一種熒光探針gh及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及熒光探針領(lǐng)域，具體涉及一種可用于選擇性檢測堿性磷酸酶的熒光探 針。在細(xì)胞內(nèi)常見的小分子5'磷酸核糖鳥苷（簡稱GMP)上引入熒光團(tuán)2'2羥苯基苯并噻 唑（HBT)，與堿性磷酸酶作用后，利用反應(yīng)物與產(chǎn)物的熒光差別實(shí)現(xiàn)選擇性地檢測活細(xì)胞中 的堿性磷酸酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 堿性磷酸酶（ALP，ALKP，ALPase，Alk Phos) (EC 3. 1. 3. 1)是廣泛分布于人體各臟 器器官中，其中以肝臟為最多，其次為腎臟，骨骼、腸、和胎盤等組織。ALP能介導(dǎo)蛋白質(zhì)，核 酸，及生物堿類等生物大分子的去磷酸化。該去磷酸化作用與激酶的磷酸化作用密切相關(guān)， 是生物體內(nèi)物質(zhì)代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動中必要的調(diào)節(jié)過程。目前公認(rèn)的堿性 磷酸酶偏高與肝臟疾病，肝腸循環(huán)，骨骼疾病密切相關(guān)。人血清的堿性磷酸酶廣泛用于疾病 的指示，當(dāng)ALP產(chǎn)生過多或排泄受阻時(shí)，均可使血中ALP水平發(fā)生變化。但是其水平調(diào)控的 內(nèi)在機(jī)制并不清楚。因此，開發(fā)能夠?qū)崟r(shí)檢測細(xì)胞中堿性磷酸酶的探針具有重要意義。
[0003] 熒光探針是有效檢測生命體內(nèi)堿性磷酸酶的手段之一，相比吸光度法具有檢測靈 敏的優(yōu)勢。一個(gè)具有應(yīng)用前景的熒光探針應(yīng)具有作用前后熒光變化明顯、對目標(biāo)分子響應(yīng) 快、選擇性好、合成簡單等優(yōu)點(diǎn)。目前應(yīng)用于檢測堿性磷酸酶的方法主要集中于血清堿性磷 酸酶水平的檢測，檢測細(xì)胞中堿性磷酸酶的重要性并未受到太多重視。檢測方法最廣泛應(yīng) 用的還是405nm下檢測pnpp (磷酸對硝基酚）的去磷酸化產(chǎn)物的吸收光譜，檢測堿性磷酸 酶的熒光探針雖然有一些新的發(fā)展，但是選擇性好的熒光探針仍寥寥無幾。尤其堿性磷酸 酶，酸性磷酸酶，磷酸二酯酶，腺苷酸環(huán)化酶對于去磷酸化的作用有很多底物交叉現(xiàn)象，開 發(fā)對其有選擇性的探針具有很大挑戰(zhàn)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明就是針對上述問題，提供了一種可用于選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的熒 光探針，此探針可以在生理?xiàng)l件下選擇性地與堿性磷酸酶作用，作用后熒光顯著增強(qiáng)。
[0005] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：采用2' 2羥苯基苯并噻唑（HBT)作為熒光母體，在體 內(nèi)普遍存在的小分子5'磷酸核糖鳥苷（簡稱GMP)上引入HBT，利用反應(yīng)物與產(chǎn)物的熒光差 別實(shí)現(xiàn)選擇性地檢測堿性磷酸酶，尤其是可以應(yīng)用于檢測活細(xì)胞中的堿性磷酸酶。合成的 探針化合物的結(jié)構(gòu)用代號GH表示。
[0006] 所述的熒光探針GH的結(jié)構(gòu)如結(jié)構(gòu)式I所示。
[0007]
[0008] 所述的熒光探針的制備方法為：以2' 2羥苯基苯并噻唑（HBT)作為熒光母體，在 體內(nèi)普遍存在的小分子5'磷酸核糖鳥苷（簡稱GMP)上引入HBT ;具體制備步驟如下，
[0009] 1)三氯氧磷與HBT于溶劑中攪拌反應(yīng)后，真空下70°C加熱蒸干；
[0010] 2)步驟1)中得到的產(chǎn)物冷卻后，加入溶劑，攪拌后，加入 2' 3' -〇-isopropygyanosine，室溫下攪拌反應(yīng)10h后，真空下70°C加熱蒸干；
[0011] 3)向步驟2)中得到的產(chǎn)物中加入蒸餾水，攪拌lh后抽濾出固體，甲醇洗滌三次所 得固體，紅外烘干；
[0012] 4)取步驟3)所得產(chǎn)物溶于醋酸和水中，冷凝回流，之后與正丁醇80°C下共沸旋 干，甲醇洗滌產(chǎn)物三次，得到最終產(chǎn)物GH。
[0013] 步驟1)中所述的HBT與三氯氧磷的加入量為1 :3-10 ;步驟2)中 2' 3' -〇-isopropygy anosine的加入量為第一步中HBT加入量的1. 2-1. 5倍；步驟4)中 加入的醋酸和水的量為4:1，冷凝回流的溫度為KKTC，時(shí)間為2h。
[0014] 步驟1)和步驟2)中，所述的所用的溶劑為無水吡啶；步驟1)-4)中所述的攪拌 方式為磁力攪拌。
[0015] 所述的熒光探針可以用于堿性磷酸酶的定性或定量檢測；所述的熒光探針和堿性 磷酸酶的作用模型符合雙位點(diǎn)酶動力學(xué)。
[0016] 所述的熒光探針應(yīng)用于檢測堿性磷酸酶時(shí)，其是生成具有結(jié)構(gòu)II的化合物，從而 導(dǎo)致熒光變化，結(jié)構(gòu)II的名稱為2' 2羥苯基苯并噻唑（HBT)。
[0017]
[0018] 所述的熒光探針在定量檢測堿性磷酸酶中，與堿性磷酸酶作用后，512nm處檢測得 的熒光強(qiáng)度正比于堿性磷酸酶的活性。
[0019] 所述的熒光探針可用于細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的檢測，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的熒光 成像。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：該化合物在堿性磷酸酶存在下熒光發(fā)生顯著改變，可用于高 選擇性、高靈敏性地檢測堿性磷酸酶。尤其是，該化合物可用于細(xì)胞內(nèi)中的堿性磷酸酶檢 測，這對于深入研究堿性磷酸酶在生物體內(nèi)生理和病理過程的動力學(xué)機(jī)理具有重要意義。
【附圖說明】
[0021] 圖1實(shí)施例1中本發(fā)明提供的熒光探針GH的合成路線圖；
[0022] 圖2本發(fā)明提供的熒光探針GH檢測堿性磷酸酶的原理示意圖；
[0023] 圖 3 本發(fā)明提供的探針 GH 的1H NMR(a)，13C NMR(b)，32P NMR(c)譜圖；
[0024] 圖4實(shí)施例2中熒光探針GH與熒光團(tuán)HBT水溶液的紫外可見吸收光譜（a)、熒光 激發(fā)光譜（b)、發(fā)射光譜（c);
[0025] 圖5實(shí)施例3中熒光探針GH對堿性磷酸酶的選擇性示意圖；
[0026] 圖6實(shí)施例4中熒光探針GH對不同濃度的ALP響應(yīng)的動力學(xué)示意圖（a)及反應(yīng) 速率與酶濃度的線性關(guān)系（b);
[0027] 圖7實(shí)施例5中突光探針GH與堿性磷酸酶反應(yīng)速率的的動力學(xué)示意圖；
[0028] 圖8實(shí)施例6中熒光探針GH在堿性磷酸酶被抑制作用下示意圖。
[0029] 圖9實(shí)施例7中熒光探針GH在Hela細(xì)胞中成像示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實(shí)施例。
[0031] 實(shí)施例1 (探針的合成）：
[0032] 如圖1所示，GH的合成：50mL兩口燒瓶真空/氮?dú)庵脫Q三次，加入20mL的 干燥吡啶和2mL的干燥三氯氧磷，緩慢加入HBTl.Slg，室溫下攪拌lh。lh后，真空 下70°C加熱蒸干，得到淺綠色固體。停止加熱待冷卻后，重新連接真空/氮?dú)庵脫Q三 次，再次加入批陡20mL，使?jié)櫺?，使淺綠色沉淀全部溶解，加入2. 58g2' 3' -0-isopropy guanosine(2'，3' -0-異亞丙基鳥苷），攪拌，室溫反應(yīng)10h。10h后真空下70°C加熱旋 干。加入20mL蒸餾水，攪拌lh，抽濾，紅外烘干，得到固體2.05g。將所得固體經(jīng)甲醇 洗三次（每次 5〇mL)得化合物 2' 3' -〇-isopropyguanosine 5'（HBT-phosphate)(白 色固體）。取該化合物500mg，溶于4.8mL醋酸和1.2mL水中，KKTC冷凝回流2h。反 應(yīng)結(jié)束后，與10mL正丁醇80°C共沸真空旋干。用甲醇洗三次，每次20mL。最終得到 目標(biāo)化合物 GH(白色固體）。4 NMR(400MHz, DimethylsuLfoxide_d6) δ (ppm) : δ = 10. 66 (s, 1Η), 8. 39 (d, 1H, J = 7. 64Hz), 8. 25 (s, 1H), 8. 05 (t, 2H), 7. 91 (s, 1H), 7. 75 ( d, 1H, J = 8. 2Hz), 7. 52(d, 1H, J = 7. 44Hz), 7. 43 (t, 1H, J = 6. 6Hz), 7. 40 (t, 1H, J = 7. 0Hz), 7. 20(t, 1H, J = 7. 52Hz), 6. 6 (s, 2H), 5. 72 (d, 1H, J = 6. 0Hz), 4. 53 (t, 1H, J = 5. 24Hz), 4. 0-4. 2 (m, 4H). 13C NMR (DimethylsuLfoxide-d6, 100MHz) δ (ppm) : 162. 92, 156. 87, 154. 87, 154. 61, 154. 32, 152. 08, 151. 64, 136. 15, 132. 03, 128. 98, 126. 58, 125. 31, 123. 65, 123. 25, 122. 88, 122. 21, 120. 50, 11