專利名稱：一種來源于黃瓜的聯(lián)乙烯還原酶及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于黃瓜的蛋白作為聯(lián)乙烯還原酶的應用，特別涉及由序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a為單乙烯葉綠素酸酯a 中的應用。
背景技術(shù)：
葉綠素是植物進行光合作用的重要色素，它的作用是捕獲光能并將光能轉(zhuǎn)移到反應中心，故對植物的生長及其產(chǎn)量有很重要的作用。根據(jù)乙烯側(cè)鏈數(shù)目的不同，葉綠素可分為3，8_聯(lián)乙烯葉綠素(DV Chls)和3-乙烯葉綠素(單乙烯葉綠素，MV Chls)。在正常情況下，幾乎所有的植物和細菌用于光合作用的葉綠素都是MV chls,目前只發(fā)現(xiàn)一類海洋生物艮f]“the marine prochlorophyte Prochlorococcus marinus，，利用的是 DVChls (Chisholm SW, Frankel SL, Goericke R， Olson RJ, Palenik B， Waterbury JB, West-Johnsrud L， Zettler ER(1992)Prochlorococcus marinus nov. gen. nov.sp. :A marine prokaryote containing divinylchlorophyll a and b. Arch. Microbiol 157:297-300·)。
葉綠素生物合成的多樣性主要在于它有單乙烯葉綠素(MV Chls)和聯(lián)乙烯葉綠素(DV Chls)兩條平行合成的途徑，DV Chls及其中間產(chǎn)物通過聯(lián)乙烯基還原酶(DVR， 又叫C-8乙烯基還原酶)催化轉(zhuǎn)化成MV Chls及其中間產(chǎn)物(Rebeiz CA，Kolossov VL, Briskin D，Gawienowski M(2003)Chloroplast biogenesis :chlorophyll biosynthetic heterogeneity, multiple biosynthetic routes， and biological spin—oVs， in H. S. Nalwa(Ed.), Handbook of Photochemistry and Photobiology, vol.4, American ScientiWciLos Angeles :183-248.)。迄今為止，已在5種底物水平上檢測到聯(lián)乙烯還原酶活性，分別是聯(lián)乙烯Mg-原卟啉IX(DV Mg-proto)、聯(lián)乙烯Mg-原卟啉IX單甲酯(DV MPE). 聯(lián)乙烯原葉綠素酸酯a(DV Pchlide a)、聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a(DV Chlide a)和聯(lián)乙烯葉綠素 a(DV Chl a) (Kolossov VL, Bohnert HJ, Rebeiz CA(2006)Chloroplast biogenesis 92 :In situ screening for divinyl chlorophyll (ide)a reductase mutants by spectroXuorometry. Analytical Biochemistry 348:192—197)。禾g，Mlt^f、參錄硫細菌Chlorobium t印idum和藍細菌Synechocystis sp. PCC6803中分別克隆了相應的聯(lián)乙烯還原酶基因 DVR、bciA 和 slrl923 (Wang PR，Gao JX，Wan CM，Zhang FT，Xu ZJ，Huang XQ,Sun XQiDeng XJ(2010)Divinyl chlorophyll (ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153,994-1003 ； Nagata N，Tanaka R，Satoh S，Tanaka A(2005) Identification of a Vinyl Reductase Gene for Chlorophyll Synthesis in Arabidopsis thaliana and Implications for the Evolution of Prochlorococcus Species.Plant Cell 17，233-240 ；Chew AGM, Bryant DA(2007)Characterization of a Plant-like Protochlorophy11ide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria. J. Biol. Chem 28 :2967-2975 ；Islam MR，Aikawa S，Midorikawa T，Kashino Y，Satoh K，Koike H(2008)sir1923 of Synechocystissp.PCC6803 Is Essential for Conversion of 3,8-Divinyl (proto)chlorophyll(ide) to 3-Monovinyl (proto) chlorophyll (ide). Plant Physiology 148:1068-1081)。已有實驗證明用NADPH作為還原劑，重組的綠硫細菌(Chlorobium t印idum)BciA蛋白質(zhì)將 DV Pchlide a 還原成 MV Pchlide a (Chew AGM, Bryant DA (2007) Characterization of a Plant-like Protochlorophy11ide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria. J. Biol. Chem 28 :2967-2975)；重組的擬南芥 DVR 蛋白質(zhì)將 DVChlide a 還原成 MV Chlide a，但不能將DV Pchlide a、DV Chlide b、DV Chl a和DV Chlb等4種DV物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應的 MV 物質(zhì)(Nagata N, Tanaka R, Tanaka A(2007) The Major Route for Chlorophyll Synthesis Includes[3,8-divinyl]-chlorophyllide a Reduction in Arabidopsis thaiiana. Plant Cell Physiol 48:1803-1808)。我們通過酶學實驗證實重組的水稻 DVR蛋白質(zhì)不僅能將DV Chlide a還原成MV Chlide a，而且能還原DV Chl a為MV Chl a (Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ, Sun XQ, Deng XJ (2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153，994-1003)。目前不清楚的是，這些聯(lián)乙烯中間物質(zhì)是由一個具有廣泛特異性的聯(lián)乙烯基還原酶催化，還是由多個聯(lián)乙烯基還原酶(每個酶都有特異底物)催化生成相應的單乙烯物質(zhì)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來源于黃瓜(Cucumis sativus L.)的蛋白質(zhì)的新用途。 該蛋白質(zhì)由序列表中序列2所示氨基酸序列組成。
本發(fā)明所提供的新用途具體為由序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在作為聯(lián)乙烯還原酶中的應用。
在上述應用中，所述聯(lián)乙烯還原酶能將聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a轉(zhuǎn)化為單乙烯葉綠素酸酯a ；所述蛋白質(zhì)的編碼序列為序列表中序列1。
由序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a為單乙烯葉綠素酸酯a中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
在上述應用中，所述蛋白質(zhì)的編碼序列為序列表中序列1。
實驗證明，由序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有聯(lián)乙烯還原酶活性，能夠?qū)⒙?lián)乙烯葉綠素酸酯a轉(zhuǎn)化為單乙烯葉綠素酸酯a。


圖1為CsDVR酶學反應產(chǎn)物的HPLC檢測光譜圖。其中，A和B的左側(cè)圖分別是反應IOmin的產(chǎn)物在440nm和410nm檢測到的HPLC色譜圖，右側(cè)圖均是每個峰的吸收光譜。 A代表底物為聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a(DV Chlide a)的酶學反應產(chǎn)物的HPLC檢測光譜圖。B 代表底物為聯(lián)乙烯葉綠素a(DV Chl a)的酶學反應產(chǎn)物的HPLC檢測光譜圖。具體的，Al 和A2分別是聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a (DV Chlide a)和單乙烯葉綠素酸酯a (MV Chlide a)。Bl 和B2分別是聯(lián)乙烯葉綠素a (DV Chl a)和單乙烯葉綠素a (MV Chl a)。A3和B3分別是DV Chlide a與BL21/pET-30a(+)空載體反應后的色素(陰性對照)，以及DV Chla與BL21/ pET-30a(+)空載體反應后的色素(陰性對照)；A4是聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a(DV Chlide a)與BL21/pET-30a(+)-CsDVR大腸桿菌裂解液反應后的色素，B4是聯(lián)乙烯葉綠素a(DV Chl a) 與BL21/pET-30a(+)-CsDVR大腸桿菌裂解液反應后的色素。AO(空白對照)是用茼蒿葉片制備的丙酮粉中殘留的MV-Chl a經(jīng)溫育后產(chǎn)生的MV-Chlide a ；Al和A3中的弱峰(峰2) 即是從丙酮粉中殘留的MV-Chl a轉(zhuǎn)化而來的MV-Chlide a。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1、黃瓜聯(lián)乙烯還原酶基因的克隆及其編碼蛋白的功能驗證
一、黃瓜聯(lián)乙烯還原酶基因的克隆
以黃瓜序列 Csa000053 的 DNA 序列(http //cucumber, genomics, org. cn)設計以下引物
CsDVR-F :5，-GAGGATCCATGTCCATTTGCTCCACCGTT-3‘(下劃線處為 BamH I 酶切位占)
CsDVR-R 5’ -ACCGAGCTCAAAAAACGCTCTGTTCACC-3’ (下劃線處為 c I 酶切位點)
以黃瓜(Cucumis sativus L.)品種“皇優(yōu)八號”(從農(nóng)貿(mào)市場種子攤商購買)葉片提取的基因組DNA為模板，用引物CsDVR-F和CsDVR-R進行PCR擴增，得到1260bp的片段， 將該片段連接在pMD-18-T (TaKaRa)載體上，構(gòu)建成pMD_CsDVR，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109 菌株中，篩選陽性克隆后測序。測序結(jié)果表明擴增得到的片段具有序列表中序列1所示的序列，將其命名為CsDVR。序列1所示序列即為CsDVR基因的編碼序列，它編碼得到序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，將該蛋白質(zhì)命名為CsDVR。
二、黃瓜聯(lián)乙烯還原酶基因編碼蛋白的獲得及其功能驗證
1、重組表達載體pET_30a (+) -CsDVR的構(gòu)建
將經(jīng)步驟一測序鑒定正確的pMD-CsDVR載體用BamHI和Me I雙酶切，連接到經(jīng)同樣酶切過的表達載體pET-30a(+) (Novagen，產(chǎn)品目錄號69909- 上，構(gòu)成重組表達載體 pET-30a(+)-CsDVRo
2、誘導表達
將步驟1的重組表達載體pET_30a(+)-CsDVR轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21 (同時設置pET-30a(+)空載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21的對照)，在37°C，LB/kan培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，挑選單克隆于371，1^/1 111培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒0嫩(01^64試劑盒)，用8膽!1 I 和Mc I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測CsDVR基因是否插入載體pET-30a(+)中，將檢測含有CsDVR基因的重組表達載體的克隆送上海英駿公司測序，將篩選正確插入pET-30a(+)的 CsDVR基因的重組表達載體的克隆命名為BL21/pET-30a(+)-CsDVR。轉(zhuǎn)入pET_30a(+)空載體的大腸桿菌菌株BL21命名為BL21/pET-30a(+)。然后參照(NagataN，Tanaka R, Satoh S, TanakaA(2005)Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus Species. Plant Cell 17:233-240)的方法將 BL21/pET_30a(+)-CsDVR 進行誘導表達，具體方法如下分別挑選BL21/pET-30a (+) -CsDVR和含有空載體pET-30a (+)的BL21 (空載體對照CK)單克隆于20°C，LB/kan培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)一夜，分別取Iml菌液于IOOmlLB/kan培養(yǎng)液，30°C振蕩培養(yǎng)30min后加入異丙基硫代- β -半乳糖苷(IPTG)，終濃度為 0. 5mM,于30°C誘導培養(yǎng)7h，4°C IOOOOrpm離心IOmin,沉淀用含有6. 7 μ g · πιΓ1溶菌酶禾口 3. 3 μ g · IIir1DNaseI的50mM的Tris-HCl的溶液懸浮，溶解產(chǎn)物放入_20°C冰箱保存。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表達的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，在約46kD處，BL21/ pET-30a (+) -CsDVR有明顯的蛋白質(zhì)條帶，而空載體對照CK沒有，說明CsDVR基因在BL21中表達了蛋白質(zhì)CsDVR，并且蛋白質(zhì)的分子量與預期結(jié)果相一致。
3、酶促反應驗證蛋白功能
此步驟所用底物涉及如下兩種聯(lián)乙烯葉綠素a(DV Chl a)和聯(lián)乙烯葉綠素酸酯 a(DV Chlide a)。
這兩種底物通過如下方法獲得聯(lián)乙烯葉綠素a(DV Chl a)從水稻824ys突變體 (黃曉群，王平榮，趙海新，鄧曉建.一個新的水稻葉綠素缺失突變基因的遺傳分析與分子標記定位.中國水稻科學，2007，21 ) :355-359 ；Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ,Sun XQ, Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153, 994-1003)葉綠素中分離，用100%丙酮從824ys突變體新鮮葉片組織中浸提葉綠素，提取液10000r/min (Eppendorf 5804R)離心15min，上清液在氮氣下吹干，重溶于100%丙酮。然后用(18柱0. 6mm i. d. X 150mm long ；5 μ m, Agilent,U. S. Α)進行 HPLC 分離，洗脫條件是流動相甲醇乙腈丙酮=1 3 1，40°〇，流速1.0111171^11，上樣量5“1^柱中洗脫的色素用660nm波長監(jiān)測，在相應保留時間收集DV Chl a，具體參見Wang等在Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ，Sun XQ, Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153，994-1003 中記載的方法。
聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a(DV Chlide a)是用上述分離的聯(lián)乙烯葉綠素a(DV Chl a) 與從茼蒿葉片制備的丙酮粉中的葉綠素酶反應所得。
其中，丙酮粉(葉綠素酶)的制備方法如下按照Ito等(Ito H，Takaichi S， Tsuji H, Tanaka A. Properties of synthesis of chlorophyll a from chlorophyll b in cucumber etioplasts. J Biol Chem, 1994,269 :22034-22038)的方法，用茼蒿 (Garland chrysanthemum)(品種為“清香茼蒿”，從農(nóng)貿(mào)市場種子攤商購買)葉片制備丙酮粉，具體為取15g新鮮茼蒿葉片，加入300mL冷凍的丙酮，放入組織搗碎機中快速搗碎， 40C lOOOOr/min離心lOmin，棄上清液；然后用丙酮沖洗沉淀，直到葉綠素完全洗凈為止；最后將沉淀置于減壓真空離心機中吹干制得丙酮粉。
DV Chlide a 的制備方法如下按照 Holden(Holden M. The breakdown of chlorophyll by chlorophyllase. Biochem J，1961，78 :359-364)和 Ito等(Ito H,Ohtsuka Τ, Tanaka A. Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a via 7-hydroxymethyl chlorophyll. J Biol Chem，1996，271 :1475-1479)的方法，用 200 μ g 聯(lián)乙烯葉綠素 a(DV Chl a)(上述經(jīng)HPLC分離所得到的DV-Chl a)溶解于4mL溶液(25mM Tris-HCl, pH 7.5 和40%丙酮)中，與200mg丙酮粉在觀！、黑暗條件下溫育池，溫育后按照Ito等(Ito H, Tanaka Y, Tsuji H, Tanaka A. Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a by isolated cucumber etioplasts. Arch Biochem Biophys, 1993,306 :148-151)DV Chlide a。
用作對照的單乙烯葉綠素a(MV Chl a)參照上述聯(lián)乙烯葉綠素a(DV Chl a)的制備方法，從水稻野生型品種8MB(黃曉群，王平榮，趙海新，鄧曉建.一個新的水稻葉綠素缺失突變基因的遺傳分析與分子標記定位.中國水稻科學，2007，2K4) =355-359 ； Wang PR, Gao JX, Wan CM, Zhang FT, Xu ZJ, Huang XQ, Sun XQ, Deng XJ (2010) Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153，994—1003)中提取。
用作對照的單乙烯葉綠素酸酯a(MV Chlide a)參照上述聯(lián)乙烯葉綠素酸酯 a(DVChlide a)制備方法，用單乙烯葉綠素a(MV Chl a)作底物進行酶反應制備。
將BL21/pET_30a(+)-CsDVR表達的蛋白(CsDVR)和空載體對照CK分別與上述兩種底物在反應緩沖液(40mM檸檬酸，80mM K2HPO4,0. 5mM NADPH，20%丙酮，pH 7. 0)中30°C 反應lOmin，然后用丙酮終止反應，轉(zhuǎn)入乙醚中，經(jīng)氮氣吹干，再溶于丙酮，最后用HPLC檢測(同時設置作為底物DV Chl a對照的MV Chl a，以及作為底物DV Chlide a對照的MV Chlide a)。按照 Zapata 等(Zapata Μ,Rodriguez F and Garrido JL (2000) Separation of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton :A new HPLC method using a reversed phase C8 column and pyridine containing mobile phases. Mar. Ecol. Prog. Ser. 195 :29-45)的方法進行HPLC分析，洗脫采用梯度流動相(表1)，25°C，流速1. OmL/ min，上樣量 5yL，酶反應 DV Chl a 和 DV Chlide a 的產(chǎn)物用 C8 柱 6mm i. d. X 150mm long ；3.5 μ m, Agilent)檢測，柱中洗脫的色素分別用410nm和440nm波長監(jiān)測。
表IHPLC分析所采用的梯度流動相
權(quán)利要求
1.由序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在作為聯(lián)乙烯還原酶中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述聯(lián)乙烯還原酶能將聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a轉(zhuǎn)化為單乙烯葉綠素酸酯a。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于所述蛋白質(zhì)的編碼序列為序列表中序列1。
4.由序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a為單乙烯葉綠素酸酯a中的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述蛋白質(zhì)的編碼序列為序列表中序列1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源于黃瓜的蛋白作為聯(lián)乙烯還原酶的應用。本發(fā)明所提供的應用具體為由序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)作為聯(lián)乙烯還原酶的應用，具體表現(xiàn)在能將聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a轉(zhuǎn)化為單乙烯葉綠素酸酯a；序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼序列為序列表中序列1。實驗證明，本發(fā)明所提供的序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有聯(lián)乙烯還原酶活性，可以將聯(lián)乙烯葉綠素酸酯a轉(zhuǎn)化為單乙烯葉綠素酸酯a。
文檔編號C12N9/02GK102517263SQ20111042959
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者萬春美, 孫昌輝, 徐正君, 朱建清, 王平榮, 王萍渝, 肖云華, 鄧曉建, 馬曉智, 高曉玲 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學