提取基因組dna的試劑盒和提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)的生物樣品提取領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種提取基因組DNA的試 劑盒和提取方法。
【背景技術(shù)】
[000引 目前常采用CTAB法、PTB法、QIAGEN試劑盒法、高鹽低抑法等方法提取基因組 DNA。CTAB 法采用 CTAB (hexade巧ltrimeth5dammonium bromide,十六烷基S甲基漠化錠）， 它是一種陽離子去污劑，在高離子強(qiáng)度的溶液中，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，產(chǎn)生 沉淀，但卻不能與核酸形成復(fù)合物產(chǎn)生沉淀。通過離屯、獲得含有核酸的上清液，通過加入氯 仿等有機(jī)試劑進(jìn)行抽提，去除蛋白、多糖、酪類等雜質(zhì)后，加入己醇沉淀即可使核酸分離出 來。CTAB法需要用到0-琉基己醇、氯仿、酪等試劑。但酪和氯仿的使用會(huì)對人體有一定 的危害，并污染環(huán)境。且提取大概需要花費(fèi)2-3天時(shí)間。PTB法需要使用邸TA、蛋白酶K、 PTB、酪、氯仿等試劑，其操作步驟異常繁瑣，操作時(shí)間需5-7天，操作過程中會(huì)使用到酪、氯 仿多種有害物質(zhì)。高鹽低抑法：需要使用邸TA、化C1、醋酸鋼、十二烷基硫酸鋼（SDS)、氯 仿、醋酸鐘等試劑。操作步驟與CTAB法類似，但是提取的DNA得率較低且雜質(zhì)較多。試劑 盒法；使用方便但是提取的得率較低，在樣品本身DNA含量低的情況下具有明顯的局限性， 并且成本較高。W上該些提取方法和方法本身的不足在很多文獻(xiàn)中有報(bào)道。
[0003] 在人們的生產(chǎn)、生活中，木材的保護(hù)和合理利用成為人們所關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著時(shí)代 發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，木制材料在生活中的應(yīng)用越來越受到人們的青睞，特別 是一些高檔名貴木材制品也擠身于奢侈品行列，成為人們追求生活品質(zhì)的象征。正是由于 該些珍惜名貴木材與普通木材在價(jià)格上存在巨大的差額，導(dǎo)致一些不法分子將一些容易混 淆和不易區(qū)分的樹種和木材制品當(dāng)做名貴珍惜樹種和木材制品進(jìn)行銷售，極大地?cái)_亂了紅 木市場、仿古木市場、古典家具市場和名貴樂器市場的正常秩序，在經(jīng)濟(jì)上和精神上給消費(fèi) 者帶來了巨大的損失和打擊。而一些禁止砍伐的珍貴樹種也被喬裝成普通木材進(jìn)行運(yùn)輸和 走私，該無疑給林業(yè)檢查和海關(guān)人員的識別工作增加了難度。因此，在木材加工、利用、使用 和貿(mào)易活動(dòng)中，對木材進(jìn)行科學(xué)、快速、準(zhǔn)確地識別和鑒定就顯得尤為重要和迫切。
[0004] 傳統(tǒng)的木材識別方法要求鑒定者有豐富的植物學(xué)知識和木材構(gòu)造方面的專業(yè)知 識。通常W傳統(tǒng)的木材鑒定手段，解剖切片觀察木材的構(gòu)造W及形態(tài)特征從而得出判定結(jié) 果。由于鑒定者對具體形態(tài)特征的主觀感受不一樣，有時(shí)候即使是專業(yè)的人員得出的鑒定 結(jié)果也不完全一致，尤其是形態(tài)特征比較相似的木材品種。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基 因組DNA分析也被運(yùn)用到鑒定木材的方法中。而運(yùn)用基因組DNA分析技術(shù)識別和鑒定木材 的前提是從木材組織中提取到足夠數(shù)量和高質(zhì)量的DNA，W滿足后續(xù)的PCR擴(kuò)增、基因測序 等分子生物學(xué)鑒定方法。
[0005] 現(xiàn)有的提取方法和試劑盒通常只能用于一般的植物基因組DNA，例如葉片、莖等植 物的幼嫩組織。相比鮮嫩且具有分生能力的植物組織而言，從木材組織中提取和擴(kuò)增DNA 要困難很多。主要原因?yàn)閃下幾個(gè)方面；（1)木材組織中存在的DNA數(shù)量較少，且常常降解 成小片段。（2)木材組織中存在有厚壁的管狀分子，導(dǎo)致在礙磨處理該些堅(jiān)硬組織時(shí)會(huì)產(chǎn)生 高溫，該進(jìn)一步損傷DNA分子。（3)木材中存在一些如蛋白質(zhì)、酪類、多糖、單寧和色素等物 質(zhì)，該些物質(zhì)往往會(huì)影響DNA聚合酶的活性，干擾引物與模板結(jié)合，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。（4) 木材受存放環(huán)境地影響，如潮濕環(huán)境下會(huì)造成木材腐朽和真菌污染，導(dǎo)致DNA降低和污染。 目前還沒有針對植物木質(zhì)部基因組DNA的提取試劑盒和提取方法。在木材交易中，木材的 莖葉往往都已經(jīng)摘除。成品家具自然更不會(huì)有莖葉等幼嫩組織，且通常都經(jīng)過熏、蒸、擠壓 等加工。因此現(xiàn)有植物的DNA提取方法并不適合木材和家具的DNA提取。另一方面，木材 和家具交易是一個(gè)快速的交易過程。在木材和家具的進(jìn)出口過程中，也需要在短時(shí)間內(nèi)完 成木材的鑒定。而現(xiàn)有的植物DNA提取方法通常需要至少2天W上，有的甚至要一周的時(shí) 間。因此現(xiàn)有的提取方法不能滿足快速鑒定木材基因組DNA的要求?，F(xiàn)有的提取試劑和方 法也不能提取出微量樣本中DNA，例如采用現(xiàn)有的提取試劑和提取方法提取利用微創(chuàng)方法 采集到的樣本中的DNA，其產(chǎn)物得率很差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了提取基因組DNA的試劑盒，包括 試劑1、試劑2和試劑3,其中所述試劑1包括W下組分；〇. 1% -5 %的十六烷基=甲基漠 化錠（質(zhì)量百分比）、10mM-200mM 的 Tris、10mM-200mM 的邸TA、0. 1% -10% 的 PVP(質(zhì)量 百分比）、0. 1M-5M的化C1、溶劑為去離子水；試劑2包括W下組分；〇. 1M-6. 5M的鹽酸脈、 1% -50%的己醇（體積百分比）、0. 1M-2M的巧樣酸鋼、溶劑為去離子水；試劑3包括W下 組分；0. 1M-8M的鹽酸脈、0. 05M-0. 2M的甘氨酸、溶劑為去離子水。
[0007] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括洗漆液。
[000引進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括洗脫液。
[0009] 進(jìn)一步地，所述的洗漆液包括去蛋白洗漆液和去離子洗漆液。
[0010] 進(jìn)一步地，所述去蛋白洗漆液包括1M-6M的鹽酸脈，lmM-50mM的邸TA '2化'2肥0， 溶劑為去離子水；所述去鹽洗漆液包括20mM-200mM的NaAC ? 3H20,溶劑為去離子水；洗脫 液為去離子水。
[0011] 優(yōu)選地，所述的試劑包括W下組分；3. 5 %的十六烷基S甲基漠化錠、120mM的 Tris、llOmM的邸TA、6%的PVP、3M的化C1、溶劑為去離子水；試劑2包括W下組分；2. 5M的 鹽酸脈、25%的己醇、1M的巧樣酸鋼、溶劑為去離子水；試劑3包括W下組分；4M的鹽酸脈、 0. 1M的甘氨酸、溶劑為去離子水。
[001引本發(fā)明還提供提取基因組DNA的方法，包括W下步驟：
[001引 （1)采樣；
[0014] (2)裂解樣品細(xì)胞：加入65°C預(yù)熱的試劑1和Proteinase K，禍旋振蕩，混合均勻， 65°C水浴0. 5h-過夜；
[0015] (3)沉淀非DNA的雜質(zhì)；將步驟2中的混合物冷卻至室溫，加入試劑2,混合均勻， 冰?。?br>[0016] (4)離屯、步驟3所得混合物，取上清，加入carrier RNA和試劑3,混合均勻后加入 異丙醇，混勻；
[0017] (5)將步驟4所得混合物中的DNA與純化載體結(jié)合，經(jīng)過洗漆液的去蛋白洗漆和去 鹽洗漆，W及洗脫液的洗脫步驟，獲得可用于檢測的樣本基因組DM ;
[0018] 其中，所述的試劑1包括W下組分；〇. 1% -5%的十六烷基S甲基漠化錠（質(zhì)量百 分比）、10mM-200mM 的 Tris、10mM-200mM EDTA、0. 1% -10%的 PVP(質(zhì)量百分比）、0. 1M-5M 的化C1、溶劑為雙蒸去離子水；試劑2包括W下組分；〇. 1M-6. 5M的鹽酸脈、1% -50%的 己醇（體積百分比）、〇. 1M-2M的巧樣酸鋼、溶劑為雙蒸去離子水；試劑3包括W下組分： 0. 1M-8M的鹽酸脈、0. 05M-0. 2M的甘氨酸、溶劑為雙蒸去離子水。
[0019] 進(jìn)一步地，其中步驟4所述的純化載體選自核酸提取純化柱或磁珠。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟2中65 °C水浴時(shí)間為0.化-2h。
[0021] 優(yōu)選地，在步驟3冰浴時(shí)間為lOmin。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是；本發(fā)明所述試劑和方法只需要非常少的樣本用量，就能提 取到需要的DNA。例如利用本發(fā)明所述試劑和方法，能夠提取采樣量僅為0.1 g樣本中的基 因組DNA。因此本發(fā)明可W應(yīng)用于微創(chuàng)的樣品檢測方法，對木材樣品進(jìn)行無損傷取樣?？?對已加工后的實(shí)木成品樣品進(jìn)行提取，例如可用于各種實(shí)木家具、實(shí)木工藝品、實(shí)木古玩等 木材DNA的提取，該即不破壞家具等的材料，又實(shí)現(xiàn)了分子生物學(xué)層面的物種鑒定工作。在 對珍貴物種中的鑒定中，本發(fā)明起到了尤為重要的作用。本發(fā)明對傳統(tǒng)的CTAB基因組提取 方法的裂解液進(jìn)行了改良，提高CTAB的濃度的同時(shí)，增加了配套試劑，提高了裂解液的裂 解能力W及純化后DNA的完整性。由于本發(fā)明所述試劑1的水浴時(shí)間一般為0. 5-化即可 滿足DNA提取要求，因此提取時(shí)間大大縮短。本發(fā)明所用試劑無毒無害，保證操作人員的健 康，避免職業(yè)病，對環(huán)境無污染，便于運(yùn)輸。加入試劑3試劑可W進(jìn)一步增加DNA與純化載 體的結(jié)合能力，降低雜質(zhì)含量、提高產(chǎn)物純度，提純效率更高。本發(fā)明所述方法操作步驟簡 單，能大幅度減少操作時(shí)間、可進(jìn)行規(guī)?；僮?。
【附圖說明】
[0023] 圖1是楠木樣本提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0024] 圖2是不同樣本用量測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0025] 圖3是樣本處理時(shí)間測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0026] 圖4是加入試劑1后水浴與否，W及加入試劑2后冰浴與否的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0027] 圖5是加入Carrier RNA及試劑3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[002引圖6是利用本發(fā)明提取不同種類木材中的基因組DNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0029] 圖7是經(jīng)過不同處理方式得到的木材基因的提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0030] 圖8是木材不同部位的基因提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0031] 圖9是不同生長年限木材的基因提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0032] 圖10是木材不同組織部位的基因提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0033] 圖11是試劑選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0034] 圖12是實(shí)施例13的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0035] 圖13是實(shí)施例14的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0036] 圖14是實(shí)施例15的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 本發(fā)明所述的提取基因組DM的試劑盒包括試劑1、試劑2和試劑3。其中所述試 劑1包括W下組分：
[003引十六烷基S甲基漠化錠0. 1% -5% (質(zhì)量百分比）
[0039] Tris 10mM-200mM
[0040] 邸 TA 10mM-200mM
[00川 PVP 0. 1%-10% (質(zhì)量百分比）
[0042] NaCl 0. 1M-5M
[0043] 溶劑為去離子水
[0044] 試劑2包括W下組分：
[0045] 鹽酸脈 0. 1M-6. 5M
[0046] 己醇1 % -50 % (體積百分比）
[0047] 巧樣酸鋼 0. 1M-2M
[0048] 溶劑為去離子水
[0049] 試劑3包括W下組分：
[0050] 鹽酸脈 0. 1M-8M
[005U 甘氨酸 0. 05M-0. 2M
[0化2] 溶劑為去離子水
[005引提取基因組DNA的試劑包括試劑1、試劑2和試劑3,蛋白酶K、Carrier RNA、異丙 醇、洗漆液和洗脫液。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述去蛋白洗漆液包括1M-6M的鹽酸脈，lmM-50mM的 邸TA ? 2化? 2&0,抑為5. 0-8. 5,溶劑為去離子水。所述去鹽洗漆液包括20mM-200mM的 NaAC ? 3&0,抑為3. 5-7. 5,溶劑為去離子水。洗脫液為去離子水。目前市面上可W購買到 的DNA提取用洗漆液和洗脫液也可用于本發(fā)明。
[0化5] 在另一個(gè)實(shí)施例中，試