本發(fā)明涉及一種菌酶協(xié)同發(fā)酵降解飼料抗營養(yǎng)因子的方法，具體的涉及玉米、豆粕為主日糧的抗營養(yǎng)因子降解。

背景技術(shù)：

玉米豆粕麩皮為當(dāng)前主要的飼料原料，而生大豆中含有大量的抗營養(yǎng)因子，比如胰蛋白酶抑制因子、凝集素、抗原蛋白、植酸以及非淀粉多糖。其中主要的抗原蛋白為大球蛋白和β-伴球蛋白。而飼糧中所含的麩皮同樣含有較多的非淀粉多糖。不利于動物，尤其是幼齡動物的消化吸收。

傳統(tǒng)的物理加工方法如加熱、膨化可以破壞大量熱不穩(wěn)定的抗營養(yǎng)因子如凝集素。但是對于抗原蛋白、植酸、非淀粉多糖（如纖維素）的降解并不充分。通過微生物發(fā)酵的手段降解抗營養(yǎng)因子能耗低，降解充分，目前已然成為飼料行業(yè)發(fā)展的趨勢。

然而目前的生物發(fā)酵飼料主要關(guān)注與對豆粕的發(fā)酵，對于復(fù)合飼料的發(fā)酵并不多見。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢桿菌及菌酶混合發(fā)酵的方法。

一組高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢桿菌，包括兩株芽孢桿菌，屬于枯草芽孢桿菌枯草亞種Bacillus subtilis subsp.subtilis ，一株命名為ZJUFA-1，另一株命名為ZJUFA-2，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心( CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期為2016年8月8號，保藏號分別為CGMCC NO：12823，CGMCC NO：12824；用于聯(lián)合降解豆粕抗原蛋白。

一種菌酶混合發(fā)酵降解飼料抗營養(yǎng)因子的方法，將玉米、豆粕、麩皮配成復(fù)合飼料，以總質(zhì)量3~5%添加芽孢桿菌發(fā)酵種子液，按0.5~1%添加非淀粉多糖復(fù)合酶酶液，混合攪拌均勻后，于30~40℃發(fā)酵24小時得到發(fā)酵混合飼料，向發(fā)酵混合飼料中添加5%的乳酸菌種子液，混合均勻后封裝于厭氧發(fā)酵裝置中，發(fā)酵48小時后即可得到成品飼料；

所述的芽孢桿菌發(fā)酵種子液制備步驟如下：

將新鮮培養(yǎng)的ZJUFA-1和ZJUFA-2分別接種入5mLLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4~6小時，使OD₆₀₀達到0.5，按1mL培養(yǎng)后的一級種子液按終質(zhì)量1%~3%加入玉米豆粕浸汁液中放大培養(yǎng)37℃12小時，得到二級種子液，隨后按飼料總質(zhì)量2.5%分別添加ZJUFA-1和ZJUFA-2二級種子液。

所述的玉米豆粕浸汁液制備步驟如下：按質(zhì)量百分比， 配置4%豆粕粉，3%玉米粉，0.8%Na₂HPO₄·12H₂O ，0.4% (NH₄)₂SO₄ , 0.15% NH₄Cl，加入水?dāng)嚢?0min，配制完成后，濾去不溶物質(zhì)，90℃滅菌30min。

所述玉米、豆粕、麩皮質(zhì)量配成為4.5:4.5:1。

所述的非淀粉多糖復(fù)合酶酶液主要包括木聚糖酶，纖維素酶和果膠酶。

所述的乳酸菌種子液制備步驟如下：將新鮮培養(yǎng)的乳酸菌單菌落接種至MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)12小時后，按體積比1%加入豆粕浸汁液中，37℃靜置培養(yǎng)12小時，得到乳酸菌種子液；豆粕浸汁的制備：按質(zhì)量百分比，配置0.5%糖蜜，4%豆粕，2.5%麩皮，0.2% K₂HPO₄， 0.3%NaAc, 0.08% MgSO₄·7H₂O，0.03%MnSO₄，加入吐溫-80 0.5mL/L, 調(diào)pH至6.5，濾去不溶物質(zhì)，90℃滅菌30min。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明所涉及的發(fā)酵菌株ZJUFA-1、ZJUFA-2經(jīng)中國工業(yè)微生物保藏中心（CICC）鑒定，為枯草芽孢桿菌枯草亞種，中國普通微生物菌株保藏中心保藏號分別為CGMCC No. 12823、CGMCC No. 12824，所用乳酸菌為市場采購的糞腸球菌，均符合農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《飼用添加劑品種目錄（2013）》，因此可用于生產(chǎn)推廣。

本發(fā)明提供的復(fù)合菌群發(fā)酵經(jīng)過反復(fù)試驗，飼糧中抗營養(yǎng)因子降解效果明顯，β-伴球蛋白降解率達87%，大球蛋白降解率為76%，酸溶蛋白含量提高6.5倍，中性洗滌纖維含量下降35%，植酸含量下降46%。

本發(fā)明提供的復(fù)合菌群發(fā)酵，乳酸含量達到174.57 mmol/kg，益生菌數(shù)目大于5.0×10⁹ CFU/g飼料，大腸桿菌含量小于1.0×10³ CFU/g，pH降低至5.0，可減少飼料中飼用抗生素的使用。

本發(fā)明提供的復(fù)合菌群飼料干物質(zhì)消化率從59%提高至70%，粗蛋白消化率從78%提高至86%，必需和非必需氨基酸體外消化率分別提高了7.36% 和12.64%，具有發(fā)酵酸香味、誘食效果好，具備良好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是ZJUFA-1菌株的16SrDNA序列進化樹分析圖；

圖2是ZJUFA-1菌株的保守基因gryB序列進化樹分析圖；

圖3是ZJUFA-2菌株的16SrDNA序列進化樹分析圖；

圖4是ZJUFA-2菌株的保守基因gryB序列進化樹分析圖；

圖5為采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的發(fā)酵混合飼料的抗原蛋白電泳圖；

圖6為采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的發(fā)酵混合飼料的乳酸及pH變化圖；

圖7為采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的發(fā)酵混合飼料的微生物數(shù)量變化圖。

具體實施方式

本發(fā)明所述發(fā)酵菌株中的豆粕抗原蛋白降解菌株ZJUFA-1、ZJUFA-2均為江浙滬腌菜中篩選的枯草芽孢桿菌枯草亞種，已于2016年8月8日保藏與中國普通微生物菌種保藏中心，編號分別為：CGMCC No. 12823 和 CGMCC No. 12824。所用乳酸菌采購自市場的糞腸球菌（可采用其他乳酸菌）。

玉米豆粕浸汁液： 4%（w/v）豆粕粉，3%玉米粉，0.8%Na₂HPO₄·12H₂O ，0.4% (NH₄)₂SO₄ , 0.15% NH₄Cl。加入清水?dāng)嚢?0mins，配制完成后，用4層紗布濾去不溶物質(zhì)，90℃滅菌30mins。

豆粕浸汁液（乳酸菌種子液）：0.5%糖蜜，4%豆粕，2.5%麩皮，0.2% K₂HPO4， 0.3%NaAc, 0.08% MgSO₄·7H₂O，0.03%MnSO4， 吐溫-80 0.5mL/L, 調(diào)pH至6.5，用4層紗布濾去不溶物質(zhì)，90℃滅菌30mins。

一種芽孢桿菌發(fā)酵種子液制備方法：

將新鮮培養(yǎng)的ZJUFA-1和ZJUFA-2分別接種入5mLLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4~6小時，使OD₆₀₀達到0.5。按1mL培養(yǎng)后的一級種子液按1%~3%加入玉米豆粕浸汁液中放大培養(yǎng)37℃12小時，得到二級種子液。隨后按飼料總質(zhì)量2.5%分別添加ZJUFA-1和ZJUFA-2二級種子液。

一種非淀粉多糖復(fù)合酶酶液：

復(fù)合酶組成為木聚糖酶，纖維素酶和果膠酶，均購自某酶制劑公司，按說明書配制酶液，按推薦劑量使用（非淀粉多糖復(fù)合酶：木聚糖酶15000U/g, 纖維素酶6000 U/g，果膠酶500U/g）。

一種乳酸菌種子液制備方法：

將新鮮培養(yǎng)的乳酸菌單菌落接種至MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)12小時后，按體積比1%加入豆粕浸汁液中，37℃靜置培養(yǎng)12小時，乳酸菌種子液。

一種發(fā)酵玉米、豆粕、麩皮混合飼料的方法：

將玉米、豆粕、麩皮按一定比例配成復(fù)合飼料，加入20%的水分，使飼料含水率達到30%，以總質(zhì)量3~5%添加芽孢桿菌發(fā)酵種子液，按0.5~1%添加復(fù)合酶酶液，混合攪拌均勻后，于30~40℃發(fā)酵24小時得到發(fā)酵復(fù)合飼料1。向發(fā)酵復(fù)合飼料1中添加5%的乳酸菌種子液，混合均勻后封裝于厭氧發(fā)酵袋中。發(fā)酵48小時后即可使用。

實施例1 菌酶協(xié)同發(fā)酵降解玉米、豆粕、麩皮混合飼料中抗營養(yǎng)因子

按具體實施方式所述生產(chǎn)2噸發(fā)酵玉米、豆粕、麩皮混合飼料，對飼料樣本進行抗營養(yǎng)因子檢測。結(jié)果如表1所述：

由圖5 、表1可知，相較于單菌發(fā)酵，芽孢桿菌混菌發(fā)酵后抗原蛋白的綜合降解效果增強，相比于益生菌發(fā)酵，本發(fā)明加入生物酶之后在保持菌株降解抗原蛋白能力基礎(chǔ)上，可進一步提高飼料中中性洗滌纖維、植酸的降解程度。

按具體實施方式所述生產(chǎn)2噸發(fā)酵玉米、豆粕、麩皮混合飼料，對飼料樣本中乳酸、菌落數(shù)檢測。結(jié)果如圖6、7所示發(fā)酵3天后pH基本穩(wěn)定，乳酸含量逐漸積累。大腸桿菌生長受抑制，飼料中主要菌群以乳酸菌、芽孢桿菌為主。

另經(jīng)測定本發(fā)明提供的復(fù)合菌群飼料干物質(zhì)消化率從59%提高至70%，粗蛋白消化率從78%提高至86%，必需和非必需氨基酸體外消化率分別提高了7.36% 和12.64%。