
將鋅粉(1.08克)、DMF(2.7毫升)和1,2-二溴乙烷(0.18克)加入反應(yīng)瓶中，加熱至90℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯硅烷(0.07克),將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸乙酯(化合物II，3.3克)的DMF(2.7毫升)溶液在20℃下滴加入反應(yīng)體系，攪拌0.5小時(shí)。20℃保溫反應(yīng)過(guò)夜得鋅試劑，直接用于下一步反應(yīng)。
將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(1.4克)、三(鄰甲苯基)膦(0.01克)、Pd2(dba)3(0.15克)和DMF(3毫升)加入反應(yīng)瓶中，加熱至90℃，滴入上述制備的鋅試劑，0.5小時(shí)滴加完。TLC顯示原料反應(yīng)完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(10毫升)和乙酸乙酯(10毫升)，攪拌，分層，有機(jī)相用飽和氯化銨溶液(10毫升)洗滌、水(10毫升)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物V，1.66克，收率88％)。
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物I)的制備
于50mL反應(yīng)容器中加入10mM的磷酸鹽緩沖液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至8.0，加入上述制備得到的化合物V(1.5克)，攪拌均勻后加入腈水合酶酶粉NHT110(0.12克)定容至30mL，35℃下磁力攪拌敞口反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中用NaOH(3M)控制反應(yīng)pH在8.0左右，TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后70℃保溫2h使反應(yīng)液中蛋白質(zhì)變性，過(guò)濾去除蛋白質(zhì)，加NaOH(3M)調(diào)節(jié)pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物I，1.53克，收率97％)，HPLC檢測(cè)S型產(chǎn)物ee值為99.0％。
實(shí)施例4
(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物V)的制備
將鋅粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反應(yīng)瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯硅烷(0.13克),將(R)-3-碘代-N-Cbz-丙氨酸甲酯(化合物II，7.9克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反應(yīng)體系，攪拌1小時(shí)。25℃保溫反應(yīng)過(guò)夜得鋅試劑，直接用于下一步反應(yīng)。
將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(鄰甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反應(yīng)瓶中，加熱至90℃，滴入上述制備的鋅試劑，0.5小時(shí)滴加完。TLC顯示原料反應(yīng)完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，攪拌，分層，有機(jī)相用飽和氯化銨溶液(20毫升)洗滌、水(20毫升)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物V，3.66克，收率91％)。
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物I)的制備
于100mL反應(yīng)容器中加入10mM的磷酸鹽緩沖液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.5，加入上述制備得到的化合物V(1.5克)，攪拌均勻后加入腈水合酶酶粉NHT121(0.12克)定容至30mL，30℃下磁力攪拌敞口反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中用NaOH(3M)控制反應(yīng)pH在7.0左右，TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后75℃保溫2h使反應(yīng)液中蛋白質(zhì)變性，過(guò)濾去除蛋白質(zhì)，加NaOH(3M)調(diào)節(jié)pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物I，1.54克，收率98％)，HPLC檢測(cè)S型產(chǎn)物ee值為99.0％。
實(shí)施例5
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A)的制備
將鋅粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反應(yīng)瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯硅烷(0.13克),將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(7.1克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反應(yīng)體系，攪拌1小時(shí)。25℃保溫反應(yīng)過(guò)夜得鋅試劑，直接用于下一步反應(yīng)。
將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(鄰甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反應(yīng)瓶中，加熱至90℃，滴入上述制備的鋅試劑，0.5小時(shí)滴加完。TLC顯示原料反應(yīng)完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，攪拌，分層，有機(jī)相用飽和氯化銨溶液(20毫升)洗滌、水(20毫升)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.29克，收率90％)。
將(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.29克)加入到四氫呋喃(15毫升)和水(15毫升)，攪拌下降溫至0～5℃。向溶液中滴加一水合氫氧化鋰(0.62克)的水(10毫升)溶液。攪拌1.5小時(shí)，TLC顯示反應(yīng)完全。加入乙酸乙酯(15毫升*3)提取，水相中滴加1M的鹽酸調(diào)pH＝2，過(guò)濾，水(20ml)洗滌，40℃真空干燥8小時(shí)得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物V，3.03克，96％)。
于100mL反應(yīng)容器中加入10mM的磷酸鹽緩沖液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5，加入上述制備得到的(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸(1.5克)，攪拌均勻后加入腈水合酶酶粉NHT101(0.1克)定容至30mL，25℃下磁力攪拌敞口反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中用NaOH(3M)控制反應(yīng)pH在7.0左右，TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后70℃保溫2h使反應(yīng)液中蛋白質(zhì)變性，過(guò)濾去除蛋白質(zhì)，加NaOH(3M)調(diào)節(jié)pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A，1.54克，收率97％)，HPLC檢測(cè)S型產(chǎn)物ee值為99.5％。
實(shí)施例6
(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A)的制備
將鋅粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反應(yīng)瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯硅烷(0.13克),將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(7.1克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反應(yīng)體系，攪拌1小時(shí)。25℃保溫反應(yīng)過(guò)夜得鋅試劑，直接用于下一步反應(yīng)。
將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(鄰甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反應(yīng)瓶中，加熱至90℃，滴入上述制備的鋅試劑，0.5小時(shí)滴加完。TLC顯示原料反應(yīng)完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，攪拌，分層，有機(jī)相用飽和氯化銨溶液(20毫升)洗滌、水(20毫升)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.29克，收率90％)。
于50mL反應(yīng)容器中加入10mM的磷酸鹽緩沖液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0，加入上述制備得到的(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3克)，攪拌均勻后加入腈水合酶酶粉NHT101(0.3克)定容至30mL，30℃下磁力攪拌敞口反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中用NaOH(3M)控制反應(yīng)pH在7.0左右，TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后75℃保溫2h使反應(yīng)液中蛋白質(zhì)變性，過(guò)濾去除蛋白質(zhì)，加NaOH(3M)調(diào)節(jié)pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I，3.1克，收率98％)，HPLC檢測(cè)S型產(chǎn)物ee值為99.1％。
將(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.1克)加入到四氫呋喃(15毫升)和水(15毫升)，攪拌下降溫至0～5℃。向溶液中滴加一水合氫氧化鋰(0.62克)的水(10毫升)溶液。攪拌1.5小時(shí)，TLC顯示反應(yīng)完全。加入乙酸乙酯(15毫升*3)提取，水相中滴加1M的鹽酸調(diào)pH＝2，過(guò)濾，水(20ml)洗滌，40℃真空干燥8小時(shí)得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A，2.83克，95％)，HPLC檢測(cè)S型產(chǎn)物ee值為99.2％。