自噬溶酶體過氧化氫標(biāo)記物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種由有機(jī)化合物配體與金屬離子組成的絡(luò)合物及其作為自噬溶酶體過氧化氫標(biāo)記物。此發(fā)明制得的化合物可作為自噬溶酶體過氧化氫的標(biāo)記物，用于檢測自噬過程中過氧化氫含量，特別是關(guān)于溶酶體疾病，例如檢測和監(jiān)測溶酶體中過氧化氫累積過程、監(jiān)測與溶酶體過氧化氫相關(guān)的疾病的生理過程；此發(fā)明也是關(guān)于毒性篩選方法，特別是對于潛在藥物和可疑有毒物質(zhì)的方法和高通量篩選；也可以用于基于熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡的實驗和組織成像。
【專利說明】自嗤溶酶體過氧化氫標(biāo)記物 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測試劑領(lǐng)域，是一種用于檢測自噬溶酶體過氧化氫的標(biāo)記物。 【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及一種由有機(jī)化合物配體與金屬離子組成的絡(luò)合物及其作為自噬溶酶 體過氧化氫標(biāo)記物。此發(fā)明制得的化合物可作為自噬溶酶體過氧化氫的標(biāo)記物，用于檢測 自噬過程中過氧化氫含量，特別是關(guān)于溶酶體疾病，例如檢測和監(jiān)測溶酶體中過氧化氫累 積過程、監(jiān)測與溶酶體過氧化氫相關(guān)的疾病的生理過程；此發(fā)明也是關(guān)于毒性篩選方法，特 別是對于潛在藥物和可疑有毒物質(zhì)的方法和高通量篩選；也可以用于基于熒光顯微鏡，共 聚焦顯微鏡的實驗和組織成像。
[0003] 細(xì)胞自噬是哺乳動物細(xì)胞溶酶體降解的主要途徑，對維持細(xì)胞的自我平衡、發(fā)展 和能量平衡非常重要。細(xì)胞自噬過程的中斷與神經(jīng)退化性紊亂、癌癥、心臟病和感染等疾病 密切相關(guān)。通過研究細(xì)胞自噬及其復(fù)雜的分子誘導(dǎo)機(jī)制，探索自噬在細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮 的作用，為疾病治療提供了新的途徑。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活性的治療已經(jīng)成為當(dāng)代腫瘤治 療和帕金森等疾病治療領(lǐng)域的新靶點和研究熱點。無論科研單位還是制藥公司對藥物誘導(dǎo) 細(xì)胞自噬在疾病治療中的應(yīng)用表現(xiàn)出極大興趣，期望通過研究自噬和死亡的關(guān)系和分子機(jī) 理，進(jìn)而利用細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用，使其在疾病治療中發(fā)揮作用。
[0004] 基于細(xì)胞的檢測由于它們的高生理的相關(guān)性，在制藥工業(yè)中越來越受歡迎。其它 優(yōu)點包括他們預(yù)測化合物的用途的能力，評估分子相互作用，確定毒性，區(qū)分細(xì)胞類型與特 異性藥物效果，并確定藥物滲透?；诩?xì)胞的實驗是始終相關(guān)的藥物發(fā)現(xiàn)渠道，因為它們能 夠提供從目標(biāo)特性到毒理學(xué)終端階段的數(shù)據(jù)。當(dāng)前行業(yè)發(fā)展趨勢要求，使用細(xì)胞實驗進(jìn)行 藥物篩選時容易進(jìn)行監(jiān)測，且能夠非侵入性的報道數(shù)據(jù)。對新藥開發(fā)而言，其根本途徑是提 高效率，降低成本，在更短的時間上市場。為早期階段失敗的化合物提供豐富的信息和準(zhǔn)確 的數(shù)據(jù)對早期階段的決策是必需的。這些數(shù)據(jù)可能會來自篩選化合物的結(jié)果中，即篩選相 關(guān)的生態(tài)系統(tǒng)，而不是經(jīng)典生化分析。這些篩選系統(tǒng)通常整合在先進(jìn)的成像平臺，如高通量 篩選（HCS)工作站。產(chǎn)業(yè)化熒光顯微鏡將導(dǎo)致高通量HCS影像平臺的發(fā)展。當(dāng)加上熒光報 告技術(shù)，HCS提供了信息豐富的藥物篩選，以及新類型的藥物靶標(biāo)。因此，開發(fā)一種快速有 效的熒光探針對于監(jiān)測細(xì)胞自噬過程和診斷相關(guān)疾病是非常必要的。
[0005] 過氧化氫（H202)是活性氧簇（ROS)的主要成員，作為有益或有害的信號標(biāo)志在生 理和病理過程中扮演重要的角色。H202的有益/有害之分取決于其生產(chǎn)和累積的濃度及亞 細(xì)胞位置。越來越多的證據(jù)表明，不僅是ROS產(chǎn)生的主要環(huán)境，如線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜， 還包括溶酶體參與的對過氧化氫循環(huán)的調(diào)節(jié)，最終決定了 ROS的生物結(jié)果和細(xì)胞區(qū)域間的 通訊。溶酶體中過量H202之間的交叉干擾將會導(dǎo)致溶酶體功能障礙，甚至破裂，這與自噬 和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。因此，在活細(xì)胞中使用具有高分辨率的溶酶體H202成像技術(shù)非常重 要。
[0006] 雖然由化學(xué)或遺傳操作的亞細(xì)胞如線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)，細(xì)胞膜和細(xì)胞核成像以 取得巨大進(jìn)展，但用于檢測溶酶體H202的方法報道很少。對于這種探針的主要挑戰(zhàn)包括： (1)溶酶體的酸性（pH為4. 5-6)對基于親核反應(yīng)的熒光H202探針和基因編碼的熒光蛋白 均不利；（2)由于過氧化氫是活性氧之中的中等的親電劑，所以化學(xué)選擇性低；（3)缺少 能夠靶向溶酶體的官能團(tuán)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種熒光探針，它具有良好的生物活性和選擇性，可以在很寬的pH范 圍內(nèi)作用。該探針是細(xì)胞滲透性的，并可以被用于可視化的外源或內(nèi)源性的溶酶體內(nèi)過氧 化氫。
[0008] 本發(fā)明還提供一種基于此標(biāo)記物的自噬溶酶體過氧化氫檢測的方法，包括以下步 驟：1)獲得樣品細(xì)胞；2)標(biāo)記物進(jìn)入到細(xì)胞的自噬溶酶體內(nèi)；3)通過檢測標(biāo)記物監(jiān)測溶酶 體內(nèi)過氧化氫量。此方法可以運(yùn)用在如下領(lǐng)域：1)實時監(jiān)測細(xì)胞自噬溶酶體內(nèi)過氧化氫的 量；2)檢測與自噬溶酶體過氧化氫相關(guān)的藥物的作用效果；3)藥物篩選。
[0009] 本發(fā)明適合的應(yīng)用涉及：熒光掃描顯微鏡、流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡、熒光分析 儀、基于微孔板的細(xì)胞技術(shù)、細(xì)胞微陣列分析、組織成像等。
[0010] 發(fā)明涉及熒光標(biāo)記物的制備和應(yīng)用，例如SN-2的制備方法和在細(xì)胞自噬溶酶體 檢測中的應(yīng)用。這些標(biāo)記物是一類小分子有機(jī)化合物，通常呈中性。它們的分子結(jié)構(gòu)中包 含特定的元素，如N、0、S、P等非金屬元素以及Fe、Cu、Pt、Au、Zn、Ru、Os等過渡金屬和鑭系 金屬元素。在一定的條件下，這些非金屬元素會同金屬元素作用，形成特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，即 通常所稱的金屬絡(luò)合物。特別是對于一些特定結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，其本生并無任何生物學(xué) 活性；只有與特定的金屬絡(luò)合后才表現(xiàn)出對自噬溶酶體過氧化氫的特異性作用，例如實施 實例中的化合物SN-2。這類包含特定金屬元素的化合物能夠選擇性的標(biāo)記自噬溶酶體過氧 化氫，并且發(fā)光強(qiáng)度隨著過氧化氫量的增加而增強(qiáng)。
[0011] 本發(fā)明提供的標(biāo)記物包含以下結(jié)構(gòu)： 其特征是：
【權(quán)利要求】
1. 一種由有機(jī)化合物配體與金屬離子組成的絡(luò)合物及其作為自噬溶酶體過氧化氫標(biāo) 記物，以及用此標(biāo)記物檢測自噬溶酶體過氧化氫的方法；該方法包括如下步驟：a.獲得樣 品實驗所需的細(xì)胞；b.熒光標(biāo)記物進(jìn)入到細(xì)胞器；c.通過檢測熒光標(biāo)記物以確定自噬溶酶 體過氧化氫。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光標(biāo)記物，其結(jié)構(gòu)式如下：
其中札，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，各自獨(dú)立的選自氫、鹵素、取代的芳香族集團(tuán)、 取代的雜芳香族基團(tuán)、取代的芳基、取代的雜芳基或式（II)結(jié)構(gòu)的取代基，&，R2，R3，R4， R5，R6，R7，R8，中至少一個為式（III)結(jié)構(gòu)的取代基：
式（III)中Q為含有氮原子的基團(tuán)為連接金屬化合物與Q的連接基團(tuán)； 環(huán)A具有式（IV)、式（V)、式（VI)結(jié)構(gòu)：
其中Rla，R2a，R3a，R4a，各自獨(dú)立的選自氫、鹵素、取代的芳香族集團(tuán)、取代的雜芳香族 基團(tuán)、取代的芳基、取代的雜芳基； 式（IV)中n為1?3的正整數(shù)； Y不存在，或Y為鹵素、-N03、CH3C00-、CC13C00-、CF3C00-、C104-、BF4-、BPh4-、-CN、-N3、 對甲基苯甲酸根、對甲基苯磺酸根、鄰硝基苯酚氧、對硝基苯酚氧、2, 4-二硝基苯酚氧、 3, 5_二硝基苯酌?氧、2, 4, 6_二硝基苯酌?氧、3, 5_二氣苯酌?氧、3, 5_二氣苯酌?氧、3, 5_二-二 氟甲基苯酚或五氟酚氧負(fù)離子； M為過渡金屬和鑭系金屬。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞器，包括溶酶體、吞噬泡、自噬體、自噬溶酶體或它們的 組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶酶體過氧化氫，包括溶酶體內(nèi)以分子、離子形式或其他型 態(tài)存在的H202以及由其他的過氧化物經(jīng)由生物或化學(xué)途徑在溶酶體內(nèi)形成的H202分子、離 子形式或其他型態(tài)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是作為藥物篩選的方法。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是作為檢測試劑用于細(xì)胞實驗、熒光共聚焦實 驗、組織學(xué)實驗。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是制備檢測試劑盒。
【文檔編號】C07F5/00GK104402933SQ201410534274
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月12日
【發(fā)明者】武鵬 申請人:成都鑫諾醫(yī)藥科技有限公司