專利名稱：作為生物標(biāo)記物用于上皮來源的癌癥的診斷和預(yù)后的cyr61的制作方法
作為生物標(biāo)記物用于上皮來源的癌癥的診斷和預(yù)后的CYR61相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2005年2月18日提交的美國臨時專利申請NO. 60/654,111在35 U.S.C.§ 119 (e)之下的權(quán)益發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及通過評定從患者獲得的尿液樣品中Cyr61的水平 用于上皮來源的癌癥的診斷和預(yù)后的方法。發(fā)明背景
癌癥存活率中最重要的因素之一是在早期的檢測。檢測癌癥早 期事件的臨床分析提供了介入和防止癌癥發(fā)展的機會。隨著基因描繪 (profiling)和蛋白質(zhì)組的發(fā)展，在可用于診斷和預(yù)測特定癌癥的分子 標(biāo)記物或"生物標(biāo)記物"的鑒定方面有了顯著的進(jìn)展。例如，對于前列 腺癌來說，抗原PSA (前列腺特異性抗原)可以在血液中檢測，是存在 前列腺癌的指示。因而，存在前列腺癌風(fēng)險的男性的血液可以快速、容 易和安全地篩選提高的PSA水平。
雖然在癌癥檢測領(lǐng)域存在著顯箸的進(jìn)展，本領(lǐng)域仍然需要鑒定 可以容易地用于臨床應(yīng)用的用于各種癌癥的新的生物標(biāo)記物。例如，迄 今為止，對于使用易于檢測的生物標(biāo)記物診斷乳腺癌，存在著相對較少 的可用選擇。EGFR的過量表達(dá)，特別是伴隨著雌激素受體的減量調(diào)節(jié)， 是乳腺癌患者中不良預(yù)后的標(biāo)志.此外，在乳腺癌肺瘤組織樣品中Cyr61 的增量調(diào)節(jié)已經(jīng)在美國專利申請No. 20040086504中注意到，然而， Cyr61的檢測涉及侵入性的步驟，沒有攪動使用尿液用于Cyr61的分析。 乳腺癌的其他標(biāo)記物包括血液中高水平的M2丙酮酸激酶(M2 PK)(美 國專利NO. 6,358,683 )、血液中高的ZNF217蛋白水平(WO 98/02539 ) 以及對于診斷有用的、乳腺癌中新近鑒定的蛋白質(zhì)PDEBC的差異表達(dá) (美國專利申請No. 20030124543 )。這些生物標(biāo)記物提供了診斷的可 選擇方法，然而，它們沒有被廣泛地使用，許多涉及了侵入性的檢測步 驟。此外，盡管使用許多組織化學(xué)遺傳學(xué)的和免疫學(xué)的標(biāo)記物，臨床醫(yī)
師仍然難以預(yù)測哪些腫瘤將轉(zhuǎn)移到其他器官。
生物標(biāo)記物的鑒定對于改善診斷、預(yù)后以及疾病的治療是特別相關(guān)的。因而，本領(lǐng)域需要鑒定可以快速、容易和安全地檢測的選擇性 的生物標(biāo)記物。這樣的生物標(biāo)記物可以用于診斷、分期、或監(jiān)視患有癌 癥的個體的進(jìn)展或治療。生物標(biāo)記物也可以用于區(qū)分受限的器官和轉(zhuǎn)移 性的癌癥。
涉及紳瘤的"血管生成轉(zhuǎn)換"的生物標(biāo)記物是特別有用的，因 為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移是血管生成依賴性的。當(dāng)腫瘤變?yōu)檠苌尚詴r，腫 瘤逐漸地擴展，并可以散布轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞(HanahanD, FolkmanJ., Cell 86:353-364,1996; Smith-Mcune and Weidner N., Cancer Research, 54: 800-804)。因此，涉及肺瘤向血管生成性狀態(tài)的轉(zhuǎn)換的生物標(biāo)記物的鑒定 將允許人們診斷受限的器官和轉(zhuǎn)移性的癌癥。發(fā)明概述
本發(fā)明基于這種發(fā)現(xiàn)，Cyr61蛋白存在于患有卵巢癌和乳腺癌 的患者的尿液中，并且，在含有這些癌癥的惡性形式的患者中Cyr61蛋 白的水平更高。因而，本發(fā)明涉及預(yù)后評估的方法，以及涉及便于上皮 來源的癌癥的診斷的方法，所述上皮來源的癌癥例如乳腺癌、結(jié)腸癌、 前列腺癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌和皮膚癌， 以及其它的癌癥。Cyr61作為治療效力的標(biāo)記物也已/>開。
特別地，尿液中Cyr61蛋白的監(jiān)視水平可以用作初步篩選來便 于卯巢或乳腺癌的診斷；與年齡和性別匹配的健康對照樣品相比，在來 自測試患者的樣品的尿液中檢測的更高數(shù)量的Cyr61蛋白是患者患有癌 癥的指示。換句話說，存在著患者患有癌癥的提高的可能性。然后可以 進(jìn)行進(jìn)一步的測試來確認(rèn)診斷結(jié)論，例如乳房造影法(乳腺癌)、超聲、 PET掃描、MRI或任何其他成像技術(shù)、活組織檢查、臨床檢查或 ductogram。此外，監(jiān)^L在患者中隨著時間的Cyr61蛋白水平，發(fā)現(xiàn)隨著 時間的表達(dá)提高，可以用于指示癌癥已經(jīng)提高了它的侵略性，并因而患 者具有不良的預(yù)后。因而臨床醫(yī)師可以調(diào)節(jié)治療。因此，測量尿液中 Cyr61的水平提供了快速、容易和安全的篩選，其可用于患者中上皮來 源的癌癥，例如乳腺或卵巢癌的診斷和預(yù)后。
不受理論的限制，相信的是，Cyr61涉及血管生成轉(zhuǎn)換。因此，
Cyr61的檢測被認(rèn)為指示了癌癥已經(jīng)轉(zhuǎn)換成更為血管生成性的疾病，并 因而需要更為侵略性的治療。為支持這一點，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Cyr61增量調(diào)節(jié) 涉及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT )的分子(參 見實施例3) 。 EMT是重要的過程，通過該過程上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)性、 成纖維細(xì)胞樣的性質(zhì)，并顯示降低的細(xì)胞間粘附和提高的運動性。相信 的是，EMT樣事件在胂瘤發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)化期間出現(xiàn)，為癌細(xì)胞賦予侵入 和凈爭移'〖生的'1"生質(zhì)(Lionel Larue 1 and Alfonso Bellacosa Oncogene (2005 ) 24,7443-7454)。
在一個實施方式中，提供了一種方法，用于便于個體中上皮 來源的癌癥的診斷。所述方法包括測量獲自個體的測試尿液樣品中存在 的Cyr61水平，并比較觀察到的Cyr61水平與對照尿液樣品中存在的 Cyr61水平。與對照樣品相比在測試樣品中更高的Cyr61水平，是提高 的癌癥可能性的指示。優(yōu)選的，所述水平是所述對照物的1.5倍、更優(yōu) 選的2倍或更多。
優(yōu)選的，本發(fā)明的方法用于上皮來源的癌癥、特別是乳腺癌 和卯巢癌的早期檢測。例如，可以在年度體檢期間由醫(yī)師來篩選個體。 陽性的測試結(jié)果，其中Cyr61的水平高于對照物的水平，將使進(jìn)一步的 診斷評估有正當(dāng)理由。
術(shù)語"對照樣品，，是指從相信不患有癌癥的"正常的，，或"健 康的，，個體獲得的尿液樣品。對照物可以使用本領(lǐng)域^^知的方法來選 擇。 一旦很好地確定了對照群體的水平，來自測試尿液樣品的陣列結(jié)果 可以直接與已知的水平比較。
術(shù)語"測試樣品"是指從要檢測上皮來源的癌癥的患者獲得 的尿液樣 品。
在一個方面，要診斷的上皮來源的癌癥是乳腺癌、基底細(xì)胞 癌、腺癌、胃腸道癌癥，例如唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌癥和胃癌、 結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌和皮膚癌， 例如扁平細(xì)力包和基底細(xì)胞癌癥、前列腺癌、腎臟細(xì)胞癌，和其他影響整 個身體的上皮細(xì)胞的已知的癌癥。優(yōu)選的，所述癌癥是乳腺癌或卵巢 癌。
本發(fā)明還預(yù)期評定獲自同 一 個體的多個測試樣品中存在的 Cyr61水平，其中隨著時間Cyr61數(shù)量的逐漸提高指示癌癥腫瘤的提高
的侵略性(例如，轉(zhuǎn)移可能性)。因而，Cyr61的水平充當(dāng)了疾病狀態(tài) 和階段的預(yù)測物?？梢韵喔魯?shù)天、數(shù)周或數(shù)月采集樣品。
本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期評定Cyr61水平來監(jiān)視被設(shè)計以治療患有上皮來源的癌癥的患者的治療方案的治療效力。
在本發(fā)明的一個方面中，通過用特異性結(jié)合Cyr61蛋白或其部分的基于抗體的結(jié)合部分接觸測試樣品或其制備物來測試尿液樣品 中存在的Cyr61水平?；诳贵w的結(jié)合部分與Cyr61形成可以被檢測的 復(fù)合物，從而容許測量Cyr61的水平。
基于抗體的免疫分析是測量Cyr61蛋白水平的優(yōu)選的方式。 然而，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來評定Cyr61水平。例 如，在某些實施方式中，通過質(zhì)譜法，包括SELDI質(zhì)謙法來分析Cyr61 表達(dá)水平。
在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含用于 測量尿液樣品中的Cyr61的手段。
在另一個實施方式中，提供了指導(dǎo)個體的治療的方法。所述 方法包括讓個體測試獲自所述個體的尿液樣品中的Cyr61水平，其中臨 床醫(yī)師審查該結(jié)果，如果尿液具有比對照樣品中的Cyr61水平更高水平 的Cyr61，所述臨床醫(yī)師指導(dǎo)所述個體治療上皮來源的癌癥。所述測試 可以在所述個體居留的同一國家、或在其他國家進(jìn)行，所述結(jié)果例如通 過網(wǎng)站變?yōu)榭捎玫?，或被傳送給臨床醫(yī)師。
下文中公開了本發(fā)明的其他方面。附圖
的簡要說明
附隨的圖畫，合并到本說明書中并作為本說明書的 一部分， 與說明書一同說明了本發(fā)明的實施方式，用來解釋本發(fā)明的目的、益處 和原理。
附圖la和lb顯示了在卵巢癌患者的尿液中檢測的Cyr61。附 圖la:免疫印跡檢測卵巢癌患者的尿液中的Cyr61免疫反應(yīng)性蛋白 (OV3， 0VCAR3細(xì)胞提取物；Control,對照樣品；Benign,來自良性 癌癥患者的尿液；Malignant,來自惡性癌癥患者的尿液。附圖lb:免疫 印跡檢測卵巢癌患者尿液中Cyr61免疫反應(yīng)性蛋白的數(shù)量柱形圖。每個 階段11=12。附圖2顯示了 Cyr61的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)。
附圖3顯示了乳腺癌患者的尿液中Cyr61的Western印跡。 來自卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-5 (OV5)的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物用作陽性對照， 泳道l。在來自年齡、性別匹配的健康對照(CTL)(泳道2)、導(dǎo)管原 位癌(DCIS )(泳道3 )、非典型的導(dǎo)管hyperplasia (ADH)(泳道4 )、 侵入性(Invasive)(泳道6 )和轉(zhuǎn)移性(Met)乳腺腫瘤患者(泳道7 ) 的尿液中分別沒有檢測到CYR61免疫反應(yīng)性蛋白。發(fā)明的詳細(xì)說明 -
我們發(fā)現(xiàn)，患者的尿液樣品中存在的Cyr61水平與上皮來源 的癌癥的存在或不存在相關(guān)。
如在此使用的，"上皮來源的癌癥"是指由上皮細(xì)胞產(chǎn)生的 癌癥，其包括但不限于，乳腺癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、 口腔癌、食道癌、小腸癌和胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵 巢癌、子宮頸癌、肺癌、乳腺癌和皮膚癌，例如扁平細(xì)胞和基底細(xì)胞癌、 前列腺癌、腎臟細(xì)胞癌、和其他影響整個身體的上皮細(xì)胞的已知癌癥。
術(shù)語"侵略性的"或"侵入的"對于癌癥是指腫瘤擴展超過 它的邊界進(jìn)入鄰近組織的傾向(Darnell, J.( 1990), Molecular Cell Biology, Third Ed, W. H. Freeman， NY)。侵入性癌癥可以與器官限制的癌癥形 成對照，其中腫瘤被限制在特定的器官。腫瘤的侵入性質(zhì)常常伴有蛋白 水解酶的作用，例如膠原酶，其降解基質(zhì)和基底膜材料來允許腫瘤擴展 超出被嚢的限制，并超出胂瘤位于其中的特定組織的限制。
如在此使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)移"是指癌癥從起源器官向患者中其 他遠(yuǎn)端位點的散布的情況。腫瘤轉(zhuǎn)移的過程是多級的事件，涉及局部侵 入和細(xì)胞間基質(zhì)的破壞、進(jìn)入血管的入血管內(nèi)滲、淋巴的或其他通道的 轉(zhuǎn)運、在循環(huán)中的存活、在第二位點中的血管的出血管滲出，以及在新 位置的生長(Fidler,等人,Adv. Cancer Res. 28,149-250 ( 1978) ， Liotta, 等人，Cancer Treatment Res. 40,223-238 ( 1988 ) , Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948,175-224( 1988 )以及Zetter, N. Eng. J. Med. 322, 605-612 (1990))。提高的惡性細(xì)胞運動性已經(jīng)與動物以及人類腫瘤中增強的 轉(zhuǎn)移可能性相關(guān)聯(lián)(Hosaka,等人，Gann 69,273-276 ( 1978 )以及 Haemmerlin,等人,Int. J. Cancer 27, 603-610 ( 1981 ))。在優(yōu)選的實施方式中，所述尿液樣品被處理以防止Cyr61蛋 白的降解。抑制或防止降解的方法包括但不限于，用蛋白酶處理樣品、 冷凍樣品或?qū)悠分糜谒?。?yōu)選的，在分析之前，將樣品持續(xù)地保持 在條件下以防止Cyr61蛋白的降解。
如在此使用的，"原發(fā)腫瘤，，是在患者體內(nèi)的第一位點出現(xiàn) 的腫瘤，可以不同于"轉(zhuǎn)移性腫瘤"，其在遠(yuǎn)離原發(fā)胂瘤的遠(yuǎn)端位點出 現(xiàn)在個體的身體中。
如在此使用的，"LCIS"是指小葉原位癌。LCIS也稱為小葉 瘤形成，有時被分類為非擴散乳腺癌的種類。它不滲透穿過小葉的壁。 雖然它本身通常不變?yōu)榍秩胄缘陌┌Y，有這種狀況的女性具有在同一個 或?qū)?cè)乳腺中發(fā)展侵入性乳腺癌的更高的風(fēng)險。
如在此使用的，"DOS"是指導(dǎo)管原位癌。導(dǎo)管原位癌是最 常見的非擴散乳腺癌種類。在DCIS中，惡性細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)移通過導(dǎo)管的 壁進(jìn)入乳腺的脂肪組織。粉刺狀癌是一種DCIS,其比其他種類的DCIS 更可能在乳房肺瘤切除術(shù)后回到相同的區(qū)域，并且與其他形式的DCIS 相比更緊密地關(guān)聯(lián)著侵入性導(dǎo)管癌的最終發(fā)展。
如在此使用的，"Cyr61"是指Genebank登記號Genp印t, 000622和AAB58319 ( Homosapiens) ( SEQ ID NO: 1 )(附圖2 )的 Cyr61蛋白。Cyr61是富含半胱氨酸的肝素結(jié)合蛋白，其由細(xì)胞表面和 細(xì)胞外基質(zhì)分泌并與之相關(guān)聯(lián)。術(shù)語"Cyr61"還涵蓋物種變體、同源 物、等位形式、突變形式和其等同物。
本發(fā)明涉及便于在患者中診斷上皮來源的癌癥的方法。在一 個實施方式中，所述方法包括測量獲自懷疑患有癌癥的個體的測試樣品 中Cyr61的水平，并比較觀察到的水平與對照樣品中發(fā)現(xiàn)的Cyr61水 平，所述對照樣品例如從相信不患有癌癥的單個患者或個體群體獲得的 樣品。Cyr61的水平高于正常的對照中觀察到的水平指示癌癥的存在。 Cyr61的水平可以通過任何單位來表示，例如，從密度計、光度計或Elisa 平板讀數(shù)器獲得的單位。
如在此使用的，"與對照樣品中的水平相比在測試樣品中更 高的Cyr61水平"是指Cyr61的數(shù)量，其高于對照樣品中存在的Cyr61 數(shù)量。術(shù)語"更高水平"是指一種水平，其統(tǒng)計學(xué)上顯著地或顯著地高 于對照樣品中發(fā)現(xiàn)的水平。優(yōu)選的，"更高水平"是至少2倍或更高。
術(shù)語"統(tǒng)計學(xué)上顯著的，，或"顯著地"是指統(tǒng)計顯著性，一 般意味著兩倍標(biāo)準(zhǔn)誤差(2SD)在正常的標(biāo)記物濃度之上，或更高。
為了比較的目的，測試樣品和對照樣品是相同的類型，也就 是，獲自尿液。然而，對照樣品也可以是含有與獲自健康個體的尿液樣 品中通常發(fā)現(xiàn)的相同濃度Cyr61的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
在本發(fā)明的一個方面，可以進(jìn)行第二診斷步驟。例如，如果 發(fā)現(xiàn)Cyr61水平指示癌癥存在，則可以進(jìn)行檢測所述癌癥的其他方法來 確認(rèn)癌癥的存在?？梢允褂酶鞣N其他的診斷步驟的任一種，例如乳房造 影法(乳腺癌)、超聲、PET掃描、MRI或任何其他成像技術(shù)、活組織 沖企查、臨床4全查、ductogram或任l可其他方法。
此外，可以通過跟蹤單個患者中的Cyr61水平來評定疾病進(jìn) 展。例如，患者狀況的改變可以通過比較隨著時間在患者中Cyr61表達(dá) 水平方面的改變。Cyr61水平的逐漸提高是腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移的提高的可 能性的指示。
本發(fā)明的預(yù)后方法對于確定患有癌癥的患者/個體的適當(dāng)治 療過程也是有用的。治療過程是指在診斷之后或在治療癌癥之后對患者 采取的治療辦法。例如，確定癌癥復(fù)發(fā)、散布或患者存活的可能性，可 以幫助確定是否應(yīng)當(dāng)采取更保守的或更激進(jìn)的方法來治療，或者是否應(yīng) 當(dāng)組合治療形式。例如，當(dāng)癌癥復(fù)發(fā)是可能的時，有益的是在外科治療 之前或之后進(jìn)行化學(xué)療法、放射、免疫治療、生物學(xué)修飾治療、基因治 療、疫苗等等，或在患者被治療期間調(diào)整時間跨度。源量cy6/水^
Cyr61水平可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來測 量。在本發(fā)明中， 一般優(yōu)選的是使用抗體、或抗體等同物來檢測Cyr61 水平。然而，也可以使用用于檢測的其他方法。例如，Cyr61水平可以 通過質(zhì)譜分析來監(jiān)視。
在一個實施方式中，Cyr61蛋白的水平通過使尿液樣品與基 于抗體的結(jié)合部分接觸來測量，所述基于抗體的結(jié)合部分特異性地結(jié)合 Cyr61或Cyr61的片段。然后檢測抗體-Cyr61復(fù)合物的形成作為Cyr61 水平的度量。
術(shù)語"基于抗體的結(jié)合部分"或"抗體"包括免疫球蛋白分 子和免疫球蛋白分子的免疫活性決定簇，例如，含有特異性結(jié)合(免疫
反應(yīng))Cyr61、或本發(fā)明的其他生物標(biāo)記物的抗原結(jié)合位點的分子。術(shù) 語"基于抗體的結(jié)合部分"意圖包括完整的抗體，例如，任何同種型的 抗體(IgG、 IgA、 IgM、 IgE,等等)，并包括也特異性地與Cyr61蛋白 反應(yīng)的其片段?？贵w可以使用常規(guī)技術(shù)來片斷化。因而，該術(shù)語包括抗 體分子的蛋白水解裂解的或重組制備的部分的片段，其能夠與某些蛋白 選擇性地反應(yīng)。這種蛋白水解的和/或重組片段的非限制性實例包括 Fab、 F(ab')2、 Fab'、 Fv、 dAbs以及含有由肽接頭連接的VL和VH結(jié) 構(gòu)域的單鏈抗體(scFv) 。 scFVs可以共價地或非共價地連接來形成具 有兩個或多個結(jié)合位點的抗體。因而，"基于抗體的結(jié)合部分"包括抗 體和重組抗體的多克隆的、單克隆的或其他純化的制品。術(shù)語"基于抗 體的結(jié)合部分"進(jìn)一步意圖包括人源化的抗體、雙特異性抗體和具有來 自抗體分子的至少一個抗原結(jié)合決定簇的嵌合分子。在優(yōu)選的實施方式中，可檢測地標(biāo)記基于抗體的結(jié)合部分。
如在此使用的，"標(biāo)記的抗體"包括通過可檢測的方式標(biāo)記 的抗體，包括但不限于，酶學(xué)地、放射性地、熒光地和化學(xué)發(fā)光地標(biāo)記 的抗體?？贵w也可以用可檢測的標(biāo)簽，例如c-Myc、 HA、 VSV-G、 HSV、 FLAG、 V5或HIS來標(biāo)記。
在使用基于抗體的結(jié)合部分用于檢測Cyr61的本發(fā)明的診斷 和預(yù)后方法中，尿液樣品中存在的Cyr61蛋白水平與從可檢測標(biāo)記的抗 體發(fā)出的信號的強度相關(guān)。
在一個優(yōu)選的實施方式中，基于抗體的結(jié)合部分通過將抗體 與酶連接來可檢測地標(biāo)記。隨后，當(dāng)暴露于其底物時，所述酶將與所迷 底物反應(yīng)，這樣來產(chǎn)生化學(xué)部分，其可以通過例如分光光度法、熒光或 通過可見裝置來檢測。可用于可檢測標(biāo)記本發(fā)明的抗體的酶包括但不限 于，蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌的核酸酶、A-V-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇 脫氬酶、oc-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化酶、堿性磷 酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、P-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿酶、 過氧化氫酶、葡萄糖-VI-磷酸脫氬酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。化 學(xué)發(fā)光是可用于檢測基于抗體的結(jié)合部分的另 一種方法。
檢測也可以使用各種其他的免疫分析的任一種來實現(xiàn)。例 如，通過方文射性地標(biāo)記抗體，有可能通過使用放射免疫分析來4全測抗 體。放射性同位素可以通過例如使用y計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或通過放射
照相的手段來檢測。對于本發(fā)明的目的特別有用的同位素是3H、 mI、 35S、 "C和優(yōu)選的125I。
還可能的是用熒光化合物標(biāo)記抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體暴露 于適當(dāng)波長的光線時，然后由于熒光可以檢測它的存在。在最常用的熒 光標(biāo)記化合物之中有CYE染料、異硫氰酸熒光素、羅丹明、 phycoerytherin、藻青蛋白、另,J藻藍(lán)蛋白、o-phthaldehyde和熒光胺。
抗體也可以使用熒光發(fā)射金屬，例如銪或其他鑭系元素來可 檢測地標(biāo)記。這些金屬可以使用金屬螯合基團如二亞乙基三胺五乙酸 (DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)來附著于抗體。
抗體也可以通過將它連結(jié)到化學(xué)發(fā)光化合物來可檢測地標(biāo) 記。然后通過檢測在化學(xué)反應(yīng)過程期間出現(xiàn)的發(fā)光的存在，來確定化學(xué) 發(fā)光物-抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實例有魯米諾、 螢光素、isoluminol、 theromatic acridinium ester 、咪峻、acridinium鹽和 草酸酯。
如上所述，通過免疫分析，例如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、 放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA) 、 Western印跡或免疫 組織化學(xué)，可以檢測Cyr61水平，以下詳細(xì)地說明每一種方法。免疫分 析例如及其快速的ELISA或RIA，是更一般地優(yōu)選的。也可以采用抗體 陣列或蛋白芯片，參見，例如美國專利申請NO: 20030013208A1; 20020155493A1; 20030017515和美國專利No: 6,329,209; 6,365,418; 通過完全引用將它們合并在此。
"放射免疫分析"是使用抗原的標(biāo)記的(例如，放射性標(biāo)記 的)形式用于檢測和測量抗原濃度的技術(shù)。用于抗原的放射性標(biāo)記物的 實例包括3H、 14C和125I。通過使生物樣品中的抗原與標(biāo)記的(例如， 放射性地)抗原竟?fàn)幗Y(jié)合針對所述抗原的抗體，來測量生物樣品中抗原 Cyr61的濃度。為了確保標(biāo)記的抗原和未標(biāo)記的抗原之間的竟?fàn)幗Y(jié)合， 標(biāo)記的抗原以足以飽和所述抗體的結(jié)合位點的濃度存在。樣品中的抗原 濃度越高，將結(jié)合所述抗體的標(biāo)記的抗原的濃度越低。
在放射免疫分析中，為了確定結(jié)合了抗體的標(biāo)記的抗原的濃 度，必需從游離抗原中分離抗原抗體復(fù)合物。從游離抗原分離抗原抗體 復(fù)合物的一種方法是通過使用抗同種型抗血清沉淀所述抗原抗體復(fù)合
物。從游離抗原分離抗原抗體復(fù)合物的另 一種方法是通過使用福爾馬林滅活的S. aureus沉淀抗原抗體復(fù)合物。從游離抗原分離抗原抗體復(fù)合物 的再另一種方法是通過進(jìn)行"固相放射免疫分析"，其中抗體被連接(例 如，共價地)到Sepharose珠子、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或孩i滴定孔。 通過比較結(jié)合了抗體的標(biāo)記的抗原的濃度和基于具有已知抗原濃度的 樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定生物樣品中抗原的濃度。
"免疫放射分析"(IRMA)是一種免疫分析，其中抗體試劑 被放射性地標(biāo)記。IRMA需要產(chǎn)生多價的抗原結(jié)合物，通過例如與蛋白 質(zhì)如兔血清白蛋白(RSA)結(jié)合的技術(shù)。多價的抗原結(jié)合物必需具有每 分子至少2個抗原殘基，并且所述抗原殘基必需有足夠的距離間隔以允 許被至少兩個針對所述抗原的抗體結(jié)合。將未標(biāo)記的"樣品"抗原以及 被放射性標(biāo)記的針對所述抗原的抗體添加到含有多價抗原結(jié)合物包被 的球體的試管中。樣品中的抗原與所述多價抗原結(jié)合物竟?fàn)幙乖贵w結(jié) 合位點。在適合的孵育期之后，通過洗滌除去未結(jié)合的反應(yīng)物，測定在 固相上的放射性的數(shù)量。結(jié)合的放射性抗體的數(shù)量與樣品中抗原的濃度 成反比。
最常見的酶免疫分析是"酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)"。 ELISA是使用標(biāo)記(酶連接)形式的抗體用于檢測和測量抗原的濃度的 技術(shù)。存在各種形式的ELISA，其是本領(lǐng)域的技術(shù)人員^^知的。在 "Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell等人，"Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964;和Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22:895-904中描述了本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
在"夾心ELISA"中，抗體(例如，抗畫Cyr61)與固相(即, 微量滴定板)連接，并暴露于含有抗原(例如，Cyr61)的生物樣品。 然后洗滌固相來除去未結(jié)合的抗原。然后標(biāo)記的抗體(例如，酶連接的) 與結(jié)合的抗原(如果存在)結(jié)合形成抗體-抗原-抗體夾心?？梢耘c抗體 連接的酶的實例包括》咸性磷酸酶、辣根過氧化酶、熒光素酶、尿酶和P -半乳糖苦酶。酶連接的抗體與底物反應(yīng)來產(chǎn)生可以測量的有色反應(yīng)產(chǎn) 物。
在"竟?fàn)嶦LISA"中，抗體與含有抗原(即，Cyr61)的樣品 孵育。然后抗原-抗體混合物與包被了抗原(即，Cyr61)的固相(例如，
微量滴定板)接觸。樣品中存在的抗原越多，越少的游離抗體可用于結(jié) 合所述固相。然后向所述固相添加標(biāo)記的(例如，酶連4妻的)二級抗體 來確定結(jié)合到固相的初級抗體的數(shù)量。
在"免疫組織化學(xué)分析"中，通過將所述組織暴露于對要分 析的蛋白是特異性的抗體，測試組織切片的特定蛋白質(zhì)。然后通過許多 已知方法的任一種來顯現(xiàn)抗體，來確定蛋白質(zhì)的存在和存在的數(shù)量。用 于顯現(xiàn)抗體的方法的實例有，例如，通過與所述抗體連接的酶(例如， 熒光素酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或P半乳糖苷酶)或化學(xué)方法(例 如，DAB/底物顯色)。
根據(jù)實踐者的偏愛和基于本公開，可以使用其他技術(shù)來檢測 本發(fā)明的生物標(biāo)記物。這種技術(shù)之一是Western印跡(Towbin等人，Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 ( 1979)),其中適當(dāng)處理的樣品在SDS-PAGE 凝膠上跑動，之后轉(zhuǎn)移到固相支持物，例如硝酸纖維素膜。然后可檢測 標(biāo)記的特異性結(jié)合Cyr61的抗體可以用于評定Cyr61水平，其中來自可 檢測標(biāo)記的信號的強度相應(yīng)于存在的Cyr61的數(shù)量。例如通過密度測定 法可以測定所述水平。#浮法
此外，可以使用質(zhì)語法，例如MALDI/TOF (飛行時間)、 SELDI/TOF、液相色i普-質(zhì)譜法(LC-MS )、氣相色語-質(zhì)i普法(GC-MS )、 高效液相層析-質(zhì)譜法(HPLC-MS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)語法、核磁共振波 譜法或串聯(lián)的質(zhì)譜法(例如，MS/MS、 MS/MS/MS、 ESI-MS/MS,等等) 來檢測Cyr61。參見，例如，美國專利申請NO: 20030199001、 20030134304、 20030077616，通過引用將它們合并在此。
質(zhì)譜方法是本領(lǐng)域公知的，已經(jīng)被用于定量和/或鑒定蛋白質(zhì) (參見,例如Li等人，(2000) Tibtech 18:151-160; Rowley等人，(2000 ) Methods 20: 383-397和Kuster and Ma皿(1998 ) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400)。進(jìn)一步的，已經(jīng)開發(fā)了允許分離的蛋白質(zhì)的至少部 分起始測序的質(zhì)譜技術(shù)。Chait等人，Science 262:89-92 ( 1993 ); Keough 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 ( 1999);在Bergman, EXS 88:133-44 ( 2000)中綜述。
在某些實施方式中，使用氣相離子分光光度計。在其他實施 方式中，使用激光-脫附/電離質(zhì)譜法來分析樣品?，F(xiàn)代的激光脫附/電離 質(zhì)譜法("LDI-MS，，)可以按兩種主要的變體來操作基質(zhì)幫助的激光 脫附/電離("MALDI")質(zhì)譜法和表面增強的激光脫附/電離("SELDP )。 在MALDI中，被分析物與含有基質(zhì)的溶液混合， 一滴所述液體置于基 底的表面上。然后基質(zhì)溶液與所述生物分子共結(jié)晶?；妆徊迦氲劫|(zhì)譜 儀中。將激光能量導(dǎo)向基底表面，在此它脫附并離子化所述生物分子而 不顯著地破碎它們。然而，MALDI作為分析工具有局限性。它不提供 分餾樣品的手段，基質(zhì)材料可能影響檢測，特別是對于低分子量的被分 析物。參見，例如，美國專利NO. 5,118,937 (Hillenkamp等人，)，和 美國專利NO. 5,045,694 ( Beavis & Chait)。
在SELDI中，基底表面被修飾，使得它是脫附過程中的主動 參與者。在一個變體中，所述表面用選擇性結(jié)合目標(biāo)蛋白的吸附試劑和 /或捕獲試劑衍生化。在另一種變體中，所述表面用激光轟擊時不脫附的 能量吸收分子來衍生化。在另一種變體中，所述表面用分子衍生化，所 述分子結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)，并且含有在應(yīng)用激光時被打斷的光解的鍵。在 這些方法的每一種中，衍生化試劑一般被定位在施加樣品的基底表面上 的特定位置。參見，例如美國專利No. 5,719,060和WO 98/59361。例如， 通過使用SELDI親和性表面來捕獲被分析物并向捕獲的被分析物添加 含有基質(zhì)的液體來提供能量吸收材料，可以組合這兩種方法。
關(guān)于質(zhì)語儀的其他信息，參見，例如Principles of Instrumental Analysis, 3rd edition., Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985;和Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4.sup.th ed. Vol. 15 ( John Wiley & Sons, New York 1995 ) , pp. 1071-1094。
檢測標(biāo)記物或其他物質(zhì)的存在一般將包括信號強度的檢測。 隨后，這可以反映結(jié)合到基底上的多肽的數(shù)量和性質(zhì)。例如，在某些實 施方式中，可以比較第一樣品和第二樣品的光譜的峰值信號強度(例 如，視覺地，通過計算機分析，等等)，來確定特定生物分子的相對數(shù) 量。可以使用軟件程序例如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.)來幫助分析質(zhì)語。質(zhì)譜4義和它們的技術(shù)是本領(lǐng)域的 技術(shù)人員公知的。
本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員理解，質(zhì)語儀的任何組件(例如，脫 附源、質(zhì)量分析器、檢測，等等)和各種樣品制品可以與在此描述的其 他適合的組件或制品，或與本領(lǐng)域已知的那些組合。例如，在某些實施
方式中對照樣品可以含有重原子(例如，13c),從而允許測試樣品在同一質(zhì)譜法進(jìn)行中與已知的對照樣品混合。
在一個優(yōu)選的實施方式中，使用激光脫附時間飛行(TOF) 質(zhì)譜儀。在激光脫附質(zhì)譜法中，具有結(jié)合的標(biāo)記物的基底被導(dǎo)入進(jìn)氣系 統(tǒng)中。通過來自電離源的激光將標(biāo)記物脫附和電離成氣相。通過離光學(xué) 的組件收集產(chǎn)生的離子，然后在時間飛行質(zhì)量分析器中，離子被加速通 過短的高壓電場并飄入高真空倉室中。在高真空倉室的遠(yuǎn)端，；故加速的 離子在不同的時間擊打在靈敏的檢測器表面。由于飛行的時間是離子質(zhì) 量的函數(shù)，在離子形成和離子檢測器撞擊之間經(jīng)過的時間可用于鑒定特 定的質(zhì)量電荷比的分子的存在或不存在。
在某些實施方式中，在第一和第二樣品中存在的 一種或多種 生物分子的相對數(shù)量通過使用可編程的數(shù)字計算機執(zhí)行算法來部分地 確定。所述算法在第一質(zhì)譜和第二質(zhì)譜中鑒定至少一個分值。所述算法 然后比較第一質(zhì)譜的峰值信號強度和第二質(zhì)譜的峰值的信號強度。相對 信號強度是存在于第一和第二樣品中的生物分子數(shù)量的指示。含有已知 數(shù)量的生物分子的標(biāo)準(zhǔn)物可以作為第二樣品被分析來提供對第 一樣品 中存在的生物分子數(shù)量的更好的定量。在某些實施方式中，也可以測定 第一和第二樣品中生物分子的同一性。
在一個優(yōu)選的實施方式中，通過MALDI-TOF質(zhì)譜法來測量 生物標(biāo)記物水平。 戎#
用于本發(fā)明的抗體可以從商業(yè)來源獲得。做為選擇，可以針 對Cyr61、或生物標(biāo)記物多肽的一部分來產(chǎn)生抗體。如，通過單克隆抗體生產(chǎn)(Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, the Netherlands ( 1984 ); St. Groth 等人，，J. Immunology, ( 1990) 35:1-21; and Kozbor等人，Immunology Today ( 1983 ) 4:72)。通過本領(lǐng)域公知的方法，通過使用蛋白質(zhì)的抗 原性部分來篩選抗體庫，例如噬菌體顯示庫，也可以容易地獲得抗體。 例如，美國專利5,702,892 (U.S.A. Health & Human Services)和WO 01/18058 ( Novopharm Biotech Inc.) />開了用于產(chǎn)生抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域片
段的噬菌體展示庫和選擇方法。 發(fā)解試浙盆
本發(fā)明還涉及用于上皮來源的癌癥的檢測和預(yù)后評估的商業(yè) 性試劑盒。所述試劑盒可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何結(jié)構(gòu)，并且對 于進(jìn)行在此描述的檢測Cyr61的一種或多種方法是有用的。所述試劑盒 是方便的，因為它們提供了如果不是全部也是大多數(shù)的基本試劑，用于 進(jìn)行尿液樣品中Cyr61檢測的分析。此外，所述分析優(yōu)選的與標(biāo)準(zhǔn)物或 多個標(biāo)準(zhǔn)物同時進(jìn)行，所述標(biāo)準(zhǔn)物被包括在試劑盒內(nèi)，例如，預(yù)定數(shù)量 的Cyr61蛋白，使得測試的結(jié)果可以被定量或校準(zhǔn)。
所述試劑盒包括檢測Cyr61水平的手段，例如抗體、或抗體 片段，其選擇性地結(jié)合Cyr61蛋白。所述診斷分析試劑盒優(yōu)選的配置為 標(biāo)準(zhǔn)的雙抗體結(jié)合形式，其中一個Cyr61特異性抗體捕獲患者樣品中的 Cyr61，另一個Cyr61特異性抗體被用于檢測捕獲的Cyr61。例如，捕獲 抗體被固定在固相上，例如分析平板、分析孔、硝化纖維膜、珠子、量 液桿、或洗脫柱的成分。所述第二抗體，即檢測抗體， 一般用可檢測的 標(biāo)記來標(biāo)簽，例如量熱試劑或放射性同位素。
在一個優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒包含檢測尿液樣品中 Cyr61水平的手段。在特定的實施方式中，所述試劑盒包括具有固定在 其上的抗Cyr61抗體的"量液桿"，所述抗體同一性結(jié)合Cyr61蛋白。 然后可以使用例如，用量熱試劑或放射性同位素可^r測標(biāo)記的第二抗體 來檢測特異性結(jié)合的Cyr61蛋白。
在其他實施方式中，分析試劑盒可以采用(但不限于)以下 技術(shù)竟?fàn)幮院头蔷範(fàn)幮苑治觥⒎派涿庖叻治?RIA)、生物發(fā)光和化 學(xué)發(fā)光分析、熒光分析、夾心分析、免疫放射分析、斑點印跡、酶連接 分析，包括ELISA、微量滴定板和免疫細(xì)胞化學(xué)。對于每種試劑盒，分 析的范圍、敏感性、精確度、可靠性、特異性和重現(xiàn)性通過本領(lǐng)域技術(shù) 人員7>知的方法來確定。
以上描述的分析試劑盒將進(jìn)一 步提供使用說明和為尿液樣本 設(shè)計的容器。實施例
通過以下非限制性的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
提供這些實施例來幫助理解本發(fā)明，不看作是本發(fā)明的限制。實施例1: Cyr61作為卵巢和乳腺癌的尿生物標(biāo)記物的鑒定
我們已經(jīng)鑒定了 Cyr61蛋白可作為卵巢癌的生物標(biāo)記物。特 別地，我們顯示了來自患有良性和惡性卵巢癌的患者的尿液樣品中，與 來自不患有癌癥的患者的對照尿液樣品相比，存在著Cyr61水平的提高 (附圖la和lb)。附圖la顯示了卵巢癌的免疫印跡檢測；Control lanes, 對照樣品；Benign lanes,來自含有良性癌癥患者的尿液；lanes Malignant lanes,來自含有惡性癌癥患者的尿液。附圖lb顯示了在來自卵巢癌患 者中免疫印跡檢測Cyr61免疫反應(yīng)性蛋白數(shù)量的柱形圖(每個階段 n=12)。
我們還進(jìn)行了來自乳腺癌患者的尿液中Cyr61的Western印 跡(附圖3)。在來自患有非擴散性(DCIS)和侵入性乳腺癌、以及非 典型的導(dǎo)管癌(ADH)的患者的尿液樣品中，與來自不患有癌癥的患者 的對照尿液樣品相比，存在著Cyr61水平的提高。實施例2: Cyr61作為血管生成轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)物
黃體的形成和死亡分別伴隨著顯著的血管形成和退化過程。 因而這種內(nèi)分泌腺作為闡明轉(zhuǎn)動血管生成開和關(guān)的分子機制的研究模 型是有用的。在當(dāng)前的研究中，我們使用了 PGF2oc來誘導(dǎo)第6天和第 IO天黃體的退化。在PGF2a施用后30分鐘收集黃體組織?；蛭㈥嚵?分析表明抗生成誘導(dǎo)物Cyr61在PGF2ot注射后第6和10天CL中差異 表達(dá)。半定量的RT-PCR進(jìn)一步顯示這個基因在早期CL中相比中期和 晚期以顯著更高的(p<0.01)水平表達(dá)。此外，Cyr61表達(dá)在黃體退化 期間降低。免疫組織化學(xué)揭示，Cyr61蛋白定位在黃體內(nèi)皮和類固醇生 成細(xì)胞中。為了研究Cyr61的調(diào)節(jié)，從中周期CL分離黃體類固醇生成 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并用PGF2cc和TNFa處理。雖然PGF2 cc對于黃體類 固醇生成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的Cyr61表達(dá)沒有影響，TNFoc刺激了黃體 內(nèi)皮細(xì)胞中的Cyr61表達(dá)，但降低了其在黃體類固醇生成細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄 水平?？傊珻yr61在早期CL中的高表達(dá)表明，這個基因可能與黃體
血管生成相關(guān)。在退行CL中Cyr61的降低的水平表明，這個基因的減 量調(diào)節(jié)可能是黃體退化的檢查點。此外，TNFa差異調(diào)節(jié)黃體內(nèi)皮細(xì)胞 和類固醇生產(chǎn)細(xì)胞中的Cyr61表達(dá)。因而，該數(shù)據(jù)表明Cyr61是血管生 成轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，在黃體的生命期期間轉(zhuǎn)動血管生成"開，，和"關(guān)"。實施例III: Cyr61作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT )的調(diào)節(jié)物
為了評定在侵略性癌癥的發(fā)展中Cyr61的潛在作用，我們制 備了過量表達(dá)Cyr61的穩(wěn)定的OV5 (卵巢細(xì)胞)細(xì)胞系(OV5-Cyr61 )。 我們發(fā)現(xiàn)，已知涉及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)和遷移/侵入的許多分子受到 Cyr61調(diào)節(jié)。使用RT-PCR和過量表達(dá)Cyr61的細(xì)胞系，我們發(fā)現(xiàn)，Cyr61 的增量調(diào)節(jié)改變了類固醇受體、整聯(lián)蛋白受體、VEGF和金屬蛋白酶的 表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。例如，當(dāng)AR表達(dá)被減量調(diào)節(jié)時，類固醇受體ER oc表達(dá)被增量調(diào)節(jié)；MMP-9表達(dá)(RT-PCR)和活性(經(jīng)由酶色譜)被 增量調(diào)節(jié)，以及MMP-1、 MMP-8、 MMP-3、 MMP-23、 MMP-19表達(dá)， 而對MMP-13、 MMP-10和MT1-MMP表達(dá)似乎沒有影響；MMP-7表達(dá) 被減量調(diào)節(jié)；06、 |33、 oc6和ocV整聯(lián)蛋白表達(dá)被增量調(diào)節(jié)；VEGF-A和VEGF-C在這些細(xì)胞系中增量調(diào)節(jié)。
使用OV5-細(xì)胞系，通過ELISA分析，我們進(jìn)一步確定了， Cyr61刺激VEGF-A蛋白水平(數(shù)據(jù)未顯示)。使用RT-PCR,我們還 分析EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail被增量調(diào)節(jié)，而SIP-1、 Twist和Slug 似乎不受影響。
在Cyr61涉及侵略性癌癥發(fā)展的進(jìn)一步的證明中，我們進(jìn)行 了刮擦遷移和腫瘤侵入分析。采用修改的刮擦遷移分析來評定細(xì)胞運動 性。簡要地，載體對照和過量表達(dá)CYR61的OVCAR-5細(xì)胞培養(yǎng)在60mm 陪氏培養(yǎng)皿中。在細(xì)胞匯合之后，通過無菌的移液管尖端進(jìn)行一次刮擦 (無細(xì)胞區(qū)域)。通過用培養(yǎng)基洗滌三次清除漂浮細(xì)胞。用新鮮培養(yǎng)基 孵育細(xì)胞5小時。在孵育之前和之后記錄刮擦的兩個邊緣之間的距離。 通過距離除以孕育時間來計算細(xì)胞運動速率。這個分析的結(jié)果清楚地顯 示Cyr61的過量表達(dá)提高了運動性。過量表達(dá)Cyr61的細(xì)胞與不過量表 達(dá)Cyr61的細(xì)胞相比遷移兩倍遠(yuǎn)。
使用24孔肺瘤侵入系統(tǒng)(DB Bioscience, Bedford, MA )根據(jù) 廠家的手冊評估過量表達(dá)CYR61的細(xì)胞的侵入性。OVCAR-5載體對照
和過量表達(dá)CYR61的細(xì)胞生長到70%匯合，然后胰蛋白酶化并重懸浮 在無血清培養(yǎng)基中。將5x 104個細(xì)胞播種到頂部腔室中。完全培養(yǎng)基 (750 yL)用作化學(xué)吸引劑，添加到下腔室中。在37。C、 5%(:02的孵 化器中孵育24小時之后，從上腔室除去培養(yǎng)基。將插入板轉(zhuǎn)移到含有 0.5ml/孔Hanks緩沖鹽溶液(HBSS )中4 ju g/ml Calcein AM的新24孔 平板中，在37。C、 5Q/oC02聘育l小時。BD FluoroBlok膜僅容許侵入通 過BD MatrigelTM膜的標(biāo)記的細(xì)胞在熒光顯微鏡下顯現(xiàn)。這個分析的結(jié)果 顯示Cyr61的過量表達(dá)提高了侵入性(數(shù)據(jù)未顯示)。
因而，Cyr61涉及與侵略性癌癥中發(fā)現(xiàn)的相符的細(xì)胞表型的 發(fā)育。參考文獻(xiàn)在此和整個說明書中引用的參考文獻(xiàn)通過引用將它們合并在此。1. Evtimova V, Zeillinger R, Weidle UH. Identification of genes associated with the invasive status of human mammary carcinoma cell lines by transcriptional profiling Tumour Biol. 2003 Aug-Sep;24 ( 4 ) :189-98.2. Planque N, Perbal B. A structural approach to the role of CCN (CYR61/CTGF/NOV) proteins in tumourigenesis. Cancer Cell Int. 2003Aug22;3 ( 1 ) :15.3. Menendez JA, Mehmi I, Griggs DW, Lupu R The angiogenic factor CYR61 in breast cancer: molecular pathology and therapeutic perspectives. Endocr Relat Cancer. 2003 Jun;lO ( 2 ) :141-52. Review.4. Tsai MS, Bogart DF, Castaneda JM, Li P, Lupu R. Cyr61 promotes breast tumorigenesis and cancer progression. Oncogene. 2002 Nov 21;21 ( 53 ) :8178-85.5. Tsai MS, Bogart DF, Li P, Mehmi I, Lupu R. Expression and regulation of Cyr61 in human breast cancer cell lines. Oncogene. 2002 Jan 31;21 (6) :964-73.6. Tsai MS and Ruth Lupu. An angiogenic factor, in breast cancer tumor progression. International Journal of Molecular Medicine, 2000, 6: S22 Abstract,7. Xie D, Miller CW, O'Kelly J, Nakachi K, Sakashita A, Said JW,Gornbein J, Koeffler HP. Breast cancer. Cyr61 is overexpressed, estrogen-inducible, and associated with more advanced disease.8. J Biol Chem. 2001 Apr 27;276 ( 17) :14187-94. pub 2001 Jan 31.9. Xie D, Nakachi K, Sakashita A., Higashi, Miller CW, and Phillip Koeffler. CYR61, an angiogenic induce, is overexpressed and estrogen inducible in breast cancer. Proc. Amer. Assoc, for Cancer Research, 2000， 41: 338. Abstract10. Tsai等人，Cyr61 induces breast tumorigenicity and promotes breast cancer progression through regulation of the MAPK and AKT signaling pathways. Proc. Amer. Assoc, for Cancer Research, 2002,43: 673. Abstract11. Perbal等人，Report on the second international workshop on the CCN family of genes. J. Clin. Pathol: Mol Pathol. 2003， 56: 80-85.12. Cayer-Lelievre等人，Report on the first international workshop on the CCN family of genes J. Clin. Pathol: Mol Pathol. 2001, 54: 105-107.
權(quán)利要求
1.用于促進(jìn)個體的上皮來源的癌癥的診斷的方法，所述方法包括a.測量在獲自所述個體的測試尿液樣品中存在的Cyr61水平；b.比較所述測試尿液樣品中的Cyr61水平和對照尿液樣品中存在的Cyr61水平；其中與對照樣品中Cyr61水平相比在測試樣品中更高的Cyr61水平是上皮來源的癌癥的指示。
2. 用于懷疑患有或患有上皮來源的癌癥的個體的預(yù)后評估的方 法，所述方法包括a. 測量在獲自所述個體的測試尿液樣品中存在的Cyr61水平來獲得第 一樣品；b. 比較步驟(a)中確定的水平和在更晚的時點獲自同一個體的尿 液樣品中的Cyr61水平；以及c. 根據(jù)步驟(b)中的比較來評估所述患者的預(yù)后，其中在更晚的 時點獲自同一個體的尿液樣品中更高的Cyr61水平指示發(fā)展更為侵略性 形式的癌癥。
3. 權(quán)利要求l-2任一項的方法，其中所述上皮來源的癌癥選自乳腺 癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌癥、 胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌、皮 膚癌、前列腺和腎臟細(xì)胞癌。
4. 權(quán)利要求l-2任一項的方法，其中Cyr61蛋白的水平通過包括以 下步驟的方法來測量a. 用特異性結(jié)合Cyr61的基于抗體的結(jié)合部分接觸所述測試樣品 或其制備物來形成抗體-Cyra復(fù)合物；以及b. 檢測所述復(fù)合物的存在，從而測量存在的Cyr61的水平。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中使用可檢測的標(biāo)記物來標(biāo)記所述基 于抗體的結(jié)合部分。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述標(biāo)記選自放射性標(biāo)記物、半抗 原標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物和酶標(biāo)記物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述基于抗體的結(jié)合部分是抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
9. 用于檢測尿液樣品中的Cyr61的試劑盒，其包含容納尿液樣品的容器，和至少一種特異性結(jié)合Cyr61的抗體。
10. 權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述試劑盒包含特異性結(jié)合Cyr61 的兩種抗體， 一種抗體固定在固相上， 一種抗體#皮可4企測地標(biāo)記。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9的試劑盒，其還包括使用說明書。
12. —種指導(dǎo)個體的治療的方法，其包括讓個體測試獲自所述個體 的尿液樣品中的Cyr61水平，其中臨床醫(yī)師審查該結(jié)果，如果個體的尿 液樣品具有比對照樣品中的Cyr61水平更高水平的Cyr61,所述臨床醫(yī) 師指導(dǎo)所述個體治療上皮來源的癌癥。
全文摘要
尿液Cyr61蛋白水平在患有上皮來源癌癥例如乳腺癌和卵巢癌的患者中被增量調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明涉及上皮來源的癌癥的預(yù)后評估和診斷的方法。進(jìn)一步的，在尿液樣品中檢測的Cyr61蛋白的數(shù)量與疾病狀況相關(guān)，從而Cyr61水平可以用于預(yù)測癌癥的存在以及轉(zhuǎn)移可能性。因而，測量尿液中的Cyr61水平提供了快速、簡單和安全的篩選，其可以用于患者中癌癥的診斷和預(yù)后。
文檔編號G01N33/53GK101120252SQ200680005158
公開日2008年2月6日 申請日期2006年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月18日
發(fā)明者B·張, M·A·摩西 申請人:兒童醫(yī)療中心有限公司