專利名稱：：生腱蛋白-w用作結(jié)腸癌生物標(biāo)記的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了針對結(jié)腸癌的新的血液、血漿或血清生物標(biāo)記。
背景技術(shù)：
：腫瘤發(fā)生和發(fā)展不僅僅依賴于癌細胞中突變獲得和積累所導(dǎo)致的遺傳改變(綜述請參見U)，還依賴于轉(zhuǎn)化的上皮和腫瘤基質(zhì)之間的交互應(yīng)答(cross-talk)，其由多種細胞類型(例如活化的成纖維細胞、血管生成內(nèi)皮細胞、浸潤的炎性細胞)和經(jīng)修飾的細胞外基質(zhì)(ECM)組成3’4。最近幾年，已經(jīng)認識到癌細胞能夠通過分泌促進允許生長的微環(huán)境形成的可溶性因子來改變并活化其鄰近的基質(zhì)，該微環(huán)境是完全的腫瘤表現(xiàn)所需的5_7。在大多數(shù)實體瘤中活化的成纖維細胞從頭表達粘附調(diào)節(jié)ECM分子生腱蛋白_C7_9。生腱蛋白-C的腫瘤促進活性包括通過阻斷多配體蛋白聚糖_4促進癌細胞的增殖w消除癌細胞在纖連蛋白上的鋪展“1’11，誘導(dǎo)血管生成12，以及通過上調(diào)MMP-12增強細胞侵襲性13。另外，生腱蛋白-C可引發(fā)致癌信號發(fā)放通路，例如EGFR14’15、ERK/MAPK和Wnt16。重要的是，生腱蛋白-C是鑒定轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞，尤其轉(zhuǎn)移到肺的乳腺癌細胞基因表達特征的一部分17。因為在成年生物體中生腱蛋白-C不存在或者以非常低的水平表達，但是在腫瘤中重新表達18，所以有理由認為在大多數(shù)癌癥中生腱蛋白-C表達的提高可反映在體液中生腱蛋白-C水平的提高上。事實上，已有報道稱在不同癌癥類型的患者血清中生腱蛋白-C水平提高，所述癌癥類型包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌或結(jié)腸直腸癌、轉(zhuǎn)移性黑素瘤、頭和頸的鱗狀細胞癌、以及非小細胞肺癌19_25。但是，癌癥患者血清中生腱蛋白-C的值散布在一個寬的范圍內(nèi)，這些患者中有很大一部分具有正常的濃度，導(dǎo)致了生腱蛋白-C測定對檢測癌癥來說靈敏度較低。此外，高血清生腱蛋白-C水平與非癌癥性肝病(包括肝炎和肝硬化)明顯相關(guān)聯(lián)26_29，以及與提高水平的C-反應(yīng)蛋白(CRP)明顯相關(guān)聯(lián)21，該蛋白為感染、組織損傷或其他炎癥疾病導(dǎo)致表達的急性期蛋白質(zhì)3°’31。因此，需要可靠的血液或血清癌癥生物標(biāo)記。最初在紋斑魚中鑒定到生腱蛋白-W，在其中所述蛋白質(zhì)顯示與生腱蛋白-C共表達自神經(jīng)嵴細胞和體節(jié)中32。最近，鼠33和雞34生腱蛋白-W已有描述，在這兩種動物中，生腱蛋白-W在發(fā)育中的和成體平滑肌細胞和骨中表達。雞生腱蛋白-W的功能包括調(diào)節(jié)顱蓋細胞粘附以及體外擴散34。最先將生腱蛋白-W表達與腫瘤存在相關(guān)聯(lián)的研究是在小鼠中進行的。使用致癌基因誘導(dǎo)的乳腺癌模型，顯示生腱蛋白-W在腫瘤基質(zhì)中高表達，其同時顯著表達生腱蛋白-C35(也見于W0-A-03/080663)。功能性研究鑒定出小鼠生腱蛋白-W為促進乳腺癌細胞移動的分子35。最近，本發(fā)明人確認了在人乳腺癌組織的基質(zhì)中存在生腱蛋白-w36。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)生腱蛋白-W的存在不限于癌癥基質(zhì)，且生腱蛋白-W可用作結(jié)腸癌的血液或血清生物標(biāo)記。此外，在具有較高結(jié)腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者中生腱蛋白-W的血液或血清水平較高。因此，本發(fā)明提供了一種檢測、診斷或預(yù)后結(jié)腸癌的方法，其包括測定獲得自個體的血液、血漿或血清樣品中生腱蛋白-W蛋白質(zhì)的濃度，以及(b)將步驟(a)中測定的濃度與健康個體的血液、血漿或血清中生腱蛋白-W蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)值進行比較，其中相比于健康個體的血液、血漿或血清中生腱蛋白-W蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)值，生腱蛋白-W濃度增加指示結(jié)腸癌的存在。本發(fā)明還涵蓋用于在血液、血漿或血清樣品中檢測、診斷或預(yù)后結(jié)腸癌的試劑盒，其包含生腱蛋白-W特異性的抗體或其片段。因此，本發(fā)明的一個實施方案是生腱蛋白-W的血液、血漿或血清濃度用作結(jié)腸癌生物標(biāo)記的用途。本發(fā)明的另一個實施方案涵蓋生腱蛋白-W特異性的抗體或其片段用于通過測定生腱蛋白-W蛋白質(zhì)血液、血漿或血清濃度來診斷結(jié)腸癌的用途。因此，本發(fā)明的另一個實施方案是生腱蛋白-W作為結(jié)腸癌生物血液、血漿或血清生物標(biāo)記的用途。圖1、抗生腱蛋白-W抗體的綜述(a)人TNW結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的示意圖。用線顯示用作產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體之抗原的重組全長TNW及其片段。已使用下列符號來表示所述結(jié)構(gòu)域七殘基重復(fù)序列(波狀線)、EGF樣重復(fù)(菱形)、FNIII結(jié)構(gòu)域(框)、復(fù)制產(chǎn)生的FNIII結(jié)構(gòu)域(黑框)、血纖蛋白原球形結(jié)構(gòu)域(globe，圈)。(b)考馬斯染色的凝膠(1-5泳道)和Western印跡(6_10泳道)。(1，6)TNW條件培養(yǎng)基10微升，(2，7)纖連蛋白2.5微克，(3，8)血纖蛋白原2.5微克，(4，9)純化的TNC2.5微克，(5)純化的TNW2.5微克以及(10)純化的hTNW500納克。免疫印跡分析顯示檢測抗體PAb(FL)特異性識別TNW，并且不與其他的測試蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。(c)可以通過與10微克/毫升純化的生腱蛋白-W(FLhTNW)—起孵育阻斷pAb(FL)與純化的生腱蛋白-W(W)的反應(yīng)性，但是與10微克/毫升的細菌表達FNIII3F/4片段一起孵育不阻斷，而這兩種生腱蛋白-W制備物都可阻斷pAb(3F/4)的反應(yīng)性(d)顯示使用mAb29A作為捕獲抗體、pAb(FL)作為檢測抗體和連續(xù)稀釋的純化TNW的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線的雙對數(shù)(log-log)圖。達到約0.005mg/lTNW濃度的檢出限。圖2、生腱蛋白-W血清水平(a)顯示健康志愿者(η=25，均值0.389+/-0.145mg/l)和非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者(η=17，均值0.794+/-0.38mg/l)的TNW血清水平。相比于志愿者，結(jié)腸直腸癌患者中的平均生腱蛋白-W水平(橫線)有統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加。(b)顯示健康個體和結(jié)腸直腸癌患者的血清TNC水平。它們顯示，相比于健康個體(η=18，均值0.798+/-0.24mg/l)，平均血清TNC水平(η=17，均值0.98+/-0.24mg/l)增加。(c)顯示非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者(η=16，均值0.682+/-0.44mg/l)和健康志愿者中(η=25，均值0.389+/-0.145mg/l)的血清TNW水平。橫線顯示平均生腱蛋白值。圖3、結(jié)腸直腸癌的生腱蛋白-W表達(a)通過免疫印跡檢測十一個結(jié)腸直腸癌提取物(T)和三個正常結(jié)腸組織(N)中TNW和TNC的存在。分析顯示正常黏膜中TNC低分子量同種型的基礎(chǔ)表達，以及腫瘤組織中大多數(shù)大TN變體的上調(diào)。顯示出于比較的目的上樣的重組高分子量TNC同種型的位置(箭頭)。在大部分的腫瘤組織中可檢出TNW，但是在正常結(jié)腸黏膜中不可檢出。(b)患者L的冷凍切片的免疫組織化學(xué)分析證實了免疫印跡的結(jié)果，顯示腫瘤基質(zhì)中對兩種生腱蛋白都強染色。然而，在正常組織中對TNW沒有檢出染色，在黏膜肌層中觀察到TNC的強染色。校正線250微米。N正常；T腫瘤。圖4、冷凍結(jié)腸組織微陣列顯示所示患者冷凍結(jié)腸TMA的使用抗TNC的mAb、抗TNW的pAb(3F/4)以及蘇木精伊紅染色的切片(H&E)的免疫組織化學(xué)(參見表III)。正常結(jié)腸黏膜(患者37)是TNW陰性，但是TNC陽性。TNC也在結(jié)腸平滑肌中強表達(患者36)。患者26顯示為腫瘤與相鄰正常組織邊界的實例。在所分析的腫瘤患者1-32中(表III)，發(fā)現(xiàn)TNW獨特地定位于腫瘤基質(zhì)。在一些患者中，TNW陽性區(qū)域似乎是TNC陽性區(qū)域的子集(患者12)。患者15和5顯示大(+++)區(qū)域的生腱蛋白陽性。患者4和13分別顯示中等(++)至低(+)區(qū)域的生腱蛋白-W染色。一般說來，染色與所存在的腫瘤基質(zhì)的量相關(guān)聯(lián)。發(fā)明詳述最近，本發(fā)明人評估了生腱蛋白-W在人乳腺癌組織中的存在36。繼續(xù)對其進行研究，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)生腱蛋白-W不限于癌癥基質(zhì)以及生腱蛋白-W可用作結(jié)腸癌的血液或血清生物標(biāo)記。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在具有較高結(jié)腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者中生腱蛋白-W的血液或血清水平較高。因此，本發(fā)明提供了一種檢測、診斷或預(yù)后結(jié)腸癌的方法，其包括測定獲得自個體的血液、血漿或血清樣品中生腱蛋白-W蛋白質(zhì)的濃度，以及(b)將步驟(a)中測定的濃度與健康個體的血液、血漿或血清中生腱蛋白-W蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)值進行比較，其中相比于健康個體的血液、血漿或血清中生腱蛋白-W蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)值，生腱蛋白-W濃度增加指示可能存在結(jié)腸癌?！把?、血漿或血清樣品”是所分析或所測定的物質(zhì)，其可以但不一定接受預(yù)處理，以提供可分析形式的生腱蛋白-W。這需要本領(lǐng)域中已知的方法(例如參見ScopesProteinPurification!PrinciplesandPractice,第二版(Springer-Verlag,N.Y.,1987))。在本發(fā)明的較寬方面，對血液、血漿或血清樣品的收集和操作沒有限制，只要保持一致性即可。通過本領(lǐng)域已知的方法獲得樣品。通過使用多種技術(shù)可確保血液、血漿或血清樣品中生腱蛋白-W或生腱蛋白-W活性測定的一致性。例如，為了控制每個樣品的品質(zhì)，可使用另一種酶活性比如堿性磷酸酶作為內(nèi)參。另外，可在樣品中與生腱蛋白-W同時測定內(nèi)標(biāo)，以作為測定條件的對照。因此，所述分析或測定步驟可包括檢測樣品中的對照蛋白質(zhì)，任選地將所得的生腱蛋白-W的值相對于對照蛋白質(zhì)所得的信號進行歸一化?？赏ㄟ^使用本領(lǐng)域中已知的方法檢測生腱蛋白-W蛋白質(zhì)，來檢測血液、血漿或血清樣品中生腱蛋白-W的存在。在本發(fā)明中，對用于測定生腱蛋白-W或生腱蛋白-W活性的測定類型沒有限制。例如，可通過使用生腱蛋白-W特異性抗體的免疫測定來檢測生腱蛋白-W。所述抗體可用于，例如，雙向凝膠的Wetern印跡，其中通過總細胞蛋白質(zhì)或部分純化蛋白質(zhì)的酶聯(lián)免疫測定或點印跡(抗體夾心法)測定鑒定所述蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，生腱蛋白-W的血液、血漿或血清濃度以本領(lǐng)域公知的方法通過ELISA進行測定。樣品濃縮和蛋白質(zhì)純化的方法描述于參考文獻中(參見Scopes，1987)。例如，如果需要，可通過用硫酸銨沉淀或通過將血液、血漿或血清樣品穿過市售蛋白質(zhì)濃縮濾器例如Amicon或Millipore超濾單元來濃縮血液、血漿或血清樣品中存在的生腱蛋白-W。血液、血漿或血清樣品可施用到合適的純化基質(zhì)上，例如陰離子或陽離子交換樹脂，或者凝膠過濾基質(zhì)，或接受制備型凝膠電泳。在此情況下，在測定樣品中生腱蛋白-W量時需要考慮每個純化步驟后的生腱蛋白-W和蛋白質(zhì)產(chǎn)率。在本發(fā)明的方法中，相比于健康個體的血液、血漿或血清中生腱蛋白-W濃度的標(biāo)準(zhǔn)值，步驟(a)中所測定的生腱蛋白-W濃度增加至少約兩倍指示結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的可能性較高。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解此閾值可根據(jù)情況增加。因此，該增加可以是例如，至少約2.5、3,3.5、4、4.5或5倍。出于本發(fā)明的目的，“約”意為+/-10%。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，也可測定獲得自個體的血液、血漿或血清樣品中的生腱蛋白-C的濃度，并且與健康個體的血液、血漿或血清中生腱蛋白-C濃度的標(biāo)準(zhǔn)值進行比較。可根據(jù)本文對生腱蛋白-W的記載，測定生腱蛋白-C的濃度?？膳c生腱蛋白-W相類似地測定生腱蛋白-C的濃度?；蛘?，可使用不同的方法測定血液、血漿或血清樣品中的兩種蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的方法中，可使用生腱蛋白-W和/或生腱蛋白-C特異性抗體或其片段測定生腱蛋白-W和/或生腱蛋白-C蛋白質(zhì)的濃度。例如，可使用生腱蛋白-W特異性的抗體測定生腱蛋白-W，可使用其他生腱蛋白分子特異性的抗體進行對照測定。本發(fā)明還提供了用于通過測定生腱蛋白-W蛋白質(zhì)的血液、血漿或血清濃度來診斷結(jié)腸癌的生腱蛋白-W特異性的抗體或其片段。產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域公知的?？赏ㄟ^用免疫原性量的所述多肽免疫動物容易地獲得生腱蛋白-W特異性的抗體。因此，本發(fā)明的抗體包括通過免疫動物獲得的多克隆抗體和抗血清，可通過Western印跡、ELISA、免疫染色或其他本領(lǐng)域已知的常規(guī)過程確認其特異性識別生腱蛋白-W。眾所周知，如果可通過致敏獲得多克隆抗體，則可從致敏動物的淋巴細胞獲得雜(H6AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress，1988)。因此，本發(fā)明還提供了用于通過測定生腱蛋白_W蛋白質(zhì)的血液、血漿或血清濃度來診斷結(jié)腸癌的生腱蛋白-W特異性的單克隆抗體或其片段。產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其記載于科學(xué)和專利文獻中，參見，例如Coligan,CurrentProtocolsinImmunology,Wiley/Green,NY(1991)；Stites(編)BasicandClinicalImmunology(7Hjx)LangeMedicalPublications,LosAltos,CA，以及其中引用的文獻(Stites)；Goding，MonoclonalAntibodiesprinciplesandPractice(第2版)AcademicPress,NewYork,NY(1986)；禾口Kohler(1975)Nature256495。這些技術(shù)包括從在細胞上的噬菌體或類似物中展示的重組抗體文庫中選擇抗體。參見Huse(1989)Science2461275和Ward(1989)Nature3415440可通過哺乳動物細胞中的瞬時或穩(wěn)定表達載體表達重組抗體，如Norderhaug(1997)J.Immunol.Methods2M77-87。出于本發(fā)明的目的，用于通過測定生腱蛋白-W蛋白質(zhì)的血液、血漿或血清濃度來診斷結(jié)腸癌的生腱蛋白-W特異性抗體還包括其活性片段?；钚云沃妇哂锌乖贵w反應(yīng)活性的抗體片段。這些是活性片段，特別地命名為例如F(ab')2、Fab'、Fab和Fv。例如，如果用胃蛋白酶消化本發(fā)明抗體得到F(ab')2，如果用木瓜蛋白酶消化則得到Fab。如果用例如2-巰基乙醇的試劑還原F(ab')2并用一碘乙酸烷基化，則得到Fab'。Fv是其重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)通過接頭相連接的單活性片段。通過保存這些活性片段并用另一種動物的片段取代這些活性片段之外的片段獲得嵌合抗體。特別地，還設(shè)想了人源化抗體。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“抗體”還涵蓋scFv和能夠特異性結(jié)合生腱蛋白-W的抗體樣分子，例如嫁接于替代性支架的CDR的適體，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。檢測生腱蛋白-W的方法包括，例如，使用如上所述的抗體，任選地使用酶反應(yīng)?？墒褂蒙斓鞍?W抗體特異性的第二抗體檢測識別生腱蛋白-W的抗體，其可任選地例如用放射性標(biāo)記、酶、親和素或生物素或者熒光物質(zhì)(FITC或羅丹明)進行標(biāo)記。在一個替代性實施方案中，所述識別生腱蛋白-W的抗體或其片段自身帶有標(biāo)記。標(biāo)記可以是任何可檢測的組合物，其中檢測可以是光譜法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、免疫化學(xué)法、物理或化學(xué)法。例如，可用標(biāo)記包括32P，35S,3H,14C,125I，131I，熒光染料(例如FITC、羅丹明和鑭系元素磷光體)、電子密集試劑、酶，例如ELISA中常用的(如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶和堿性磷酸酶)、生物素、地高辛(dioxigenin)，或者針對抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白質(zhì)是可用的。所述標(biāo)記可直接引入待檢測靶標(biāo)化合物，或者可連接到結(jié)合所述靶標(biāo)的探針或抗體。免疫結(jié)合測定是本領(lǐng)域已知的。綜述參見MethodsinCellBiology，第37卷AntibodiesinCellBiology,Asai,(編著)AcademicPress,Inc.NewYork(1993)。貫穿本發(fā)明的測定，每次施用試劑或試劑組合孵育之后可能需要孵育和/或洗滌步驟。孵育步驟可從約5分鐘至數(shù)小時不等，可能從約30分鐘至約6小時。但是，孵育時間通常取決于測定形式、分析物、溶液量、濃度等等。通常，所述測定應(yīng)在環(huán)境溫度下進行，盡管它們可以在例如4攝氏度至40攝氏度的范圍內(nèi)進行。一個特別優(yōu)選的測定形式是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。但是，本發(fā)明的方法和用途可以在體外進行，例如ELISA，以及在離體或體內(nèi)進行，例如，使用固定在支持物上的抗體進行的在線監(jiān)測。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于在血液、血漿或血清樣品中檢測、診斷或預(yù)后結(jié)腸癌的試劑盒，其包含生腱蛋白-W特異性的抗體或其片段。本發(fā)明的試劑盒還可包含生腱蛋白-C特異性的抗體或其片段。這類試劑盒包含可用于進行本發(fā)明方法的試劑，例如來自一種或多種物種的生腱蛋白-W和生腱蛋白-C特異性的抗體。還可包含識別一種或兩種這類第一抗生腱蛋白抗體的第二抗體，以識別和檢測與結(jié)合樣品的第一抗體?？梢岳缬脽晒鈭F、酶、放射性標(biāo)記或其他物質(zhì)標(biāo)記這些第二抗體用以監(jiān)測。其他檢測標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的。作為替代地，可標(biāo)記第一抗生腱蛋白-W抗體用以直接檢測。除非另外定義，本發(fā)明中所有的技術(shù)和科學(xué)名詞具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管與本文所記載的那些類似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實施或試驗，但是下文描述了合適的方法和材料。本文提到的所有出版物、專利申請、專利及其他參考文獻在此完整引入作為參考。在有沖突的情況下，以包含定義的本說明書為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實施例僅為舉例說明，而不作為限制。實施例材料和方法重組蛋白質(zhì)如前所述克隆、表達和純化人生腱蛋白-W和生腱蛋白-C36’37。使用明膠-瓊脂糖柱從過濾滅菌的馬血清中純化纖連蛋白。用PBS洗滌柱子之后，用4M尿素洗脫纖連蛋白，最后用PBS進行透析。人血纖蛋白原購自Sigma(Sigma，Buchs，瑞士)?？股斓鞍?W抗體產(chǎn)生產(chǎn)生兩種識別人生腱蛋白-W的多克隆抗血清。在兔子中產(chǎn)生抗純化的全長人生腱蛋白-W的第一抗血清稱為pAb(FL)36(圖la，由長線段表示)。為了在兔子中產(chǎn)生第二多克隆抗血清，克隆、在細菌中表達并純化人生腱蛋白-W的重組片段。為了克隆所述重組片段，設(shè)計特異性引物，以使用擴展高保真PCR系統(tǒng)(ExpandHighFidelityPCRSystem)擴增編碼最后兩個纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的序列(Roche，Rotkreuz，瑞士)。全長人生腱蛋白-W(如上所述)的cDNA用作模板，使用弓丨物對5‘-GAGGATCCGAAATTGACGGCCCCAAAAACC-3'/5'-ATAAGCTTATGTGGAGAGGGTGGTGGA-3‘進行PCR。正向引物包含BamHI限制性位點，反向引物包含終止密碼子，其后緊接著HindIII限制性位點，以使得能夠定向克隆進細菌表達載體PQE30(Qiagen,Hilden,德國)，提供C-端His標(biāo)簽用以純化重組片段。表達對應(yīng)于纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域3F/4的重組片段(圖la，分子下面的短線段)，并根據(jù)供應(yīng)商的說明通過使用Ni-NTA介質(zhì)(Qiagen，Hilden，德國)的親和層析對其進行純化。在天然條件下進行純化，通過250mM咪唑(pH6.9)洗脫。然后，使用細菌表達的生腱蛋白-W片段在兔子中通過標(biāo)準(zhǔn)免疫步驟產(chǎn)生多克隆抗血清(pAb(3F/4))。為了在小鼠中產(chǎn)生單克隆抗體(mAb)，如上所述克隆、在細菌中表達并純化含有最后三個纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的人生腱蛋白-W重組片段(圖la，分子上面的短線段)。為了克隆所述重組片段，從通過Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad,CA，美國)從Saos-2細胞(ATCC#HTB-85)提取總RNA來合成cDNA。擴增最后三個FN類型III結(jié)構(gòu)域的引物用于使用擴展高保真系統(tǒng)(Roche，Rotkreuz，瑞士)的巢式PCR，其使用Sa0S-2cDNA作為模板。使用引物對5'-GGGAAGGAGCAGAGTAGCACTG-3‘/5'-CCGCCTCTGGAAGACAATCC-3‘進行第一反應(yīng)，使用引物5‘-AGGGATCCGACATTGACAGCCCCCAAAACC-3‘/5‘-CTAAGCTTTCATGTGGAGAGGGTGGTGGATAC-3‘進行第二反應(yīng)。用于第二PCR的正向引物包含BamHI限制性位點，反向引物包含終止密碼子，其后緊接著HindIII限制性位點，以使得能夠定向克隆進細菌表達載體PQE30(Qiagen，Hilden，德國)，提供C-端His標(biāo)簽用以純化重組片段。通過用34.6微克用STIMUNE(ID-Lelystad，InstituteforAnimalSciencesandHealth,Lelystad,NL)乳化的純化重組生腱蛋白_W片段免疫雌性BALB/c小鼠獲得MAb。用25微克生腱蛋白-W片段以4周為間隔注射小鼠兩次，用以加強。將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞系P3X63Ag8.653(ATCC#CRL-1580)融合，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進行培養(yǎng)。通過使用構(gòu)建物在HEK293細胞中表達的生腱蛋白-W片段的ELISA和western印跡來分析雜交瘤上清，所述構(gòu)建物含有生腱蛋白-W的最后三個FNIII結(jié)構(gòu)域的序列，其融合了含有其分泌信號和良好表征的抗雞生腱蛋白-C抗體mAb60之表位的雞生腱蛋白-C之N-端片段38。通過蛋白G瓊脂糖(AmershanuOtelfingemCH)從條件培養(yǎng)基純化來自兩個mAb雜交瘤克隆(mAb29A和mAb560)的IgG，并用于本研究。夾心式ELISA用50微升mAb29A(捕獲抗體，PBS中10μg/ml)在37攝氏度下涂布Immunolon1平底96-孔平板(DynatechLaboratories,Chantilly，VA，美國)1小時，再在室溫下用PBS中的4%牛奶(封閉和洗滌溶液)封閉1小時。將所述平板洗滌兩次之后，在37攝氏度下將50微升血清樣品或標(biāo)準(zhǔn)品(純化的人生腱蛋白-W)(兩者都在封閉溶液中稀釋)孵育1小時。在12至18的2倍系列稀釋物中測定每種血清。棄去樣品，用洗滌緩沖液徹底洗滌平板4次。與50微升pAb(FL)(檢測抗體，在封閉溶液中1500，在37攝氏度下1小時)孵育后，再將平板洗滌4次，與過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(封閉溶液中12000，1小時37攝氏度)一起孵育。用洗滌緩沖液將平板洗滌四次以及用PBS洗滌兩次后，通過加入100微升反應(yīng)緩沖液(0.IM檸檬酸，0.2MNa2HPO4,4mM1，2-鄰苯二胺，0.003%H2O2)進行酶顯色反應(yīng)。用50微升4MH2SO4停止反應(yīng)，用VERSAMAX微板讀數(shù)器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA，美國)在490nm相對于620nm讀取平板。為了監(jiān)測血清生腱蛋白-C，如前所述進行夾心式ELISA21，其使用抗人生腱蛋白-CmAbB28.13作為捕獲抗體，多克隆雞抗人生腱蛋白-C作為檢測抗體(1500)以及過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗雞IgG(l15，000)，使用純化的人生腱蛋白-C作為標(biāo)準(zhǔn)品。患者群和血清制備患者在48歲至94歲之間(平均年齡70.3歲)，患有非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(CRC)并預(yù)定進行腫瘤切除。排除標(biāo)準(zhǔn)包括具有低于10g/dl血紅蛋白、白細胞減少、血小板減少、最近三個月期間深部靜脈血栓形成、長期血管導(dǎo)管、慢性血管或炎癥疾病、最近4個月和6個月中分別進行了手術(shù)和化療的患者。健康志愿者是性別混合的，在30至76歲之間，無癌癥史、慢性病史或除了激素避孕之外的用藥史。盡管43歲的平均年齡低于癌癥患者，但是沒有指示生腱蛋白-W水平隨年齡增加。洛桑大學(xué)醫(yī)院(LausarmeUniversityHospital)的地方道德委員會批準(zhǔn)了倫理和科學(xué)許可。從所有患者和健康志愿者獲得書面知情同意書。對于血清制備，將血液收集到無抗凝劑的管中。在IOOOg下離心10分鐘后，提取血清并冷凍在-80攝氏度待用。所有腫瘤的組織學(xué)診斷和分級由一名病理學(xué)家(SW)根據(jù)WHO腫瘤分級進行檢查39O使用國際抗癌聯(lián)合會(惡性腫瘤的M分級)確定腫瘤分級4°。人組織提取和western印跡分析手術(shù)后立即在干冰上冷凍新鮮人組織。對于組織處理，在冰上解凍、切碎并在裂解緩沖液中勻菜(IOOmM磷酸鹽緩沖液，pH8.0,300mMNaCl，8M尿素，Triton-X-100,IOmMβ-巰基乙醇，50mM鹽酸胍以及完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Rotkreuz，瑞士))。將不溶物質(zhì)沉淀，將還原SDS-PAGE樣品緩沖液加入到上清中，在95攝氏度煮沸5分鐘。在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，使用半干燥印跡裝置(Millip0re，Bedf0rd，MA，美國)將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至聚二氟乙烯(polyvinyldifluoride)膜上(Millipore，Bedford，MA，美國)。轉(zhuǎn)移之后，用酰胺黑對膜進行染色，以調(diào)節(jié)相等的蛋白質(zhì)上樣。在含0.05%吐溫和5%脫脂奶粉的TBS中室溫封閉1小時之后，將膜與多克隆生腱蛋白-W抗血清(pAb(3F/4)；1750)、產(chǎn)生的抗生腱蛋白-W的mAb560(11000)，產(chǎn)生的抗生腱蛋白-C的mAbB28_13(1IOO)21,或者抗黏著斑蛋白的mAb(l2000;Sigma，Buchs，瑞士)一起孵育過夜，然后分別與偶聯(lián)了辣根過氧化物酶(110，000)的抗兔IgG或抗小鼠IgG—起孵育1小時。使用SuperSignal使印跡顯影(Pierce，Rockford,IL，美國)并曝光至KodakBioMaxMRFilm。免疫組織化學(xué)和冷凍組織微陣列由32個結(jié)腸癌和6個正常結(jié)腸黏膜的冷凍組織樣品組成冷凍組織微陣列(TMA)。這些樣品的病理特征總結(jié)于表III中(患者1-38)。如前所述在冷凍組織-TekOCT化合物(MilesLaboratories,Naperville,IL，美國)中構(gòu)建TMA41。本發(fā)明人通過使用0.6mm鉆(drill)產(chǎn)生接受孔(recipienthole)以取代常規(guī)的中空針優(yōu)化了市售微陣列裝置(BeecherInstruments,SunPrairie,WI,美國)。利用DABMap檢測試劑盒(Ventana)，使用DiscoveryXT自動染色儀(VentanaMedicalSystems，Tucson，AZ，美國)進行所有免疫染色。冷凍組織載玻片在室溫下干燥1小時，在丙酮中4攝氏度下固定10分鐘，然后引入自動染色儀。對任何染色都不需預(yù)處理。首先，使用ABBlock試劑(Ventana)將載玻片進行12分鐘的兩次封閉。然后，將它們在37攝氏度下與抗生腱蛋白-C的mAbB28-13(l2500)和抗生腱蛋白-W的mAb560(l800)一起孵育1小時。之后，在37攝氏度下用生物素化通用二抗(Ventana)處理載玻片32分鐘，用蘇木精和靛青試劑(Ventana)對染。結(jié)果夾心式ELISA的精確性和靈敏度通過夾心式ELISA，使用mAb29A作為捕獲抗體以及使用pAb(FL)作為檢測抗體分析血清生腱蛋白-W水平(圖la)。通過生腱蛋白-W條件培養(yǎng)基、純化的纖連蛋白、血纖蛋白原、生腱蛋白-C和生腱蛋白-W的western印跡分析評估檢測抗體的特異性(圖lb)?？股斓鞍?W抗血清pAb(FL)特異性地與人生腱蛋白-W條件培養(yǎng)基反應(yīng)，并且與純化的生腱蛋白-W反應(yīng)，但是不顯示任何與已知存在于血清中的生腱蛋白-C或任何其他所測試相關(guān)蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性(圖lb)。為了進一步排除它們的檢測抗體識別可能結(jié)合生腱蛋白-W的血清雜質(zhì)，本發(fā)明人使用兩種不同的多克隆抗人生腱蛋白-W抗體PAb(FL)和pAb(3F/4)進行生腱蛋白-W檢測。表Ia顯示兩種多克隆檢測抗體在相同血清樣品中測得類似的生腱蛋白-W濃度，使得它們非常不可能與可能結(jié)合生腱蛋白-W的雜質(zhì)血清蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。此外，pAb(FL)與pAb(3F/4)識別生腱蛋白-W的不同表位，因為與pAb(3F/4)不同，不能通過加入用于產(chǎn)生pAb(3F/4)的細菌表達片段來阻斷pAb(FL)與生腱蛋白-W的反應(yīng)性(圖Ic)。測試了純化的生腱蛋白-W的連續(xù)稀釋物，本發(fā)明人得出以下結(jié)論使用新建立的夾心式ELISA，可檢測低至0.005mg/l濃度的血清生腱蛋白-W。在圖Id中，生腱蛋白-W的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示為雙對數(shù)圖。當(dāng)本發(fā)明人測試不同的捕獲抗體(mAb560)時，獲得與mAb29A相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，并決定使用mAb29A進行所有其余的夾心式ELISA。在一個測定中通過三次(“組內(nèi)”，表Ib)或者在兩個連續(xù)測定中一式兩份(“組間”，表Ic)測試4個血清樣品估計所述測定的精確性。組內(nèi)的變異系數(shù)(CV)為5.6+/-1.3%，組間為6.52+/"4.9%。因此，本發(fā)明人建立了用于檢測人血清樣品中生腱蛋白-W的特異性且精確的夾心式ELISA。表I表Ia-兩種不同檢測抗體的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通過夾心式ELISA使用兩種不同檢測抗體pAb(FL)和pAb(3F/4)分析的血清TNW水平。根據(jù)學(xué)生t檢驗，所測試的所有樣品中血清TNW水平在兩種不同檢測抗體之間沒有顯著差異(P>0.05)。表Ib-測定精確性組內(nèi)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通過在一個測定中三次測定4個血清樣品估計精確性(組內(nèi))。SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差；CV(%)=變異系數(shù)表Ic-測定精確性組間<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通過在兩個連續(xù)測定中一式兩份測定4個血清樣品估計精確性(組間)。SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差；CV(%)=變異系數(shù)生腱蛋白-W在結(jié)腸直腸癌和乳腺癌患者中上調(diào)在結(jié)腸直腸癌患者的血清樣品中顯示生腱蛋白-C提高2°’25。然而，沒有跡象表明對于生腱蛋白-W來說也是這樣。盡管如此，本發(fā)明人測定了17個非轉(zhuǎn)移性(在診斷時)結(jié)腸直腸癌患者的血清中的生腱蛋白-W水平，并且將其與25個健康志愿者血清中所監(jiān)測的水平進行比較。對照血清中生腱蛋白-W的均值為0.389+/-0.14mg/l(圖2a)。這約為公開的健康個體平均血清生腱蛋白-C水平的一半21’42。結(jié)腸直腸癌患者中的血清生腱蛋白-W濃度相比健康個體顯著增加(P<0.01)，平均水平為0.794+/-0.38mg/l(圖2a)。這對應(yīng)于健康志愿者的2倍。對血清樣品進行免疫沉淀(IP)以及隨后的免疫印跡分析得到對單個生腱蛋白-W特異性條帶的檢測，對應(yīng)于純化的全長生腱蛋白-W的大小(數(shù)據(jù)未顯示)。這顯示，本發(fā)明人測定了血清中的完整成熟生腱蛋白-W蛋白質(zhì)。本發(fā)明人還測定了生腱蛋白-C的相同血清，獲得0.775+/-0.25mg/l的健康志愿者平均生腱蛋白-C水平(圖2b)，其很好的匹配了文獻中所述的范圍21’42。結(jié)腸直腸癌血清中平均生腱蛋白-C值為0.98+/-0.24mg/1，對應(yīng)于對照血清的1.2倍(圖2b)?？捎糜谠撗芯康慕Y(jié)腸直腸癌癥患者的臨床病理特征以及其各自所測得的生腱蛋白-W和生腱蛋白-C水平列于表II。盡管這兩種生腱蛋白在結(jié)腸直腸癌癥患者中顯示相同的水平增加的趨勢，但是相比于志愿者癌血清中生腱蛋白-W均值的差異要顯著的多。然而，并不是所有具有高生腱蛋白-C血清水平的患者也含有高水平的生腱蛋白-W(表II)，這表明這兩種生腱蛋白在結(jié)腸直腸癌患者中并沒有嚴格的相關(guān)性。盡管升高的血清生腱蛋白-W水平與結(jié)腸直腸癌分期之間沒有明顯相關(guān)性，但是值得注意5個在手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的患者中有4個具有高水平的生腱蛋白-W。復(fù)發(fā)患者的平均血清生腱蛋白-W水平(η=5)為1.02+/-0.34mg/l，其對應(yīng)于非復(fù)發(fā)結(jié)腸直腸癌患者的1.5倍(η=12，均值為0.700+/-0.37mg/l)以及健康志愿者的2.6倍(表II)。表II-結(jié)腸直腸癌患者的臨床病理特征和生腱蛋白水平<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>n.a.:不可用；分級=根據(jù)WHO腫瘤分類，2000的腫瘤分級；M(腫瘤，淋巴結(jié)(node)，轉(zhuǎn)移)=根據(jù)UICC分類，2002的腫瘤分期；TNW，TNC通過夾心式ELISA推出的血清中蛋白質(zhì)水平。a腫瘤輔助放療(25/11/02-12/12/02)b使用5-氟尿嘧啶(5-FU)的輔助放療(23/09/03-31/10/03)為了測試生腱蛋白-W是否是結(jié)腸直腸癌的特異性血清標(biāo)記，或者測試生腱蛋白-W是否可以具有廣譜的應(yīng)用，本發(fā)明人分析了16個非轉(zhuǎn)移性(在診斷時)乳腺癌患者血清中的生腱蛋白-W，并將其與健康志愿者中所檢測的水平進行比較。乳腺癌群體中生腱蛋白-W的平均血清值為0.682+/-0.43mg/l。這相當(dāng)于統(tǒng)計上顯著的(ρ<0.02)增加至健康志愿者的1.75倍(圖2c)。從這些數(shù)據(jù)中，本發(fā)明人得出下列結(jié)論與健康個體相比，在第一次治療意圖的手術(shù)時非轉(zhuǎn)移性乳腺癌和結(jié)腸癌患者中生腱蛋白-W的血清水平升高。在正常結(jié)腸和癌癥組織中的生腱蛋白-W表達為了確定腫瘤組織中的生腱蛋白表達的增加是否可解釋結(jié)腸直腸癌患者中血清水平的升高，本發(fā)明人對11份結(jié)腸直腸腫瘤組織提取物進行了免疫印跡。如圖3a所示，大部分腫瘤組織樣品含有可檢出水平的生腱蛋白_C(9/11；82%)0此外，在這些腫瘤提取物中也高表達生腱蛋白-W(9/11；82%)。在兩個病例中(患者E和F)，生腱蛋白-W和生腱蛋白-C不存在，或者僅僅可檢出，而所檢測的所有其他樣品顯示兩種生腱蛋白的共表達(圖3a)。除了腫瘤組織之外，對于患者K和L來說相應(yīng)地正常黏膜可獲得，而對于患者J，本發(fā)明人僅獲得正常組織。在所有測試的正常結(jié)腸黏膜中，生腱蛋白-W不可檢出，即使相同患者的腫瘤組織提取物顯示強生腱蛋白-W表達(患者K和L)。這與生腱蛋白-C相反，其在正常結(jié)腸黏膜中也可檢出，但是相比于相應(yīng)腫瘤樣品水平低得多。對于生腱蛋白-C，本發(fā)明人檢測到不同的同種型，而對于生腱蛋白-W，在所測試的提取物中主要觀察到單個條帶。但是，在患者B和I的腫瘤提取物中可檢出第二條模糊的較低生腱蛋白-W條帶。此較小的條帶有可能代表生腱蛋白-W的降解產(chǎn)物，但是本發(fā)明人不排除可能由于低水平的替代性剪接。腫瘤和正常組織之間生腱蛋白-C同種型的表達不同。在正常結(jié)腸黏膜中，僅觀察到低分子量的同種型，而在腫瘤提取物中，可檢出低分子量和高分子量同種型?？傊蠖鄶?shù)人結(jié)腸直腸癌表達兩種生腱蛋白，但是它們的相對量在患者之間有很大不同。為了確認腫瘤組織中生腱蛋白-W和生腱蛋白-C的表達并且在所述組織中對其存在進行定位，本發(fā)明人通過免疫組織化學(xué)對患者K和L的正常結(jié)腸黏膜和腫瘤組織的冷凍切片進行染色。兩個患者的染色模式相同。如患者L所示(圖3b)生腱蛋白-C以及生腱蛋白-W的染色顯示在腫瘤基質(zhì)中非常強的表達，所述腫瘤基質(zhì)是圍繞癌細胞的特化結(jié)締組織。正常結(jié)腸黏膜是生腱蛋白-C陽性的，但是與免疫印跡結(jié)果相一致的，非生腱蛋白-W陽性。在黏膜肌層中生腱蛋白-C表達很強，圍繞腺體也存在其表達。綜上，冷凍切片的免疫組織化學(xué)染色證實了相同結(jié)腸直腸癌提取物的免疫印跡所得的結(jié)果，顯示生腱蛋白-W是結(jié)腸直腸癌中活化的腫瘤基質(zhì)的新的標(biāo)記。為了將此分析擴展到大量樣品，本發(fā)明人對含有32個癌癥點和6個正常結(jié)腸點的冷凍結(jié)腸組織微陣列(TMA)進行染色。毫無例外，對于生腱蛋白-W和生腱蛋白-C所有癌癥組織切片都是染色的，而所有正常組織都是生腱蛋白-W陰性的，但是是生腱蛋白-C陽性的(表III)。所觀察到的不同染色模式的實例顯示于表4。正常結(jié)腸組織中大多數(shù)生腱蛋白-C陽性見于平滑肌(圖4，患者36)。在一些腫瘤中，生腱蛋白-W和生腱蛋白-C染色看起來完全重疊(圖4，患者4、5)，而在其他一些中，生腱蛋白-W陽性區(qū)是生腱蛋白-C陽性區(qū)的子集(圖4，患者12)。如圖4所觀察到的(患者15)，腫瘤中的生腱蛋白-C陽性和生腱蛋白-W陰性區(qū)域也可能是由于平滑肌的存在，如腫瘤和正常組織的邊界處所見的(圖4，患者26)。染色的程度總是與腫瘤的基質(zhì)區(qū)室重疊，如H&E染色的切片所判定的(圖4)。在表III中，概括了患者數(shù)據(jù)，根據(jù)所觀察的染色區(qū)域?qū)θ旧Ｊ竭M行分類。這顯示，生腱蛋白-C具有比生腱蛋白-W略微更寬的分布。因為生腱蛋白-C在結(jié)腸的平滑肌中強表達，所以這可能反映了癌癥基質(zhì)中平滑肌細胞的存在。表III-冷凍TMA的臨床病理特征和生腱蛋白染色<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>分級=根據(jù)WHO腫瘤分類，2000的腫瘤分級；M(腫瘤，淋巴結(jié)，轉(zhuǎn)移)=根據(jù)UICC分類，2002的腫瘤分期；欄目中的分級+++>60%的腫瘤區(qū)域被染色；++>20%的腫瘤區(qū)域被染色；+<20%的腫瘤區(qū)域被染色。參見圖4中每個欄目的實例。討論在2006年，結(jié)腸直腸癌是歐洲癌癥死亡的第二大死因，造成207，400人死亡(癌癥死亡總數(shù)的12.2%)43。結(jié)腸直腸癌在確定的階段中發(fā)展數(shù)年44。如果在早期(息肉或非侵襲性癌癥)檢測到腫瘤并通過內(nèi)窺鏡息肉切除術(shù)或手術(shù)切除，則在大多數(shù)病例中可防止結(jié)腸直腸癌造成的死亡。在此背景下，有效的篩選工具最為重要。由于經(jīng)典的糞便潛血檢測的低準(zhǔn)確性和靈敏度，在數(shù)年里已經(jīng)開發(fā)并研究了數(shù)種針對結(jié)腸直腸癌篩選的生物化學(xué)標(biāo)志物，包括癌胚性抗原(CEA)血清水平45、半乳糖-N乙酰半乳糖胺糞便水平46以及人大便中的K-Ras突變47’48，但是沒有一種對早期癌癥檢測足夠靈敏且特異。最近，發(fā)現(xiàn)腫瘤M2-丙酮酸激酶(催化糖酵解途徑最后一步反應(yīng)的二聚化形式的酶)在胃腸癌(包括結(jié)腸直腸癌)患者的血漿和糞便樣品中上調(diào)49_53。盡管如此，目前可用于預(yù)防和檢測結(jié)腸直腸癌的最有效方法是結(jié)腸鏡。但是，這種調(diào)查是侵入性，耗時，使人不適并且相對昂貴54。此外，每三到五年進行結(jié)腸鏡檢測的頻率受到這些因素的限制，并且在兩次結(jié)腸鏡之間觀察到癌癥出現(xiàn)的情況并不罕見。因此，在血液中可檢出的結(jié)腸癌替代性標(biāo)志物可能是篩選及早期癌癥檢測的便利方法。在對新診斷或預(yù)后腫瘤標(biāo)志物的尋找中，經(jīng)常分析癌癥患者血清中生腱蛋白-C的水平，并且其作為生物標(biāo)記的潛在價值已經(jīng)有評價21_23’55’56。盡管在某些癌癥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生腱蛋白-C血清水平升高，但是其仍然是存在疑問的腫瘤標(biāo)志物21。其水平散布在較寬的范圍內(nèi)，許多癌癥患者具有正常的生腱蛋白-C濃度，并且其表達與炎癥或感染的部位具有強相關(guān)性18。在此實施例中，本發(fā)明人評價了生腱蛋白-W作為結(jié)腸直腸癌中生物標(biāo)記的潛力。使用不同的抗生腱蛋白-W抗體以及作為標(biāo)準(zhǔn)品的純化蛋白建立了靈敏準(zhǔn)確并且生腱蛋白-W特異性的夾心式ELISA。本發(fā)明人能夠在健康志愿者和結(jié)腸直腸癌患者的血清中檢出并測量生腱蛋白-W。健康個體中平均血清生腱蛋白-W水平為0.389+/-0.145mg/l。對照群體中均勻的低水平是癌癥標(biāo)志物的嚴格要求。相比之下，對照中生腱蛋白-C的血清水平高兩倍并且散布在較寬的范圍內(nèi)。令人感興趣地，本發(fā)明人觀察到在結(jié)腸直腸癌血清中平均生腱蛋白-W水平明顯提高(0.794+/-0.38mg/l)。圖2a的柱狀圖(右)顯示在結(jié)腸直腸癌患者群體中，有兩個子群體一個具有提高的生腱蛋白-W水平(對照均值的約2.5倍)，另一個具有與對照相當(dāng)?shù)乃?。這些組可代表血清中生腱蛋白-W提高的不同動力學(xué)，其中“正?！彼綍诩膊“l(fā)展的后期升高。另一個重要的問題是生腱蛋白-W的水平與更不利的疾病發(fā)展相關(guān)。在這一點上，值得注意結(jié)腸直腸癌患者的隨訪研究表明在治療后腫瘤復(fù)發(fā)的5名患者中有4名的血清中具有高生腱蛋白-W水平(即高于均值)(表II)。這另外表明血清中生腱蛋白-W水平在預(yù)測復(fù)發(fā)或發(fā)展中的潛在價值?？紤]血清中生腱蛋白-W或任何其他生物標(biāo)記的存在可受到任何共發(fā)病(co-morbidity，例如心血管疾病、炎癥疾病)或者通過腫瘤對其他器官(例如骨髓、肝臟)的間接作用的影響也很重要。例如，生腱蛋白-C血清水平顯示與炎癥而不是腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)21，但是可發(fā)現(xiàn)結(jié)合的生腱蛋白-W與感染或炎癥的存在沒有相關(guān)性(自己的未公開結(jié)果)。本發(fā)明人證實生腱蛋白-C在結(jié)腸直腸癌患者的血清中以較高水平存在的趨勢(0.98+/-0.24mg/l)，但是此提高相比于生腱蛋白-W要小得多。本發(fā)明人沒有觀察到兩種生腱蛋白水平之間的相關(guān)性，也沒有觀察到其與原發(fā)腫瘤分類和分期的相關(guān)性。本發(fā)明人還監(jiān)測到，相比于健康個體，非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中平均血清生腱蛋白-W水平的顯著增加(1.75倍)。這表明生腱蛋白-W不是結(jié)腸腺癌特有的生物標(biāo)記，而是可能具有廣譜的應(yīng)用。為了檢測腫瘤中生腱蛋白-W的表達，本發(fā)明人通過免疫印跡研究了11個結(jié)腸直腸癌患者的腫瘤提取物，以及對于其中一些的相應(yīng)正常組織。本發(fā)明可顯示在82%的所述患者的腫瘤組織中可檢出生腱蛋白-W以及生腱蛋白-C。因為對不同的結(jié)腸直腸癌患者進行腫瘤組織的免疫印跡分析，本發(fā)明人無法得出腫瘤中局部生腱蛋白-W表達與相應(yīng)血清中循環(huán)水平的直接相關(guān)性。但是，在正常結(jié)腸黏膜中不存在生腱蛋白-W，與之相反，生腱蛋白-C在正常組織中也有表達(低水平)。有趣地，在正常組織中，僅存在生腱蛋白-C的低分子量同種型，而在腫瘤組織中，低分子量和/或高分子量同種型都過表達。此結(jié)果表明正常和腫瘤性人結(jié)腸組織中生腱蛋白-C同種型的差異表達。這與之前的下述報道一致，所述報道顯示正常穩(wěn)定組織中表達小同種型57，而在包括腫瘤、傷口愈合或炎癥的患病組織中可檢出較大變體58_61。相同患者的冷凍切片免疫組織化學(xué)分析表明兩種生腱蛋白都有明顯的基質(zhì)染色。在含有32個不同結(jié)腸癌切片的冷凍TMA上確認生腱蛋白-C和生腱蛋白-W的基質(zhì)染色。此研究表明所有腫瘤對兩種生腱蛋白均染色，以及所述染色與腫瘤基質(zhì)存在的量相關(guān)聯(lián)。在人乳腺癌中得到類似的觀察結(jié)果。生腱蛋白-W和生腱蛋白-C顯示在大部分人乳腺癌中高表達。與表達生腱蛋白-C的正常結(jié)腸黏膜不同，正常乳腺實質(zhì)組織對兩種生腱蛋白都是陰性36。如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，可容易地引入上述方法的改變以實現(xiàn)相同的目的。根據(jù)個體偏好可選擇多種孵育條件、標(biāo)簽、裝置和材料。本文提及的所有出版物如同其單獨引入，在此完整引入作為參考。參考文獻1.HanahanD,WeinbergRA.Thehallmarksofcancer.Cell2000;100:57-70.2.VogelsteinB,KinzlerKff.Cancergenesandthepathwaystheycontrol.NatMed2004；10:789_99·3.BissellMJ,RadiskyD.Puttingtumoursincontext.NatRevCancer2001；146-54.4.MuellerMM,FusenigNE.Friendsorfoes-bipoiareffectsofthetumourstromaincancer.NatRevCancer2004；4:839_49·5.BeachamDA,CukiermanΕ·Stromagenesis:thechangingfaceoffibroblastlcmicroenvironmentsduringtumorprogression.SeminCancerBiol2005；15:329-41.6.BhowmickNA,MosesHL.Tumor-stromainteractions.CurrOpinGenetDev2005；15:97-101.7.KalluriR,ZeisbergM.Fibroblastsincancer.NatRevCancer2006；6392-401.8.Chiquet-EhrismannR，MackieEJ,PearsonCA,SakakuraΤ.TenascinanextracellularmatrixproteininvolvedintissueInteractionsduringfetaldevelopmentandoncogenesis.Celll986；47131-9.9.OrendG.Potent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