本發(fā)明涉及一種檢測(cè)粘度的熒光探針及其制備和利用光譜測(cè)試、細(xì)胞成像等方法檢測(cè)溶液和細(xì)胞粘度，屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域具有不同的粘度，同時(shí)，細(xì)胞粘度是衡量細(xì)胞粘彈特性的一個(gè)重要參量。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)粘度值發(fā)生異常變化時(shí)，會(huì)影響膜結(jié)合蛋白活性、抑制胰島素合成等，導(dǎo)致產(chǎn)生相關(guān)疾病。傳統(tǒng)檢測(cè)粘度的方法有：毛細(xì)管粘度計(jì)、落球粘度計(jì)、旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)等。但是傳統(tǒng)粘度計(jì)容易造成樣品污染，造成較大測(cè)量誤差，并且，只能檢測(cè)血漿粘度，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞或組織樣本中粘度的檢測(cè)。

相對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法，熒光光譜法具有操作簡單、響應(yīng)迅速、空間分辨率高等特點(diǎn)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞、組織中的實(shí)時(shí)監(jiān)控，在生物領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。另一方面，本專利采用的是雙光子成像技術(shù)，較單光子成像技術(shù)具有更小的光毒性和漂白性，能夠減小生物樣品的背景干擾，得到更好的立體成像效果。目前報(bào)道的粘度熒光探針多是單光子激發(fā)，也報(bào)道了一部分利用雙光子激發(fā)的粘度熒光探針。但是，利用染料的上轉(zhuǎn)換成像性質(zhì)檢測(cè)粘度的探針，在國內(nèi)外期刊和專利上都未有報(bào)道。因此，研發(fā)出具有上轉(zhuǎn)換性質(zhì)的染料，并用于溶液粘度的檢測(cè)，可以發(fā)展促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)粘度檢測(cè)的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前有機(jī)小分子熒光探針在細(xì)胞粘度的檢測(cè)中存在的問題，本發(fā)明通過分子設(shè)計(jì)，合成出具有上轉(zhuǎn)換性質(zhì)可利用雙光子熒光成像的測(cè)試粘度的熒光探針。

本發(fā)明還提供了一種上述熒光探針的簡便制備方法和在溶液和細(xì)胞粘度傳感檢測(cè)中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種測(cè)定細(xì)胞粘度的熒光探針，具有如下式（?。┧镜慕Y(jié)構(gòu)：

式（1）。

一種上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

（1）以環(huán)戊酮和4-二甲氨基苯丙烯醛為原料，在堿存在下，于有機(jī)溶劑中發(fā)生反應(yīng)，生成紅色沉淀，過濾得沉淀，即為粗產(chǎn)品，反應(yīng)式為：

；

（2）粗產(chǎn)品重結(jié)晶得如式（i）所示的熒光探針（bncpo）純品。

上述制備方法中，環(huán)戊酮與4-二甲氨基苯丙烯醛的摩爾比為1:2所述堿為naoh，有機(jī)溶劑為乙醇；反應(yīng)溫度為室溫；反應(yīng)以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)；反應(yīng)終點(diǎn)通過薄層層析（tlc）檢測(cè)4-二甲氨基苯丙烯醛；粗產(chǎn)品使用無水乙醇重結(jié)晶。

本發(fā)明所述的熒光探針用于水環(huán)境和生物體系測(cè)定粘度的應(yīng)用。所述熒光探針用于水環(huán)境和生物體系的粘度的傳感檢測(cè)，所述傳感檢測(cè)包含熒光檢測(cè)、細(xì)胞成像檢測(cè)。單光子熒光測(cè)定的激發(fā)波長為488nm，雙光子熒光測(cè)定的激發(fā)波長為860nm，熒光峰為雙峰，峰值分別為540nm和620nm。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：熒光探針的合成方法簡單；利用探針的上轉(zhuǎn)換性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)雙光子熒光成像；通過上轉(zhuǎn)換熒光光譜檢測(cè)實(shí)現(xiàn)溶液粘度檢測(cè)，簡便、快捷。因此，本發(fā)明是一種簡單，快速，靈敏的細(xì)胞粘度檢測(cè)試劑，且對(duì)細(xì)胞毒性低，在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為探針bncpo的核磁氫譜圖；

圖2為探針bncpo在不同的粘度的溶液中的單光子熒光發(fā)射圖譜；

圖3為探針bncpo在不同的甘油-水比例的溶液中的上轉(zhuǎn)換熒光發(fā)射圖譜；

圖4為hela細(xì)胞被探針bncpo、莫能菌素刺激30min的單光子熒光成像圖和雙光子熒光成像圖；

圖5為hela細(xì)胞被探針bncpo、莫能菌素刺激60min的單光子熒光成像圖和雙光子熒光成像圖；

圖6為探針bncpo對(duì)hela細(xì)胞的毒性測(cè)試。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1熒光探針bncpo的合成。

將環(huán)戊酮1mmol溶解在15ml無水乙醇中，加入少量固體naoh，室溫下攪拌反應(yīng)液至naoh完全溶解。然后，將4-二甲氨基苯丙烯醛2mmol加入上述反應(yīng)器中，在氮?dú)夥諊率覝財(cái)嚢瑁瑃lc檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)過程中，逐漸析出紅色沉淀，抽濾，得到粗產(chǎn)品。用無水乙醇重結(jié)晶一次，得到紅色探針bncpo，產(chǎn)率為81%。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ=7.41(d,j=8.8hz,4h),7.23-7.26(m,2h),6.90(d,j=15.6hz,2h),6.81-6.77(m,2h),6.75-6.69(m,4h),3.02(s,12h),2.87(s,4h).hrms:m/z[m+h]⁺calcdfor[c27h31n2o]⁺399.2436,found399.2428。

實(shí)施例2熒光探針bncpo熒光強(qiáng)度隨粘度的變化。

取實(shí)施例1制備的探針bncpo溶于dmso中，制成1mm的儲(chǔ)備液。從儲(chǔ)備液中取出30μl加入到5ml的離心管當(dāng)中，用不同比例（0，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%）的甘油水溶液（ph=7.2）稀釋至3ml，測(cè)量其熒光性質(zhì)。單光子熒光光譜如圖2所示，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。由圖2可見，隨著溶液粘度的增大，熒光強(qiáng)度增大。上轉(zhuǎn)換熒光光譜如圖3所示，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。由圖3可見，隨著溶液粘度的增大，熒光強(qiáng)度逐漸增大，且得到的最大發(fā)射波長620nm處熒光更強(qiáng)。

實(shí)施例3熒光探針bncpo對(duì)hela細(xì)胞熒光成像測(cè)定粘度。

將本發(fā)明熒光探針bncpo應(yīng)用于hela細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞粘度進(jìn)行熒光成像，具體操作步驟如下：

ctr組為空白實(shí)驗(yàn)，既在37℃下，hela細(xì)胞孵育30min拍照，結(jié)果如圖4a-d所示。在37℃條件下，將hela細(xì)胞在加入10.0μm的探針bncpo的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)30min，pbs緩沖溶液洗滌三次后，置于共聚焦熒光顯微鏡下分別進(jìn)行單光子（λex=488nm）熒光成像和雙光子（λex=860nm）熒光成像，結(jié)果如圖4e-h所示。對(duì)比實(shí)驗(yàn)是將10.0μm莫能菌素加入育有hela細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃下培養(yǎng)30min，再用10.0μm熒光探針bncpo的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)30min，pbs緩沖溶液洗滌三次后，置于共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行單光子（λex=488nm）熒光成像和雙光子（λex=860nm）熒光成像，結(jié)果如圖4i-l所示。

重復(fù)上述步驟，不同之處在于，各培養(yǎng)時(shí)間均為60min，得圖5。

如圖4-5所示，a-d顯示hela細(xì)胞自身無熒光；e-h的熒光表示探針bncpo滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，在單雙光子激發(fā)下都呈現(xiàn)綠色熒光；加入莫能菌素刺激細(xì)胞，i-l顯示得到更強(qiáng)的熒光，說明細(xì)胞粘度增大，探針發(fā)光效果增強(qiáng)。

實(shí)施例4熒光探針bncpo對(duì)細(xì)胞的毒性。

利用mtt實(shí)驗(yàn)檢測(cè)探針毒性。在37℃條件下，ctr組為孵育24h的hela細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為：用不同濃度的探針bncpo（5.0,10.0,20.0μm）孵育hela細(xì)胞24h。測(cè)量540nm處熒光強(qiáng)度，以熒光探針濃度為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，得圖6。結(jié)果顯示，探針濃度達(dá)到20.0μm時(shí)，24小時(shí)之后的細(xì)胞存活率仍能達(dá)到90%，說明探針bncpo基本無毒性。