具有糖化功能的基因工程酵母及其制法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有糖化功能的基因工程酵母及其制法和應(yīng)用。本發(fā)明還公開了一種編碼葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，為(a)所述的核苷酸序列的編碼SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；或(b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶編碼區(qū)的序列與SEQ ID NO：15所示核苷酸序列具有≥80％相同性。本發(fā)明的基因工程酵母，基因組中整合有該核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶編碼區(qū)的序列，為具有高效糖化功能的釀酒酵母，在不額外添加糖化酶進(jìn)行酒精發(fā)酵時，可獲得高產(chǎn)量的乙醇。CCTCC NO：M201465720141223
【專利說明】
具有糖化功能的基因工程酵母及其制法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及具有糖化功能的基因工程酵母及其制法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙醇是食品、化工等工業(yè)的重要原料和可再生燃料。纖維素乙醇生產(chǎn)技術(shù)目前尚 處在開發(fā)中，未能滿足商業(yè)化的要求。市場上在售的乙醇主要是以玉米和甘蔗為原料進(jìn)行 生產(chǎn)的，原料分別富含淀粉和糖分。在我國，除了玉米，小麥和木薯等富含淀粉的原料也被 用于生產(chǎn)乙醇。改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)，降低淀粉質(zhì)原料轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖嫉募庸こ杀痉浅Ｖ匾?br>[0003]目前，淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇需要經(jīng)過多個環(huán)節(jié)，如：粉碎、液化、糖化、發(fā)酵、蒸餾 等。其中，糖化的過程需要添加糖化酶（即葡萄糖淀粉酶，EC 3.2. 1.3)，把淀粉降解為葡 萄糖。該酶可以從市場上直接購買。生產(chǎn)每噸乙醇需要的糖化酶成本約1〇〇元。如果發(fā)酵 菌種具備葡萄糖淀粉酶功能，那么糖化酶的用量可以減少。鑒于此，為了降低乙醇的生產(chǎn)成 本，有必要開發(fā)具有糖化功能的釀酒酵母。
[0004] 從80年代中期開始，各種來源的葡萄糖淀粉酶被克隆到釀酒酵母中，構(gòu)建具備糖 化功能的酵母菌株。
[0005] 1985年Cetus公司在Science上發(fā)表論文，報道了利用基因工程技術(shù)把來源于泡 盛曲霉（Aspergillus awamori)的葡萄糖淀粉酶克隆到釀酒酵母中的工作，重組菌株能夠 以淀粉為唯一碳源進(jìn)行生長（Science, 1985. 228(4695) :p. 21-6)。除泡盛曲霉來源外，米根 霉（Rhizopus oryzae)和黑曲霉（Aspergillus niger)來源的葡萄糖淀粉酶也常被使用。 為了增加糖化淀粉的能力，α -淀粉酶（EC3. 2. 1. 1)隨后也被克隆到釀酒酵母中，與葡萄糖 淀粉酶協(xié)同糖化淀粉。解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、嗜熱脂肪芽孢桿 菌（Bacillus stearothermophilus)、地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis)、枯草芽胞 桿菌（Bacillus subtilis)、牛鏈球菌（Streptococcus bovis)、德巴利酵母（Debaryomyces occidentalis)和大麥（Hordeum vulgare)等是α -淀粉酶的常用來源。有報道揭示，牛鏈 球菌而非嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的α-淀粉酶與米根霉葡萄糖淀粉酶的共表達(dá)能使重組 菌以生淀粉為原料進(jìn)行糖化和發(fā)酵。這是因?yàn)槭葻嶂狙挎邨U菌來源的α-淀粉酶不具 有淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與米根霉葡萄糖淀粉酶的共表達(dá)只能使重組菌以可溶性淀粉為原料 進(jìn)行糖化和發(fā)酵。此外，脫支酶（E. C. 3. 2. 1. 33普魯蘭酶和異淀粉酶）和麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 也被克隆到釀酒酵母中用于增強(qiáng)淀粉的糖化和發(fā)酵。
[0006] 近期，主要有兩個課題組繼續(xù)從事這方面的工作，日本Akihiko Kondo 教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)致力于利用表面展示技術(shù)構(gòu)建糖化酵母（Enzyme Microb Technol，2012. 50(6-7) :p. 343-7.)，而韓國Suk Bai教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)則致力于利用分泌表 達(dá)技術(shù)構(gòu)建糖化酵母（Biotechnol Lett, 2011. 33(8) :ρ· 1643-8.)。
[0007] 上述研究多是以基礎(chǔ)研究為導(dǎo)向，難以滿足工業(yè)化應(yīng)用的要求。例如：使用的宿主 為實(shí)驗(yàn)室菌株，帶有營養(yǎng)缺陷表型，這使得重組菌不夠強(qiáng)壯，生長速率和發(fā)酵性能低下等問 題；多基于2 μπι質(zhì)粒表達(dá)載體，該質(zhì)粒的好處是多拷貝，缺點(diǎn)是在非選擇壓力條件下，很容 易丟失。
[0008] 因此，本領(lǐng)域尚需研發(fā)可以滿足工業(yè)化應(yīng)用要求的具有高效的糖化功能的釀酒酵 母。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有高效的糖化功能的釀酒酵母。
[0010] 本發(fā)明的第一方面，提供一種編碼葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，所述的核苷酸序 列選自下組：
[0011] (a)所述的核苷酸序列的編碼SEQ ID N0:16所示的氨基酸序列；
[0012] (b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶編碼區(qū)的序列與SEQ ID N0 :15所示核苷 酸序列具有多80%相同性。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述核苷酸序列如SEQ ID N0 :15所示。
[0014] 本發(fā)明的第二方面，提供一種表達(dá)載體，包含第一方面所述的核苷酸序列。
[0015] 本發(fā)明的第三方面，提供一種酵母宿主細(xì)胞，所述的酵母宿主細(xì)胞含有第二方面 所述的表達(dá)載體或者基因組中整合有第一方面所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶編碼區(qū) 的序列。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述酵母宿主細(xì)胞內(nèi)不含抗生素抗性基因。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述酵母宿主細(xì)胞為釀酒酵母，保藏編號為CCTCC M2014657。
[0018] 本發(fā)明的第四方面，提供一種生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的方法，所述方法包括以下步 驟：
[0019] (a)在適合表達(dá)條件下，培養(yǎng)如第三方面所述的酵母宿主細(xì)胞，從而表達(dá)葡萄糖淀 粉酶；
[0020] (b)分離純化出步驟（a)中所表達(dá)的葡萄糖淀粉酶。
[0021] 本發(fā)明的第五方面，提供一種酵母宿主細(xì)胞的制備方法，所述制備方法包括以下 步驟：
[0022] (a)制備三個片段，所述三個片段分別為EN01p-GA-EN01t、delta5' -pUCori-CEN6/ ARS-delta3'-loxP-TEFlp-KanMX-TEFlt-loxP、ADHlp-GA-PDClt ;
[0023] (b)將步驟a)獲得的三個片段連接，得到目的質(zhì)粒pYIE2-2GA-delta ;
[0024] (c)將步驟b)獲得的pYIE2-2GA-delta經(jīng)Notl線性化后，轉(zhuǎn)化釀酒酵母得到轉(zhuǎn)化 子；
[0025] (d)消除步驟c)獲得轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)的菌株中的抗性基因，得到所述重組酵母。
[0026] 本發(fā)明的第六方面，提供第三方面所述的酵母宿主細(xì)胞的用途，用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇。
[0027] 本發(fā)明的第七方面，提供一種生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法采用第三方面所述的酵 母宿主細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵從而生產(chǎn)乙醇。
[0028] 本發(fā)明以釀酒酵母CCTCC M94055為宿主，采用多拷貝整合技術(shù)，把糖化酶即葡萄 糖淀粉酶整合到基因組上，隨后消除抗生素抗性基因，獲得的重組釀酒酵母，具有高效的糖 化功能。
[0029] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅， 在此不再一一累述。
【附圖說明】
[0030] 圖 1 為 pYIE2-2GA_delta 質(zhì)粒圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本申請的發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，以釀酒酵母酵母CCTCC M94055為宿主， 采用多拷貝整合技術(shù)，把糖化酶即葡萄糖淀粉酶整合到基因組上，隨后消除抗生素抗性基 因。意外發(fā)現(xiàn)，獲得了具有高效的糖化功能的釀酒酵母，在不額外添加糖化酶進(jìn)行酒精發(fā)酵 時，可獲得高產(chǎn)量的乙醇。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0032] 本發(fā)明獲得的具有高效的糖化功能的釀酒酵母1522 (Saccharomyces cerevisiae 1522)，于2014年12月23日保藏于位于武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC Μ 2014657。
[0033] 表達(dá)載體
[0034] 本發(fā)明的表達(dá)載體，包含編碼葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，所述的核苷酸序列選 自下組：
[0035] (a)所述的核苷酸序列的編碼SEQ ID Ν0:16所示的氨基酸序列；
[0036] (b)所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶編碼區(qū)的序列與SEQ ID N0 :15所示核苷 酸序列具有多80%相同性。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶編碼區(qū)的序列與SEQ ID N0 : 15所示核苷酸序列具有多85 %相同性，較佳地，具有多90 %相同性，更佳地，具有多95 %相 同性，更佳地，具有多98%相同性，甚至具有多99%相同性。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，，所述核苷酸序列如SEQ ID N0 :15所示。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)為：
[0040] EN01p-GA-EN01t-PDClt-GA-ADHlp-delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-1οχΡ-ΤΕ Flp-KanMX-TEFlt-loxP
[0041] 其中GA為權(quán)利要求1所述的多核苷酸；ENOlp、ADHlp、TEFlp為啟動子；ENOlt、 PDClt、TEFlt為終止子；KanMX為卡那霉素 /G418抗性基因片段；delta5'、delta3'為delta 片段；pUCori-CEN6/ARS為復(fù)制子序列。
[0042] 酵母宿主細(xì)胞
[0043] 本發(fā)明的酵母宿主細(xì)胞，含有上述表達(dá)載體或者基因組中整合有上述核苷酸序列 的葡萄糖淀粉酶編碼區(qū)的序列。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述酵母宿主細(xì)胞內(nèi)整合有上述表達(dá)載體經(jīng)Notl線性化的片 段。
[0045] 本發(fā)明中，所述酵母宿主細(xì)胞內(nèi)不含抗生素抗性基因。
[0046] 本發(fā)明中，所述酵母宿主細(xì)胞為釀酒酵母，保藏編號為CCTCC Μ 2014657。
[0047] 本發(fā)明的酵母宿主細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：
[0048] (a)制備三個片段，所述三個片段分別為EN01p-GA-EN01t、delta5' -pUCori-CEN6/ ARS-delta3'-loxP-TEFlp-KanMX-TEFlt-loxP、ADHlp-GA-PDClt ;
[0049] (b)將步驟a)獲得的三個片段連接，得到目的質(zhì)粒pYIE2-2GA-delta ;
[0050] (c)將步驟b)獲得的pYIE2-2GA-delta經(jīng)Notl線性化后，轉(zhuǎn)化釀酒酵母得到轉(zhuǎn)化 子；
[0051] (d)消除步驟c)獲得轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)的菌株中的抗性基因，得到所述重組酵母。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟c)中采用的釀酒酵母的保藏編號為CCTCC M94055。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，米用以下方法制備 delta5' -pUCori-CEN6/ARS_delta3' -loxP-T EFlp-KanMX-TEFlt-loxP ：
[0054] ⑴用Primer 1和Primer 2為引物對，以pYIE2-XKSl-PPP-delta為模板擴(kuò)增質(zhì) 粒骨架片段，其中，所述質(zhì)粒骨架片段結(jié)構(gòu)為：
[0055] delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEFlp-KanMX-TEFlt-loxP ;
[0056] (ii)采用BamHI和ΚρηΙ雙酶切擴(kuò)增后的質(zhì)粒骨架片段，得到帶有粘性末端的 delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-loxP-TEFlp-KanMX-TEFlt-loxP。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，采用以下方法制備EN01p-GA-EN01t :
[0058] (i) Primer 3 和 Primer 4 為引物對，以 BY4741 基因組為模板，擴(kuò)增 ENOlp ;Primer 5和Primer 6為引物對，以合成的GA編碼序列為模板，擴(kuò)增GA;Primer 7和Primer 8為 引物對，以BY4741基因組DNA為模板，擴(kuò)增ENOlt ;
[0059] (ii)混合步驟i)得到的三個片段并作為模板，以Primer 3和Primer 8為引物對 進(jìn)行 overlap PCR，擴(kuò)增 EN01p-GA-EN01t 片段；
[0060] (iii)采用ΚρηΙ和Ndel雙酶切步驟ii)擴(kuò)增后得到的片段，得到帶有粘性末端的 EN01p-GA-EN01t 片段。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，采用以下方法制備ADHlp-GA-PDClt片段：
[0062] ⑴Primer 9和Primer 10為引物對，以BY4741基因組為模板，擴(kuò)增ADHlp ; Primer 11和Primer 12為引物對，以合成的GA編碼序列為模板，擴(kuò)增GA ;Primerl3和 Primer 14為引物對，以BY4741基因組為模板，擴(kuò)增H)Clt ;
[0063] (ii)混合步驟i)得到的三個片段并作為模板，以Primer 9和Primer 14為引物 對進(jìn)行 overlap PCR，擴(kuò)增 ADHlp-GA-PDClt 片段；
[0064] (iii)采用Ndel和BamHI雙酶切步驟ii)擴(kuò)增后得到的片段，得到帶有粘性末端 的 ADHlp-GA-PDClt 片段。
[0065] 在另一優(yōu)選例中，采用以下方法消除步驟c)獲得轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)的菌株中的抗性基 因：
[0066] (i)向所述轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)獲得的菌株中轉(zhuǎn)入pSH47_hph，使用半乳糖誘導(dǎo)Cre酶表 達(dá)，消去G418抗性；
[0067] (ii)通過傳代培養(yǎng)消去pSH47-hph質(zhì)粒。
[0068] 應(yīng)用
[0069] 本發(fā)明的酵母宿主細(xì)胞，可以用于生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶或用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵是以玉米、甘蔗、小麥、木薯中的一種或兩種以上的組 合物為原料進(jìn)行的發(fā)酵。
[0071] 本發(fā)明提供的生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的方法，包括以下步驟：
[0072] (a)在適合表達(dá)條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的酵母宿主細(xì)胞，從而表達(dá)葡萄糖淀粉酶；
[0073] (b)分離純化出步驟（a)中所表達(dá)的葡萄糖淀粉酶。
[0074] 本發(fā)明提供的生產(chǎn)乙醇的方法，采用本發(fā)明所述的酵母宿主細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵從而生 產(chǎn)乙醇。
[0075] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[0076] 本發(fā)明的有益之處在于：
[0077] (1)本發(fā)明構(gòu)建一種新型的重組酵母。
[0078] (2)本發(fā)明的重組酵母，具有高效的糖化功能，用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇，可以有效降低乙 醇的生產(chǎn)成本。
[0079] (3)發(fā)酵獲得的酵母菌體，可以作為飼料添加劑用于飼養(yǎng)家畜家禽等動物。其中存 在的糖化酶有助于促進(jìn)動物的消化。
[0080] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。
[0081] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0082] 通用方法
[0083] 本發(fā)明中參考以下文獻(xiàn)和儀器實(shí)施下文實(shí)施例相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。
[0084] 1.大腸桿菌培養(yǎng)、感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提、限制性內(nèi)切酶酶切、PCR等 分子生物學(xué)操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（Sambrook等，第二版，1996)。
[0085] 2.酵母的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化等操作，參照《酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南》（Adam等2000)。
[0086] 3.乙醇含量檢測參照使用氣相色譜法（木糖發(fā)酵液中乙醇的氣相色譜法測定釀 酒2005年01期）。
[0087] 4葡萄糖含量測定使用葡萄糖分析儀（山東省科學(xué)院）進(jìn)行。
[0088] 實(shí)施例1
[0089] 構(gòu)建目的質(zhì)粒 pYIE2-2GA_delta
[0090] 按照來源于 Saccharomycopsis fibuligera(AJ311587,見于網(wǎng)頁：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/19032256)的糖化酶序列編碼序列按照釀酒酵母的密碼子優(yōu) 化后，做全基因合成。（以下簡寫為GA)
[0091] 1)用 Primer 1(SEQ ID NO :1)和 Primer 2(SEQ ID NO :2)為弓| 物對，以 pYIE2-XKSl-PPP-delta為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。對所述擴(kuò)增產(chǎn)物用 BamHI和ΚρηΙ進(jìn)行雙酶切，得到片段一。
[0092] 2)Primer 3(SEQ ID Ν0:3)和 Primer 4(SEQ ID Ν0:4)為引物對，以 ΒΥ4741(購 自 EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functional analysis)基因組為模 板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，記為擴(kuò)增產(chǎn)物EN01p;Primer5(SEQIDN0:5)和Primer 6(SEQ ID NO :6)為引物對，以合成的GA編碼序列（SEQ ID NO :15)為模板，擴(kuò)增GA ;Primer 7(SEQ ID N0:7)和Primer 8(SEQ ID N0:8)為引物對，以BY4741基因組DNA為模板，擴(kuò)增 EN01t〇
[0093] 混合3個上述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以Primer 3和Primer 8為引物對，進(jìn)行overlap PCR，擴(kuò)增EN01p-GA-EN01t片段；ΚρηΙ和Ndel雙切備用，得到片段二。
[0094] 3)Primer 9(SEQ ID NO :19)和 Primer 10(SEQ ID NO :10)為引物對，以 BY4741 基因組為模板，擴(kuò)增 ADHlp ;Primer 11 (SEQ ID NO :11)和 Primer 12 (SEQ ID NO :12)為引 物對，以合成的GA編碼序列為模板，擴(kuò)增GA;Primerl3(SEQIDN0:13)和Primerl4(SEQ ID NO :14)為引物對，以BY4741基因組為模板，擴(kuò)增H)Clt。
[0095] 混合3個片段為模板，以Primer 9和Primer 14為引物對，進(jìn)行overlap PCR,擴(kuò) 增ADHlp-GA-PDClt片段；Ndel和BamHI雙切備用，得到片段三。
[0096] 4)上述三步獲得的3個片段（片段一、片段二、片段三），連接得到目的質(zhì)粒 pYIE2-2GA-delta，結(jié)構(gòu)如圖1所示。該質(zhì)粒帶有兩個拷貝的GA片段用于糖化酶的表達(dá)，帶 有delta片段用于整合于釀酒酵母的GA位點(diǎn)。
[0097] 在該質(zhì)粒中，含外源GA位點(diǎn)的構(gòu)建物結(jié)構(gòu)如下：
[0098] EN01p-GA-EN01t-PDClt-GA-ADHlp-delta5'-pUCori-CEN6/ARS-delta3'-1οχΡ-ΤΕ Flp-KanMX-TEFlt-loxP
[0099] 其中GA為權(quán)利要求1所述的多核苷酸；ENOlp、ADHlp、TEFlp為啟動子；ENOlt、 PDClt、TEFlt為終止子；KanMX為卡那霉素 /G418抗性基因片段；delta5'、delta3'為delta 片段；pUCori-CEN6/ARS為復(fù)制子序列。
[0100] 本實(shí)施中所選用的pYIE2-XKSl-PPP-delta質(zhì)粒構(gòu)建過程如下：
[0101] 1. PCR擴(kuò)增整合位點(diǎn)同源臂序列：
[0102] 引物對1/2、7/8分別以BY4742基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到上下游同源臂序列。
[0103] 2. PCR擴(kuò)增大腸桿菌和釀酒酵母復(fù)制子序列：
[0104] 引物對 3/4、5/6 分別以 pSH47(可獲自 EUR0SCARF，EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functional Analysis)為模板，PCR 擴(kuò)增得到 Ecori 和 Scori 序 列。
[0105] 3. 0E-PCR 擴(kuò)增得到 delta-up-EcoriScori-delta-dn 片段。
[0106] 4. PCR 擴(kuò)增得到 1oxP-G418-1oxP 片斷
[0107] 引物對9/10以pUG6(可獲自EUR0SCARF)為模板，擴(kuò)增得到兩端帶有ΙοχΡ的G418 抗性表達(dá)盒。
[0108] 5. PCR 擴(kuò)增得到 ADHlp-XKS Ι-XKSlt 片斷
[0109] 引物對 11/12 以模板（CIBTS0573 基因組 DNA(參見 BMC Biotechnology 2013, 13:110)擴(kuò)增得到XKS1表達(dá)盒。
[0110] 6. PCR 擴(kuò)增得到 TPIlp-TALl-TALlt 片斷
[0111] 引物對13/14以模板（CIBTS0573基因組DNA)擴(kuò)增得到TALI表達(dá)盒。
[0112] 7. PCR 擴(kuò)增得到 PGKlp-RPEl-RPElt 片斷
[0113] 引物對15/16以模板（CIBTS0573基因組DNA)擴(kuò)增得到RPE1表達(dá)盒。
[0114] 8. PCR 擴(kuò)增得到 FBAlp-TKLl-TKLlt 片斷
[0115] 引物對17/18以模板（CIBTS0573基因組DNA)擴(kuò)增得到TKL1表達(dá)盒。
[0116] 9. PCR 擴(kuò)增得到 PDClp-RKIl-RKIlt 片斷
[0117] 引物對19/20以模板（CIBTS0573)擴(kuò)增得到RKI1表達(dá)盒。
[0118] 10.體內(nèi)組裝3-9中得到的7個片斷，得到質(zhì)粒pYIE2-Xksl-PPP-delta
[0119] 上述引物對 1/2、3/4、5/6、7/8、9/10、11/12、13/14、15/16 和 17/18 的序列如表 1 所示。
[0120] 將上述 7 個片斷混合后轉(zhuǎn)化 BY4741，使用 Methods Enzymol. 2012 ;517:203-24 的 方法進(jìn)行組合，獲得正確pYIE2-Xksl-PPP-delta質(zhì)粒。值得注意的是，該質(zhì)粒中XKSUTAL1 等基因表達(dá)框片段，沒有進(jìn)入后續(xù)工作步驟，只有載體骨架序列delta5' -pUCori-CEN6/ARS -delta3' -loxP-TEFlp-KanMX-TEFlt-loxP 進(jìn)入了后續(xù)試驗(yàn)步驟。
[0121] 表1引物序列
[0122]
[0123] 實(shí)施例2
[0124] 重組酵母菌株的構(gòu)建
[0125] pYIE2-2GA-delt經(jīng)過Notl線性化后，回收目的片段。采用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化方法，用 該回收的片段對酵母CCTCC M94055進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化，從而獲得帶有pYIE2-2GA-delt的酵母 菌株轉(zhuǎn)化子。對于轉(zhuǎn)化子菌落經(jīng)PCR和測序驗(yàn)證為所需。
[0126] 按常規(guī)文獻(xiàn)（BMC Biotechnology 2013, 13:110)中所述方法，向上述轉(zhuǎn)化子培養(yǎng) 獲得菌株中轉(zhuǎn)入pSH47_hph(BMC Biotechnology 2013, 13:110)，使用半乳糖誘導(dǎo)Cre酶表 達(dá)，消去G418抗性，而后通過傳代培養(yǎng)消去pSH47-hph質(zhì)粒，最終獲得沒有抗性的菌株，保 藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢市武昌珞珈山），保藏編號為CCTCC Μ 2014657。
[0127] 實(shí)施例3
[0128] 各菌株的試管發(fā)酵
[0129] 以木薯干做粉碎處理，過篩60目，按照20g/l培養(yǎng)基的稱取，作為碳源進(jìn)行乙醇發(fā) 酵。培養(yǎng)基中同時需加入YP(酵母粉l〇g/l，蛋白胨20g/l)作為氮源。具體實(shí)驗(yàn)操作，無特 別說明之處參照：玉米生料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究，食品與發(fā)酵工業(yè)，2008年02期
[0130] 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：
[0131] 第一組：木薯干粉碎樣品，滅菌，加入YP
[0132] 第二組：木薯干粉碎樣品，按照20g/l培養(yǎng)基的稱取，淀粉酶處理，滅菌，加入YP。
[0133] 第三組：木薯干粉碎樣品，按照20g/l培養(yǎng)基的稱取，淀粉酶處理，糖化酶處理，滅 菌，加入YP。
[0134] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0135] (1)取平板上的菌落接于YPD20試管中培養(yǎng)24h，30°C，220rpm ;
[0136] (2)試管中菌液稀釋20倍，測定0D600,按照0. 5g/l的接種量接于上述3種培養(yǎng) 基中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，試管裝液量5ml，30°C，250rpm。
[0137] (3)培養(yǎng)28h，取樣測定乙醇濃度和葡萄糖。
[0138] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。
[0139] 表2各菌株在木薯干樣品中厭氧試管發(fā)酵數(shù)據(jù)
[0142] 結(jié)果表明：
[0143] 1在木薯干粉碎樣品實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明獲得的菌株和初始菌株相比，實(shí)現(xiàn)乙醇產(chǎn)量從 無到有。
[0144] 2在淀粉酶處理的樣品實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明獲得的菌株和初始菌株相比，產(chǎn)量得到較大 提升。
[0145] 3在淀粉酶+糖化酶同時處理的樣品實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明獲得的菌株和初始菌株相比， 產(chǎn)量得到較大提升。
[0146] 實(shí)施例4
[0147] 菌株進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵。
[0148] 參照釀酒科技2005年第1期安琪超級釀酒干酵母在酒精濃醪發(fā)酵中的應(yīng)用，以玉 米粉為原料進(jìn)行酒精發(fā)酵。發(fā)酵前分別添加或者不添加糖化酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0149] 表3各菌株酒精產(chǎn)量
[0150]
[0151] 結(jié)果顯示，在添加糖化酶時，各菌株產(chǎn)量基本相同。在不添加糖化酶時，本發(fā)明獲 得的菌株廣量大幅提尚。
[0152] 已報道的具有糖化酶活性的酵母，用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇時，乙醇產(chǎn)量為約3%。近期美 國Mascoma公司通過在釀酒酵母中表達(dá)異源葡萄糖淀粉酶，成功開發(fā)了糖化酵母。該酵母 用于燃料乙醇的生產(chǎn)，可以減少約1/3糖化酶的用量，為乙醇生產(chǎn)商節(jié)省了成本。Mascoma 公司與Lallemand公司合作，成功地在市場上推廣了該糖化酵母，商品名"TransFermfr "。 但是Mascoma公司開發(fā)的這種糖化酵母，乙醇產(chǎn)量提高到至多為4%。
[0153] 此外，在不添加糖化酶進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵時，采用優(yōu)化前GA獲得的重組酵母與本發(fā) 明采用優(yōu)化后的GA獲得的重組酵母相比，產(chǎn)量僅為其約1/4。
[0154] 可見，本發(fā)明采用優(yōu)化后的GA獲得的重組酵母，可在不添加糖化酶進(jìn)行發(fā)酵時， 大幅提尚乙醇的廣量。
[0155] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種編碼葡萄糖淀粉酶的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列選自下組： (a) 所述的核苷酸序列的編碼SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列； (b) 所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶編碼區(qū)的序列與SEQ ID NO :15所示核苷酸序 列具有多80%相同性。2. 如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID N0:15所 不。3. -種表達(dá)載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。4. 一種酵母宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的酵母宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求3所述的表達(dá) 載體或者基因組中整合有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列的葡萄糖淀粉酶編碼區(qū)的序列。5. 如權(quán)利要求4所述的酵母宿主細(xì)胞，其特征在于，所述酵母宿主細(xì)胞內(nèi)不含抗生素 抗性基因。6. 如權(quán)利要求4所述的酵母宿主細(xì)胞，其特征在于，所述酵母宿主細(xì)胞為釀酒酵母，保 藏編號為 CCTCC Μ 2014657。7. -種生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (a) 在適合表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的酵母宿主細(xì)胞，從而表達(dá)葡萄糖淀粉 酶； (b) 分離純化出步驟（a)中所表達(dá)的葡萄糖淀粉酶。8. -種酵母宿主細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟： (a) 制備三個片段，所述三個片段分別為EN01p-GA-EN01t、delta5' -pUCori-CEN6/ARS -delta3'-loxP-TEFlp-KanMX-TEFlt-loxP、ADHlp-GA-PDClt ; (b) 將步驟a)獲得的三個片段連接，得到目的質(zhì)粒pYIE2-2GA-delta; (c) 將步驟b)獲得的pYIE2-2GA-delta經(jīng)Notl線性化后，轉(zhuǎn)化釀酒酵母得到轉(zhuǎn)化子； (d) 消除步驟c)獲得轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)的菌株中的抗性基因，得到所述重組酵母。9. 如權(quán)利要求4所述的酵母宿主細(xì)胞的用途，其特征在于，用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇。10. -種生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，所述方法采用權(quán)利要求4所述的酵母宿主細(xì)胞 進(jìn)行發(fā)酵從而生產(chǎn)乙醇。
【文檔編號】C12N1/19GK105985969SQ201510083082
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月15日
【發(fā)明人】楊晟
【申請人】安琪酵母股份有限公司