本申請涉及并要求2014年4月22日提交的、名稱為“檢測癌癥的方法和生物標記物”、申請?zhí)枮镻CT/CN2014/075946的PCT申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用在此并入。

發(fā)明領(lǐng)域

本申請總體上涉及分子和細胞生物學(xué)領(lǐng)域以及癌癥的檢測試劑。

發(fā)明背景

癌癥是涉及細胞失控生長的一大類疾病。在癌癥中，細胞失控地分裂和生長，形成惡性腫瘤，其可能侵入身體的鄰近部分。癌細胞還可以通過淋巴系統(tǒng)或血流擴散到身體的遠距離部分。已知有超過200種不同的癌癥影響著人類。

能夠通過多種方式檢測癌癥，包括存在某些體征和癥狀、篩查測試或醫(yī)學(xué)成像。大部分癌癥最初被識別是由于出現(xiàn)了體征或癥狀，或者是通過篩查識別的。然而，這些方法通常不會帶來確定的診斷，其需要病理學(xué)家對組織樣品進行檢查。病理學(xué)檢查通常耗時，并且具有侵入性。因此，對開發(fā)檢測癌癥的新方法具有持續(xù)的需求。

ERM蛋白家族包括埃茲蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)和膜突蛋白(moesin)。ERM蛋白主要在細胞質(zhì)中表達，并且集中在富含肌動蛋白的細胞-表面結(jié)構(gòu)中。ERM蛋白充當著細胞質(zhì)膜與基于肌動蛋白的細胞骨架之間的結(jié)構(gòu)連接體。ERM蛋白在種間和分子間具有高度的同源性。ERM蛋白通常具有三個結(jié)構(gòu)域：稱為FERM結(jié)構(gòu)域(條帶4.1、埃茲蛋白、根蛋白和膜突蛋白同源結(jié)構(gòu)域)的N-末端結(jié)構(gòu)域(因為其與條帶4.1蛋白具有同源性)、中心螺旋結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域。C-末端結(jié)構(gòu)域與F-肌動蛋白結(jié)合，而N-末端結(jié)構(gòu)域負責與細胞質(zhì)膜中的粘附分子結(jié)合(Louvet-Vallee(2000))。一些證據(jù)表明，ERM蛋白的NH₂-和COOH-末端結(jié)構(gòu)域在胞質(zhì)中細胞內(nèi)和/或細胞間結(jié)合，這分別抑制其與整合的膜蛋白和肌動蛋白絲的結(jié)合能力(Ken Hayashi等，J.Cell Sci.112:1149-1158(1999))。

膜突蛋白位于對于細胞間的識別和發(fā)送信號以及對于細胞運動具有重要作用的絲狀偽足和其他膜突起中(參見Louvet-Vallee,Biol.Cell 92:305-16(2000))。人膜突蛋白含有577個氨基酸并且通常由三個結(jié)構(gòu)域組成：N-末端FERM結(jié)構(gòu)域、中心螺旋結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域。而且，人膜突蛋白與其他物種的膜突蛋白(如小鼠和牛的膜突蛋白)具有高度的序列同源性(Sato等，Cell Sci.J.103:131-143(1992))。

發(fā)明簡述

本申請的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，膜突蛋白C-末端區(qū)段(而非全長膜突蛋白)的水平增加與癌癥的存在或出現(xiàn)相關(guān)。因此，本申請?zhí)峁┝嗽u估癌癥的存在或出現(xiàn)的方法、用于評估癌癥的存在或出現(xiàn)的生物標記物和試劑盒、以及此類生物標記物和試劑盒的用途。本申請還提供了治療癌癥的方法。

在一個方面，本申請?zhí)峁┝嗽趯ο笾性u估癌癥的存在或出現(xiàn)的方法，所述方法包括獲取對象的生物樣品，檢測所述生物樣品中膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平，其中在所述對象的生物樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平提示所述對象出現(xiàn)癌癥或出現(xiàn)癌癥的可能性增加。

在一些實施方式中，在評估癌癥的存在或出現(xiàn)的方法中使用的C-末端區(qū)段由膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基組成。在某些實施方式中，膜突蛋白是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的人膜突蛋白。在一些實施方式中，C-末端區(qū)段包含來自人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基之間區(qū)域的至少20個連續(xù)的氨基酸。在一些實施方式中，C-末端區(qū)段包含來自人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基之間區(qū)域的至少50個連續(xù)的氨基酸。在一些實施方式中，C-末端區(qū)段包含人膜突蛋白的第471-487位、第488-501位或第502-577位氨基酸殘基。

在一些實施方式中，通過將樣品與同膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合的試劑接觸來檢測在生物樣品中的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平。在一些優(yōu)選的實施方式中，試劑是與膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合的抗體或其抗體片段。在一些實施方式中，抗體是單克隆抗體。

在一些實施方式中，將在對象生物樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平與從參照樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的參照水平進行比較。在一些實施方式中，與膜突蛋白C-末端區(qū)段的參照水平相比，在所述生物樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段具有更高水平提示所述對象出現(xiàn)癌癥或出現(xiàn)癌癥的可能性增加。在生物樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平是膜突蛋白C-末端區(qū)段參照水平的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍。在一些實施方式中，在生物樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平優(yōu)選是膜突蛋白C-末端區(qū)段參照水平的至少2倍。在一些實施方式中，在生物樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平是膜突蛋白C-末端區(qū)段參照水平的至少5倍。在一些實施方式中，參照樣品來自無腫瘤對象，其是不具有臨床可檢測腫瘤的對象。

在一些實施方式中，生物樣品選自下組：全血、血清和血漿。在一些實施方式中，生物樣品是尿液或唾液。

在一些實施方式中，癌癥選自下組：急性淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨肉瘤、腦干膠質(zhì)瘤、腦癌、小腦星形細胞瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、乳腺癌、支氣管腺瘤、伯基特氏淋巴瘤、類癌瘤、胃腸類癌瘤、宮頸癌、慢性支氣管炎、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性阻塞性肺病、結(jié)腸癌、皮膚T-細胞淋巴瘤、肺氣腫、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、尤因氏肉瘤、顱外生殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、肝外膽管癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟癌、肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、眼內(nèi)黑色素瘤、胰島細胞癌、卡波西氏肉瘤、腎癌、喉癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、漿細胞瘤、胸膜肺母細胞瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、皮膚癌、鱗狀細胞癌、胃癌、咽喉癌、甲狀腺癌、子宮癌、陰道癌、外陰癌。

在另一個方面，本申請?zhí)峁┝擞糜谠u估癌癥的存在或出現(xiàn)的生物標記物，所述生物標記物基本上由膜突蛋白C-末端區(qū)段組成。在一些實施方式中，膜突蛋白C-末端區(qū)段由人膜突蛋白第471-577位的氨基酸殘基組成。在一些實施方式中，生物標記物包含人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基的至少20個連續(xù)的氨基酸殘基。在一些實施方式中，生物標記物包含人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基的至少50個連續(xù)的氨基酸殘基。在一些實施方式中，生物標記物包含人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個連續(xù)的氨基酸殘基。本申請還提供了膜突蛋白C-末端區(qū)段作為用于在對象中評估癌癥的存在或出現(xiàn)的生物標記物的用途以及膜突蛋白C-末端區(qū)段在制備用于在對象中評估癌癥的檢測劑中的用途。在一些實施方式中，C-末端區(qū)段包含人膜突蛋白的第471-487位、第488-501位或第502-577位氨基酸殘基。在一些實施方式中，人膜突蛋白具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

在另一個方面，本申請?zhí)峁┝擞糜谠趯ο笾性u估癌癥的存在或出現(xiàn)的試劑盒，所述試劑盒包含與膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合的試劑。在一些實施方式中，所述試劑是抗體。在一些實施方式中，所述試劑是單克隆抗體或其片段。

在另一個方面，本申請?zhí)峁┝嗽趯ο笾兄委煱┌Y的方法，所述方法包括向該對象施用藥物組合物，所述藥物組合物包含特異性調(diào)節(jié)膜突蛋白C-末端區(qū)段功能的試劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實施方式中，所述試劑與膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合。在一些實施方式中，所述試劑是抗體。在一些實施方式中，所述試劑是單克隆抗體或其片段。在另一個方面，本申請?zhí)峁┝四ね坏鞍證-末端區(qū)段在制備用于在對象中治療癌癥的藥物中的用途。

附圖簡述

圖1：編碼全長人膜突蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO:1)。

圖2：全長人膜突蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。

圖3：人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基的氨基酸序列(SEQ ID No:3)。

圖4：癌癥患者和健康個體(正常)的樣品中C-末端膜突蛋白區(qū)段的濃度。

發(fā)明詳述

在對本申請進行更加詳細的描述之前，應(yīng)理解本申請不限于所描述的特定實施方式，并且其當然是可以改變的。還應(yīng)理解本申請中使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式的目的，并不旨在限制，因為本申請的范圍僅由所附的權(quán)利要求限定。在提供數(shù)值范圍時，應(yīng)理解在該范圍的上限和下限之間每個居中值和任何其他表述或該表述范圍內(nèi)的居中值，到下限的單位的十分之一，都被包括在本申請的范圍內(nèi)，除非上下文另有明示。這些更小范圍的上限和下限可以獨立地包括在更小的范圍中，并且也被包括在本申請的范圍內(nèi)，服從所述范圍中任何特定排除的極限值。在所述的范圍包括一個或兩個極限值時，排除一個或兩個在內(nèi)的極限值的范圍也被包括在本申請的范圍內(nèi)。

除非另有定義，否則本申請中使用的所有科技術(shù)語具有的含義與本申請所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本申請中使用的多數(shù)術(shù)語的一般性指導(dǎo)。雖然與本申請中所述的方法和材料類似或等價的任何方法和材料也可用于本申請的實踐或試驗，但是以下描述優(yōu)選的方法和材料。

在本說明書中引用的所有出版物和專利都通過引用并入本申請，相當于每篇出版物或?qū)＠继貏e地和單獨地被指出通過引用并入，并且其通過引用并入本申請以披露和描述與所引用的出版物有關(guān)的方法和/或材料。所引用的任何出版物均在本申請?zhí)峤蝗罩肮_，不應(yīng)將所述公開中的任何事項看作是承認本申請由于在先公開而沒有資格早于這些公開。而且，所提供的公開日可能不同于實際的公開日，其可能需要單獨確認。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本申請后將理解，本申請中所描述和解釋的各個實施方式均具有離散的組成和特性，在不脫離本申請范圍或主旨的前提下，可以容易地將其分離或者與任意其他若干實施方式的特性組合。任何所述的方法均可以所敘述的事件順序或者邏輯上可能的任何其他順序進行。

除非另有明示，否則本申請的實施方式將采用化學(xué)、固態(tài)化學(xué)、無機化學(xué)、有機化學(xué)、物理化學(xué)、分析化學(xué)、材料化學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、藥理學(xué)、成像等技術(shù)，其均在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)。文獻對這些技術(shù)進行了充分闡述，如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，第二版，(Sambrook等，1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait編著，1984)；"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney編著，1987)；"Methods in Enzymology"叢書(Academic Press,Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等編著，1987，并且定期更新)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction"(Mullis等編著，1994)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的標準技術(shù)制備本申請中使用的引物、多核苷酸和多肽。

在對本申請的實施方式進行詳細描述之前，除非另有明示，否則應(yīng)理解本申請不僅限于特定材料、試劑、反應(yīng)原料、生產(chǎn)工藝等，其是可以改變的。還應(yīng)理解在本申請中使用的術(shù)語僅用于說明特定實施方式的目的，并不旨在限制。本申請中也可能以邏輯上可能的不同順序執(zhí)行步驟。

給出下述實施方式以便向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完整地披露和描述本申請所公開和主張的方法是如何進行的以及生物標記物和試劑盒是如何使用的。已努力確保數(shù)字的準確度(例如量、溫度等)，但是應(yīng)考慮一些誤差和偏差。

需要指出的是，如本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式“一(a)”、“一個(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文另有明示。因此，例如“化合物”包括多個化合物。在本說明書和下文中的權(quán)利要求中，將給出多個術(shù)語以供參考，將對其進行定義以使其具有下述含義，除非具有明顯相反的意圖。

本申請?zhí)峁┝嗽u估癌癥的存在或出現(xiàn)的方法、用于評估癌癥的存在或出現(xiàn)的生物標記物和試劑盒以及此類生物標記物和試劑盒的用途。本申請還提供了治療癌癥的方法。

評估癌癥的存在或出現(xiàn)的方法

本申請的第一個方面提供了一種在對象中評估癌癥的存在或出現(xiàn)的方法。所述方法包括獲取對象的生物樣品并且在所述生物樣品中檢測膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平。在對象的生物樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平提示對象出現(xiàn)癌癥或出現(xiàn)癌癥的可能性增加。

如在本申請中使用的，術(shù)語“評估”(assess或assessment)指將來自受到或未受到癌癥影響對象的樣品之間相區(qū)分的能力或者將來自處于進入轉(zhuǎn)移之前的不同癌癥發(fā)展分期對象的樣品之間相區(qū)分的能力。在某些實施方式中，評估涉及確定對象患有腫瘤或未患腫瘤。在某些實施方式中，評估涉及確定對象的腫瘤是否已減輕或變得更加嚴重。在某些實施方式中，評估能輔助評價從治療中獲得臨床益處的可能性。在某些實施方式中，評估可以涉及患者是否將在治療(例如使用特定治療劑的治療)后得到改善和/或得到改善的可能性?？梢詫⒈旧暾埖脑u估方法用于臨床以便針對任意特定患者通過選擇最適宜的治療方案做出治療決定。本申請的評估方法是在評估患者在進行治療方案后是否可能長期存活的有價值的工具，如給定的治療方案，包括例如施用給定的治療劑或其組合、手術(shù)干預(yù)、類固醇療法等。

本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的差異不能達到在100％分析的樣品中均是正確的。然而，要求分析的樣品具有統(tǒng)計學(xué)意義的量是正確分類的?？梢杂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員使用不同的統(tǒng)計學(xué)工具確定具有統(tǒng)計學(xué)意義的量，例如但不限于通過確定置信區(qū)間、確定p值、Student檢驗或Fisher判別函數(shù)。詳細情況參見Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York 1983。在某些實施方式中，置信區(qū)間為至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。在某些實施方式中，p值小于0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。在某些實施方式中，本申請在分析人群某些組的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的對象中能夠正確檢測癌癥。

如在本申請中使用的，“生物樣品”指從目標對象獲取或來源于目標對象的生物組分，其含有例如基于物理學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)和/或生理學(xué)特征表征和/或鑒定的細胞和/或其他分子實體。生物樣品包括但不限于由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用任意公知的方法獲得的對象的細胞、組織、器官和/或生物液體。在某些實施方式中，所述生物樣品是液體樣品。在某些實施方式中，所述液體樣品是全血、血漿或血清。優(yōu)選地，所述液體樣品是血清。

如在本申請中使用的，術(shù)語“對象”指動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。術(shù)語“對象”的目標并不是在任何方面進行限制，并且可以是任何年齡、性別和身體狀況。

術(shù)語“膜突蛋白”代表膜組織延伸棘突蛋白(membrane-organizing extension spike protein)，如在Lankes和Furthmayr(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,88:8297-8301中所描述的。膜突蛋白多肽的氨基酸序列可以在公共數(shù)據(jù)庫中找到，如國家生物技術(shù)信息中心。術(shù)語多肽和蛋白可以在本申請中互換使用。在某些實施方式中，膜突蛋白是人膜突蛋白。全長人膜突蛋白是577個氨基酸的多肽，其具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。人膜突蛋白與其他物種的膜突蛋白(如小鼠和牛的膜突蛋白)具有高度的序列同源性(Sato等，Cell Sci.J.103:131-143(1992))。

“膜突蛋白C-末端區(qū)段”指膜突蛋白C-末端尾結(jié)構(gòu)域或C-末端尾結(jié)構(gòu)域的一部分。膜突蛋白C-末端尾結(jié)構(gòu)域是野生型膜突蛋白的一部分，其在結(jié)構(gòu)上與所述蛋白的羧基末端接近，在功能上負責與肌動蛋白絲結(jié)合和相互作用。膜突蛋白的C-末端尾結(jié)構(gòu)域帶正電荷，并且采用了擴展的曲折結(jié)構(gòu)。特別地，該術(shù)語指人膜突蛋白的最后約107個氨基酸殘基。在某些文獻中，將相同的結(jié)構(gòu)域也稱為C-ERM相關(guān)結(jié)構(gòu)域(C-ERMAD)，其包括在本申請的定義中(Bretscher等(1995))。C-末端結(jié)構(gòu)域的最后34個氨基酸殘基在ERM蛋白之間是高度保守的，并且形成與F-肌動蛋白結(jié)合的區(qū)域。特別地，術(shù)語“膜突蛋白C-末端區(qū)段”含有具有人膜突蛋白最后約107個氨基酸殘基中的氨基酸序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個連續(xù)的氨基酸殘基的多肽。在某些實施方式中，膜突蛋白C-末端區(qū)段由SEQ ID NO:3所示的人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基組成。優(yōu)選地，膜突蛋白C-末端區(qū)段包含來自人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基之間區(qū)域的至少20個連續(xù)的氨基酸殘基。更優(yōu)選地，C-末端區(qū)段包含來自人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基之間區(qū)域的至少50個連續(xù)的氨基酸殘基。

如在本申請中使用的，術(shù)語“膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平”指在樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的量或濃度。如在本申請中使用的，術(shù)語“檢測”指測定膜突蛋白C-末端區(qū)段的量或濃度的任意方法。測定方法可以是半定量的或定量的。測定可以直接或間接地進行。直接測定指根據(jù)來自肽自身的信號檢測肽的量或濃度，并且信號的強度與樣品中存在的肽分子數(shù)直接相關(guān)。此類信號(在本申請中有時稱為強度信號)可以例如通過檢測肽的特定物理或化學(xué)性質(zhì)的強度值獲得。間接測定包括測定來自間接成分(即，不是肽或多肽本身的成分)或生物讀取系統(tǒng)(例如，可測定的細胞應(yīng)答、配體、標記或酶促反應(yīng)產(chǎn)物)的信號。

根據(jù)本申請，可以采用用于確定樣品中肽量的任意適宜的方法實現(xiàn)對膜突蛋白C-末端區(qū)段水平的檢測。在某些實施方式中，檢測方法包括可以在各種夾心、競爭或其他測定形式中利用標記的分子的免疫測定設(shè)備和方法。所述測定將產(chǎn)生提示存在或不存在目標肽的信號。而且，信號強度可以優(yōu)選地與樣品中存在的目標肽的量直接或間接地(例如成反比)相關(guān)。而且適宜的方法包括測定目標肽特有的物理或化學(xué)性質(zhì)，例如，目標肽精確的分子量或NMR波譜。適宜的檢測方法還包括生物傳感器、與免疫測定偶聯(lián)的光學(xué)設(shè)備、生物芯片、分析設(shè)備如質(zhì)譜儀、NMR分析儀或色譜設(shè)備。而且，適宜的檢測方法可以包括基于微板的ELISA法、全自動或機器人免疫測定(例如在ELECSYS分析儀上進行)、CBA(酶促Cobalt結(jié)合測定，例如在Roche-Hitachi分析儀上進行)和乳膠凝集測定(例如在Roche-Hitachi分析儀上進行)。在某些實施方式中，通過測定從樣品中獲得的肽的特異性強度信號檢測目標肽的水平。如上文所述，此類信號可以是在特異性針對目標肽的質(zhì)譜或NMR波譜中觀察到的以m/z(質(zhì)荷比)變量觀察的特異性針對目標肽的信號強度。

在某些實施方式中，通過將樣品與同膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合的試劑接觸來檢測膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平。結(jié)合的試劑將產(chǎn)生強度信號。根據(jù)本申請的結(jié)合包括共價結(jié)合和非共價結(jié)合。與根據(jù)本申請的膜突蛋白C-末端區(qū)段結(jié)合的試劑可以是與本申請所述的膜突蛋白C-末端區(qū)段結(jié)合的任意化合物，例如肽、多肽、核酸或小分子。在某些實施方式中，結(jié)合試劑包括抗體、核酸、肽或多肽(如針對肽或其含有肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段的受體或結(jié)合伴侶)和適體(例如核酸或肽適體)。制備此類試劑的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，商業(yè)供應(yīng)商也提供適宜抗體或適體的鑒定和生產(chǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知開發(fā)具有更高親和性或特異性的此類試劑的衍生物的方法。例如，可以將隨機突變引入核酸、肽或多肽中。然后可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的篩選方法(例如噬菌體展示)測定這些衍生物的結(jié)合情況。

根據(jù)本申請的特異性結(jié)合指試劑基本上不與在待分析的樣品中存在的另一種肽、多肽或底物結(jié)合(“交叉反應(yīng)”)。優(yōu)選地，特異性結(jié)合的肽或多肽的結(jié)合親和性應(yīng)比任意其他相關(guān)的肽或多肽的結(jié)合親和性高至少3倍、更優(yōu)選地至少10倍和甚至更優(yōu)選地至少50倍。如果非特異性結(jié)合仍是顯著的、可以明確檢測的(例如根據(jù)其在Western印跡上的尺寸，或者在樣品中具有相對較高的豐度)，那么也是可以接受的。可以采用本領(lǐng)域公知的任意方法檢測試劑的結(jié)合。優(yōu)選地，所述方法是半定量的或定量的。適宜的方法包括：(1)例如通過NMR或表面等離子體共振直接測定試劑的結(jié)合。(2)如果試劑還作為目標肽酶促活性的底物，則可以測定酶促反應(yīng)產(chǎn)物(例如，可以通過例如使用Western印跡法測定裂解底物的量來測定蛋白酶的量)。或者，可以將其自身可以顯示出酶促性質(zhì)的試劑和與肽結(jié)合的試劑與能夠通過產(chǎn)生強度信號檢測的適宜底物接觸。對于酶促反應(yīng)產(chǎn)物的測定而言，優(yōu)選底物的量是飽和的。在反應(yīng)前還可以使用可檢測的標記對底物進行標記。優(yōu)選地，將樣品與底物接觸一段適宜的時間。一段適宜的時間指產(chǎn)生可檢測的(優(yōu)選可測量的)量的產(chǎn)物所需要的時間。除了測定產(chǎn)物的量以外，還可以測定出現(xiàn)給定量(例如可檢測的量)的產(chǎn)物所需要的時間。(3)可以將試劑與使得試劑能夠被檢測和測量的標記共價或非共價偶聯(lián)?？梢岳弥苯踊蜷g接的方法進行標記。直接標記包括將標記與試劑直接(共價或非共價)偶聯(lián)。間接標記包括將第二試劑與第一試劑(共價或非共價)結(jié)合。第二試劑應(yīng)與第一試劑特異性結(jié)合。所述第二試劑可以與適宜的標記偶聯(lián)和/或是與第二試劑結(jié)合的第三試劑的靶點(受體)。使用第二、第三或者甚至更高階試劑通常是為了增加信號強度。適宜的第二級和更高階的試劑可以包括抗體、二抗和熟知的抗生物素蛋白鏈菌素-生物素系統(tǒng)(Vector Laboratories,Inc.)。還可以使用一種或多種本領(lǐng)域公知的標簽對試劑或底物進行“加標”。然后可以將此類標簽作為更高階試劑的靶點。適宜的標簽包括生物素、地高辛、His-標簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、FLAG、GFP、myc-標簽、甲型流感病毒血凝素(HA)、麥芽糖結(jié)合蛋白等。在肽或多肽的情況下，所述標簽優(yōu)選在N-末端和/或C-末端。

適宜的標記是可以通過適宜的檢測方法檢測的任意標記。典型的標記包括金顆粒、乳膠小珠、吖啶酯、魯米諾、釕、酶促活性標記、放射性標記、磁性標記(“例如磁性小珠”，包括順磁性和超順磁性標記)和熒光標記。酶促活性標記包括例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶及其衍生物。用于檢測的適宜底物包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、3,3′-5,5′-四甲基聯(lián)苯胺、NBT-BCIP(4-硝基藍四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽，來自Roche Diagnostics的即用型儲備液)、CDP-Star(Amersham Biosciences)、ECF(Amersham Biosciences)。適宜的酶-底物結(jié)合可以產(chǎn)生有色的反應(yīng)產(chǎn)物、熒光或化學(xué)發(fā)光，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法對其進行檢測(例如使用光敏薄膜或適宜的照相系統(tǒng))。至于測定酶促反應(yīng)，可以類似地應(yīng)用上面給出的標準。

典型的熒光標記包括熒光蛋白(如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克薩斯紅(Texas Red)、熒光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。其他的熒光標記可以來自例如Molecular Probes(Oregon)。使用量子點作為熒光標記也是可以預(yù)期的。典型的放射性標記包括35S、125I、32P、33P等?？梢圆捎萌我夤暮瓦m宜的方法對放射性標記進行檢測，例如光敏薄膜或磷光體成像儀。根據(jù)本申請的適宜的檢測方法還包括沉淀(特別是免疫沉淀)、電化學(xué)發(fā)光(電致化學(xué)發(fā)光)、RIA(放射性免疫測定)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、夾心酶免疫測試、電化學(xué)發(fā)光夾心免疫測定(ECLIA)、解離增強的鑭系熒光免疫測定(DELFIA)、閃爍法、親近測定(SPA)、比濁法、比濁測定法、乳膠增強的比濁法或比濁測定法或者固相免疫測試?？梢詥为毷褂帽绢I(lǐng)域公知的其他方法(如凝膠電泳、2D凝膠電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、Western印跡和質(zhì)譜)或者將其與上文所述的標記或其他檢測方法聯(lián)用。

在某些優(yōu)選的實施方式中，與膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合的試劑是抗體或抗體片段。本申請所述的抗體包括多克隆和單克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及其片段，例如，能夠結(jié)合抗原或半抗原的單鏈抗體、Fv、Fab和F(ab)₂片段。

在某些實施方式中，抗體優(yōu)選是單克隆抗體。單克隆抗體是高度特異性地直接針對單一抗原的。在某些實施方式中，單克隆抗體通常包括包含與靶點結(jié)合的多肽序列的抗體，其中與靶點結(jié)合的多肽序列來自某一過程，該過程包括從多個多肽序列中選擇與單一靶點結(jié)合的多肽序列。例如，所述選擇過程可以是從多個克隆(例如，雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的庫)中選擇獨特的克隆。應(yīng)理解，還可以進一步改變所選擇的靶點結(jié)合序列，例如，從而改善對靶點的親和性、將靶點結(jié)合序列人源化、改善其在細胞培養(yǎng)中的生產(chǎn)、降低其在體內(nèi)的免疫源性、制備多特異性抗體等，并且包含改變的靶點結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。為了篩選與同目標抗體結(jié)合的抗原上的表位結(jié)合的抗體，可以進行常規(guī)的交叉阻斷測定，如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所描述的。

在某些實施方式中，可以按照如下所示檢測膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平：(a)將固體支持物與樣品接觸，所述固體支持物包含與如上所述的膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合的試劑，所述樣品包含膜突蛋白C-末端區(qū)段；和(b)檢測與支持物結(jié)合的膜突蛋白C-末端區(qū)段的量。所述試劑優(yōu)選以固化的形式存在于固體載體上，所述試劑優(yōu)選選自下組：核酸、肽、多肽、抗體和適體。試劑可以與多種不同載體結(jié)合。熟知的載體的示例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈淀粉、天然和經(jīng)修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵。用于本發(fā)明目的的載體的性質(zhì)可以是可溶的或不可溶的。將所述試劑固定/固化于載體的適宜方法是熟知的并且包括但不限于離子、疏水性、共價相互作用等等。還考慮使用“懸浮陣列”作為根據(jù)本申請的陣列(Nolan 2002,Trends Biotechnol.20(1):9-12)。在這種懸浮陣列中，載體例如微珠或微球存在于懸浮液中。陣列由攜帶不同試劑的不同微珠或微球(可能進行了標記)組成。生產(chǎn)此類陣列的方法(例如基于固相化學(xué)和對光不穩(wěn)定的保護基團)通常是已知的(美國專利號5,744,305)。

在某些實施方式中，檢測來自根據(jù)本申請定義的對象的血液樣品中膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平。優(yōu)選地，通過ELISA進行此類檢測。

在某些實施方式中，將在對象的生物樣品中檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平與從參照樣品檢測到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的參照水平進行了比較。

如在本申請中使用的，術(shù)語“比較”包括對由待分析的生物樣品組成的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平與適宜參照樣品的水平進行比較。應(yīng)理解，如在本申請中使用的術(shù)語指相應(yīng)的參數(shù)或值的比較，例如，將絕對量與絕對的參照量進行比較，將濃度與參照濃度進行比較，或者將來自測試樣品的強度信號與參照樣品同一類型的強度信號進行比較。比較可以人工或計算機輔助進行。對于計算機輔助比較而言，可以通過計算機程序?qū)⒋_定的量的值與在數(shù)據(jù)庫中存儲的相應(yīng)適宜參照的值進行比較?？梢允褂糜嬎銠C程序?qū)Ρ容^結(jié)果進行進一步評估，并且以適宜的輸出形式自動提供所需的評估?；跈z測得到的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平與適宜的參照水平的比較，能夠評估在所述對象中的癌癥情況。

因此，在本申請中使用的術(shù)語“參照水平”指能夠納入或排除對象中癌癥的存在或出現(xiàn)的閾值水平。例如，如果樣品中的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平高于參照水平，則可以認為樣品出現(xiàn)癌癥或出現(xiàn)癌癥的可能性增加。膜突蛋白C-末端區(qū)段的參照水平可以來自于一個或多個參照樣品，其中參照水平來自與檢測目標樣品的實驗平行進行的實驗。或者，參照水平可以來自數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包括來自一個或多個參照樣品或疾病參照樣品的數(shù)據(jù)、標準或水平的集合。在某些實施方式中，對此類數(shù)據(jù)、標準或水平的集合進行了歸一化以使得其能夠用于與來自一個或多個樣品的數(shù)據(jù)進行比較的目的。歸一化(“normalize”或“normalization”)是一個過程，通過該過程可以將檢測的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可以與其他已經(jīng)過這樣歸一化的數(shù)據(jù)直接進行比較的數(shù)據(jù)。歸一化用于克服由在一項測定與另一項測定之間可能改變的因素導(dǎo)致的測定特異性誤差，例如由上樣量、結(jié)合效率、檢測靈敏度以及其他各種誤差導(dǎo)致的改變。在某些實施方式中，參照數(shù)據(jù)庫包括來自一個或多個參照樣品的膜突蛋白C-末端區(qū)段的濃度和/或其他實驗室和臨床數(shù)據(jù)。在某些實施方式中，參照數(shù)據(jù)庫包括膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平，各水平均歸一化為與參照樣品在相同條件下測試的對照樣品(例如已知量的膜突蛋白C-末端區(qū)段)的膜突蛋白C-末端區(qū)段水平的百分率。為了與此類歸一化的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平進行比較，還測定待測樣品的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平，并計算為在與待測樣品相同條件下檢測的對照樣品膜突蛋白C-末端區(qū)段水平的百分率。在某些實施方式中，通過匯總來自從健康對象和/或無腫瘤對象(即已知無癌的對象)獲得的參照樣品的參照水平數(shù)據(jù)建立參照數(shù)據(jù)庫。在某些實施方式中，通過匯總來自接受癌癥治療的個體的參照樣品的參照水平數(shù)據(jù)建立參照數(shù)據(jù)庫。在某些實施方式中，通過匯總來自通過例如膜突蛋白C-末端區(qū)段的不同水平證實處于不同階段癌癥的個體的參照樣品的數(shù)據(jù)建立參照數(shù)據(jù)庫。

可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所需的靈敏度和特異性選擇參照水平。用于確定適宜參照水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如可以根據(jù)臨床研究從受試者工作特征曲線(ROC)確定參照水平。

在一些實施方式中，在生物樣品中檢測的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平高于膜突蛋白C-末端區(qū)段的參照水平提示該對象出現(xiàn)癌癥或出現(xiàn)癌癥的可能性增加。優(yōu)選地，在生物樣品中檢測的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平是膜突蛋白C-末端區(qū)段參照水平的至少2倍。更優(yōu)選地，在生物樣品中檢測的膜突蛋白C-末端區(qū)段的水平是膜突蛋白C-末端區(qū)段參照水平的至少5倍。

在本申請中使用的“可能性增加”指與從其中獲得參照樣品的對象相比，對象出現(xiàn)癌癥的可能性水平總體增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。

在本申請中使用的術(shù)語“癌癥”指涉及細胞失控生長的一大類疾病。癌癥的示例包括但不限于急性淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨肉瘤、腦干膠質(zhì)瘤、腦癌、小腦星形細胞瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、乳腺癌、支氣管腺瘤、伯基特氏淋巴瘤、類癌瘤、胃腸類癌瘤、宮頸癌、慢性支氣管炎、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性阻塞性肺病、結(jié)腸癌、皮膚T-細胞淋巴瘤、肺氣腫、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、尤因氏肉瘤、顱外生殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、肝外膽管癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、膽囊癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟癌、肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、眼內(nèi)黑色素瘤、胰島細胞癌、卡波西氏肉瘤、腎癌、喉癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、漿細胞瘤、胸膜肺母細胞瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、皮膚癌、鱗狀細胞癌、胃癌、咽喉癌、甲狀腺癌、子宮癌、陰道癌、外陰癌。

生物標記物和試劑盒

本申請的另一個方面提供了一種用于評估癌癥的生物標記物，所述生物標記物基本上由膜突蛋白C-末端區(qū)段或C-末端區(qū)段的一部分組成。

如在本申請中使用的，“生物標記物”指指示對象中的正常或異常過程或者對象中的疾病或其他狀況的靶分子或指征。生物標記物通常是可以通過多種方法檢測和測量的，所述方法包括實驗室測定和醫(yī)學(xué)成像。

在某些實施方式中，本申請的生物標記物包含膜突蛋白C-末端區(qū)段的至少20個連續(xù)的氨基酸殘基。在某些實施方式中，本申請的生物標記物包含膜突蛋白C-末端區(qū)段的至少50個連續(xù)的氨基酸殘基。在某些實施方式中，膜突蛋白C-末端區(qū)段由人膜突蛋白第471-577位的氨基酸殘基組成。

在另一個方面，本申請?zhí)峁┝四ね坏鞍證-末端區(qū)段作為用于在對象中評估癌癥的存在或出現(xiàn)的生物標記物的用途。

在另一個方面，本申請涉及膜突蛋白C-末端區(qū)段在制備用于在對象中評估癌癥的存在或出現(xiàn)的檢測劑中的用途。

在另一個方面，本申請?zhí)峁┝艘环N用于在對象中評估癌癥的試劑盒，其中所述試劑盒包含用于檢測樣品中存在的膜突蛋白C-末端區(qū)段水平的方法。該試劑盒可以使用適于檢測樣品中存在的膜突蛋白C-末端區(qū)段水平的任意方法。在某些實施方式中，該試劑盒含有與膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合的試劑。已在本申請的上文中公開了術(shù)語“試劑”和“特異性結(jié)合”。在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑是抗體。

在某些實施方式中，試劑盒還可以包含用戶手冊，其用于解釋關(guān)于根據(jù)本申請中定義的在對象中評估癌癥的任何檢測的結(jié)果。特別地，此類手冊可以包括關(guān)于哪種測定水平對應(yīng)于哪種評估的信息。此外，此類用戶手冊可以提供關(guān)于正確使用用于檢測膜突蛋白C-末端區(qū)段水平的試劑盒的組分的說明。在某些實施方式中，在單一容器中提供用于檢測的工具和試劑盒的說明書。

治療癌癥的方法

本申請的另一個方面涉及一種在對象中治療癌癥的方法。該方法包括向?qū)ο笫┯盟幬锝M合物，所述藥物組合物包含特異性調(diào)節(jié)膜突蛋白C-末端區(qū)段功能的試劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑。

如在本申請中使用的，術(shù)語“治療”指試圖改變被治療對象中的疾病或狀況的自然過程的臨床干預(yù)，并且其能夠用于預(yù)防或在臨床病理過程中進行。治療的理想效果包括預(yù)防疾病或狀況的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、減輕疾病或狀況任何直接或間接的病理后果、減慢疾病或狀況的進展速率、改善或減輕疾病狀態(tài)以及緩和或改善預(yù)后。

如在本申請中使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)”指控制以及調(diào)控膜突蛋白C-末端區(qū)段的功能。例如，所述試劑可以與膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合并且隔絕C-末端區(qū)段與其他分子之間的相互作用。再例如，所述試劑可以與C-末端區(qū)段競爭結(jié)合其相互作用伴侶，如膜突蛋白C-末端尾部結(jié)構(gòu)域通常結(jié)合的粘附分子。再例如，所述試劑可以修飾C-末端區(qū)段(例如磷酸化)從而改變C-末端區(qū)段的性質(zhì)。又例如，所述試劑可以降解膜突蛋白C-末端區(qū)段并將其從對象中除去。

在某些實施方式中，所述試劑與膜突蛋白C-末端區(qū)段特異性結(jié)合。在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑是抗體。更優(yōu)選地，所述試劑是單克隆抗體或其片段。在某些實施方式中，所述試劑是人源化的雜合抗體，其中將顯示出所需抗原特異性的非人供體抗體的氨基酸序列與人受體抗體的序列組合。供體序列通常至少包含供體與抗原結(jié)合的氨基酸殘基，但是還可以包含與供體抗體的結(jié)構(gòu)和/或功能相關(guān)的其他氨基酸殘基?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域熟知的一些方法制備這種雜合物。

在某些實施方式中，試劑能夠與膜突蛋白C-末端區(qū)段競爭結(jié)合粘附分子或細胞質(zhì)膜或膜突蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域通常結(jié)合的其他細胞或分子成分。在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑是分離的肽，所述分離的肽基本上由膜突蛋白C-末端區(qū)段或其變體組成。

如在本申請中使用的，術(shù)語“分離的”指肽或核苷酸，此類肽或核苷酸1)基本上不含通常天然與其伴隨或相互作用的組分，或者2)如果在此類肽或核苷酸的天然介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)它們，那么它們已被人工干預(yù)改變和/或?qū)⑺鼈円肓嗽瓉聿⒉缓兴鼈兊募毎小?/p>

如在本申請中使用的，術(shù)語“變體”指基本上與目標肽(或核苷酸)同源的肽(或核苷酸)，它們與目標肽(或核苷酸)具有相同的生理、代謝或免疫學(xué)作用，或者與目標肽(或核苷酸)具有相同的用途。肽變體還包括由目標肽的翻譯后修飾得到的肽，例如但不限于，糖基化、磷酸化或甲基化。

如在本申請中使用的，當肽變體的氨基酸序列(或核苷酸變體的核酸序列)與目標肽(或核苷酸)的氨基酸(或核酸)序列具有至少70％的同一性時，肽(或核苷酸)變體與目標肽(或核苷酸)是“基本上同源的”。在某些實施方式中，此類序列同一性是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或者至少99％。

肽或核苷酸序列的術(shù)語“同一性”定義為在進行序列比對且如有必要引入間隙以達到序列同一性最大百分率后，以變體序列中的氨基酸或核酸殘基與在目標肽或核苷酸中相同的氨基酸或核酸殘基的百分比，并且不考慮將任何保守性取代作為序列同一性的一部分?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域中的各種方法實現(xiàn)用于確定序列同一性百分率目的的比對，例如使用公眾能夠獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定用于測定比對的適宜參數(shù)，包括在待比較序列的全長范圍內(nèi)實現(xiàn)最大比對所需的任意算法。

在某些實施方式中，所述試劑是與SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的膜突蛋白C-末端區(qū)段的變體。在某些實施方式中，所述試劑是與SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％氨基酸序列同一性的膜突蛋白C-末端區(qū)段的變體。

如在本申請中使用的，術(shù)語“賦形劑”指化學(xué)和藥學(xué)上的惰性成分，其便于制備劑型或適于活性成分釋放。賦形劑包括但不限于粘合劑、崩解劑、填充劑(或稀釋劑)、助流劑、潤滑劑、香料、甜味劑和染料。賦形劑是藥學(xué)上可接受的含義是指其與制劑中的其他成分具有相容性并且對其受體無過度危害；并且其還可以減少活性劑任何不利的副作用。參見Wang等，J.Parent.Drug Assn.,34(6):452-462(1980)，其通過引用并入本申請。適于在根據(jù)本發(fā)明的組合物中使用的示例性的藥物賦形劑列于Remington:The Science&Practice of Pharmacy,21^st ed.,Lippincott Williams&Wilkins(2006)；Physician's Desk Reference,64^th ed.,Thomson PDR(2010)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients,6^th ed.,Eds.Raymond C.Rowe et al.,Pharmaceutical Press(2009)中，其通過引用并入本申請。

“有效量”指在所需劑量和時間內(nèi)能夠有效獲得所需治療或預(yù)防結(jié)果的量。本申請試劑的有效量可以隨著因素而改變，例如疾病狀態(tài)、年齡、性別和對象的體重以及試劑在對象中激發(fā)所需應(yīng)答的能力。有效量也是治療有益效果超過試劑的任何毒性或有害作用的量。有效量以及適宜給藥劑量或途徑的確定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。

在另一個方面，本申請涉及膜突蛋白C-末端區(qū)段或其變體在制備用于在對象中治療癌癥的藥物中的用途。

在另一個方面，本申請涉及一種分離的核苷酸序列，所述分離的核苷酸序列編碼人膜突蛋白的第471-577位氨基酸殘基或其變體。

提供下述實施例以說明本申請。其并非旨在以任何方式進行限制。

實施例1：制備與膜突蛋白C-末端區(qū)段或膜突蛋白N-末端區(qū)段結(jié)合的單克隆抗體

可以使用常規(guī)的雜交瘤方法制備針對膜突蛋白C-末端區(qū)段的單克隆抗體。為了產(chǎn)生具有SEQ ID NO:3所示序列的膜突蛋白C-末端區(qū)段，使用PCR擴增與圖3中所示的SEQ ID NO:3描述的C-末端區(qū)段對應(yīng)的cDNA片段。

將經(jīng)PCR擴增的膜突蛋白C-末端區(qū)段的DNA片段克隆進入選自pET32a(+)和pET28a(+)的表達載體。然后使用所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞系BL21(DE3)進行培養(yǎng)和表達。使用限制性內(nèi)切酶消化對所構(gòu)建表達系統(tǒng)的C-末端結(jié)構(gòu)域進行驗證，隨后進行測序以確證針對C-末端區(qū)段的表達具有正確的閱讀框架。

進行充分培養(yǎng)后，回收表達C-末端區(qū)段的宿主細胞，以便根據(jù)標準蛋白表達和純化方案收集和純化C-末端區(qū)段。使用SDS-PAGE對所得到的蛋白片段進行測定以確證其性質(zhì)和純度。

然后使用BALB/C小鼠，根據(jù)常規(guī)的雜交瘤方法，使用表達的C-末端區(qū)段制備針對膜突蛋白C-末端區(qū)段的單克隆抗體。

Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)首次描述了該雜交瘤方法，其全部內(nèi)容通過引用并入本申請。在一個典型的雜交瘤方法中，使用抗原(例如，如上文所述表達的膜突蛋白C-末端區(qū)段)免疫小鼠(例如，BALB/C小鼠)，然后將來自免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合。在選擇性允許雜交瘤生長的培養(yǎng)基中收集融合細胞，并且培養(yǎng)出存活的雜交瘤集落。經(jīng)過足夠的時間后，通過使用抗原(例如C-末端區(qū)段)的ELISA檢測和免疫組化測定篩選上清液。選擇陽性細胞用于進一步的亞克隆。通過有限稀釋將選擇的克隆亞克隆。進行亞克隆直至所有的克隆均為ELISA陽性。然后對陽性克隆進行選擇以獲得產(chǎn)生針對抗原的單克隆抗體的雜交瘤。

以類似方法制備針對膜突蛋白N-末端區(qū)段的抗體。用于制備抗體的膜突蛋白N-末端區(qū)段具有本申請所述的SEQ ID NO:2第1-297位氨基酸殘基的氨基酸序列，并且可以使用如上文所述的基因工程方法制備。

針對膜突蛋白全長或區(qū)段的抗體也是市售的。

實施例2：在癌癥患者的血清中檢測膜突蛋白的特定片段

從不同癌癥患者中收集血清或血漿樣品，并使用化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法檢測人膜突蛋白特定區(qū)段的存在情況，包括N-末端區(qū)段(第1-297位氨基酸殘基)和C-末端區(qū)段(第471-577位氨基酸殘基)。簡言之，使用生物素標記的N-末端或C-末端膜突蛋白區(qū)段稀釋樣品，用于與包被了與所述區(qū)段特異性結(jié)合抗體的板競爭性結(jié)合。然后加入酶(辣根過氧化物酶)標記的抗生物素蛋白鏈菌素以結(jié)合生物素。洗滌后，顯示發(fā)光信號以檢測與板結(jié)合的酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素。發(fā)光信號與樣品中N-末端或C-末端區(qū)段的濃度成反比。

材料和方法

首先，在保持抗體處于天然狀態(tài)的條件下，使用針對膜突蛋白N-末端或C-末端區(qū)段的高度純化的抗體包被聚苯乙烯微孔板的孔。特別地，ELISA板(LUMITRAC^TM 600 96孔白色免疫學(xué)板，Greiner 655074)的每個微孔與約100ng針對膜突蛋白N-末端區(qū)段或C-末端區(qū)段的抗體在2℃至8℃下孵育12-16小時。然后使用PBS洗板1次，隨后使用封閉溶液封閉，并真空干燥以供保存和隨后使用。

為了檢測樣品中N-末端膜突蛋白區(qū)段的存在情況，從臨床診斷患有轉(zhuǎn)移性肉瘤或非轉(zhuǎn)移性肉瘤的患者中收集和制備血清或血漿樣品。還收集了健康個體的樣品作為對照。使用PBS-T緩沖液(0.05％(v/v)吐溫-20)稀釋樣品，所述PBS-T緩沖液含有利用EZ-Link^TMNHS-PEG4-生物素化試劑盒(Thermo Scientific，產(chǎn)品編號21455)制備的20ng/ml的生物素標記的N-末端膜突蛋白片段。然后將100ul稀釋的樣品加入各孔中，使得樣品中存在的生物素標記的N-末端膜突蛋白區(qū)段或任意N-末端膜突蛋白區(qū)段與各孔中固化的抗體結(jié)合。使用PBS-T緩沖液洗去未結(jié)合的N-末端膜突蛋白區(qū)段(生物素標記的或未標記的)。然后將抗生物素蛋白鏈菌素-HRP(Invitrogen Life Technologies,SA100-01)加入各孔中以結(jié)合附著于微孔上的生物素標記的N-末端膜突蛋白區(qū)段。在將全部未結(jié)合的抗生素蛋白鏈菌素HRP洗去后，加入化學(xué)發(fā)光底物(SuperSignal ELISA Femto最大靈敏度底物，Pierce 37074)，并使用光度計(Thermo Scientific Luminoskan Ascent)檢測和測量發(fā)光信號。

使用與上述類似的方法檢測C-末端膜突蛋白片段的存在情況。

我們還使用夾心ELISA法確定樣品中全長膜突蛋白的存在情況。簡言之，按照如上文所述制備使用針對N-末端膜突蛋白區(qū)段的抗體包被的板。將未與生物素標記的N-末端膜突蛋白區(qū)段混合的樣品加入板中。在洗去未結(jié)合的蛋白之后，將針對C-末端膜突蛋白的抗體加入各微孔中以檢測全長膜突蛋白的存在情況。

對于統(tǒng)計分析而言，使用Student’s t檢驗(雙側(cè)檢驗)評估不同組之間N-末端或C-末端膜突蛋白濃度的差異。當p<0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

如圖4和表1中所示，與健康個體相比，來自癌癥患者的樣品具有顯著性更高的C-末端膜突蛋白區(qū)段濃度(p<0.01)。相比之下，在癌癥患者中N-末端膜突蛋白區(qū)段的濃度未具有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著高于健康個體(p＝0.17)。在樣品中未檢測到全長膜突蛋白。

如表2所示，在70.8％來自癌癥患者的樣品中檢測到了C-末端膜突蛋白區(qū)段，但是僅在12.5％來自健康個體的樣品中檢測到了C-末端膜突蛋白區(qū)段。而相反的是，在87.5％來自癌癥患者的樣品中和在75％來自健康個體的樣品中檢測到了N-末端膜突蛋白區(qū)段。

因此，可以將C-末端膜突蛋白區(qū)段的存在情況作為癌癥的生物標記物。

表1：樣品中N-末端或C-末端膜突蛋白區(qū)段的濃度

表2：樣品中N-末端或C-末端膜突蛋白區(qū)段的存在情況

*癌癥組包括骨肉瘤、尤文氏肉瘤、軟骨肉瘤、巨細胞腫瘤、脂肪肉瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌和前列腺癌患者。

盡管已參照特定實施方式(其中的一些是優(yōu)選實施方式)特別地示出和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不脫離如本申請所公開的本申請的主旨和范圍的前提下，可以對本申請的形式和細節(jié)做出各種改變。