用于癌癥治療的預測性生物標記物的制作方法
【專利說明】
[0001] 說明書
技術領域
[0002] 本發(fā)明大體上涉及根據(jù)癌癥患者是否將對特異性治療有反應而對癌癥患者進行 識別。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于識別對包含免疫活化DNA構建體的治療的反應者的 方法和DNA構建體，以及待用于治療癌癥患者的DNA構建體，所述患者在采用所述構建體進 行治療開始之前單獨地表征為可能的反應者。
【背景技術】
[0003] 生物標記物是在血液或其他體液、組織中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，或作為細胞上的反應者，其 預示癥狀或疾病例如類似癌癥的存在與否。生物標記物可以分為預測、預后和藥效生物標 記物。
[0004] 預測標記物被用于評估患者會從特定的治療中反應或收益的可能性。預后標記物 允許對腫瘤進行分類，考慮它們的攻擊潛力以指導對其治療或決定如何積極地治療。藥效 生物標記物檢測藥物對腫瘤的短期治療效果，并且可以用于在新的抗癌藥物的臨床開發(fā)階 段指導劑量選擇。
[0005] 靶向治療是作用于分子水平的阻止癌癥生長或擴散的治療方法。為了避免不必要 的途徑，因為這樣的治療通常涉及使用非常有攻擊性的藥物，需要能夠預測患者會不會對 靶向治療有反應的工具。
[0006] 鑒于這樣的事實，即治療變得越來越具有靶向特異性，生物標記物的地位將會提 升。它們將幫助實現(xiàn)個體化治療性途徑和打開個體化腫瘤學的道路。甚至從非反應者中區(qū) 分對特異性治療的反應者的可能性將幫助避免患者經(jīng)受不必要的治療。
[0007] -種廣泛已知且完全批準的癌癥治療方法為化療法?；煼ǖ闹饕毕菔欠浅＞?有攻擊性藥物的使用引起了嚴重的副作用。為了將副作用最小化，在將化學治療劑的劑量 最小化方面進行了許多努力，例如將化學治療劑與免疫活化劑聯(lián)合。一種方法是使用免疫 活化DNA。
[0008] 所謂的未甲基化CG序列已經(jīng)顯示對活化免疫系統(tǒng)非常有效（KriegAM，YiAK， MatsonS，WaldschmidtTJ，BishopGA，TeasdaleR，KoretzkyGA，KlinmanDM;CpGmotifs inbacterialDNAtriggerdirectB-cellactivation；Nature1995Apr6 374 :6522 546-9)。那些序列是從細菌中提取的。EP1 196 178公開了一種共價閉合環(huán)DNA帶有部分 自補序列，得到了具有帶有兩端包含未甲基化CG基序的單鏈環(huán)的雙鏈莖的DNA構建體。
[0009]EP1 776 124中提出了使用EP1 196 178的啞鈴形DNA構建體與化學治療劑聯(lián)合 以治療癌癥。被EP1 196 178的DNA構建體治療的患者隨后接受化學治療劑。結(jié)果是通 過所公開的聯(lián)合化學治療劑的用量被減少。但是該文件完全沒有公開關于識別患者會不會 對使用的聯(lián)合治療有反應的工具。
[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種預測是否癌癥患者會對免疫活化DNA的治療有反應的 方法。本發(fā)明的另一目的是免疫活化DNA本身，其可以用于這樣的方法，即在治療開始之前 治療被識別為反應者的患者。
[0011] 發(fā)明概沐
[0012] 本發(fā)明提供了一種通過確定活化的自然殺傷T(NKT)細胞的頻率來預測或監(jiān)測患 癌癥或自身免疫疾病的患者是否對TLR-9激動劑的治療有反應的方法。優(yōu)選確定用于活化 的NKT細胞的免疫分型的分化群集或指定群集（⑶）分子⑶3+/⑶56+/⑶69+。整個NKT細 胞群體的活化的NKT細胞的比率還可以被確定以評估是否患者會對TLR-9激動劑的治療有 反應的可能性。
[0013] 其意圖在于TLR-9激動劑是DNA構建體，其包括至少一個序列基序N￥CGN3N4,其 中N1#和N3N4是A、C、T和G的任意組合，并且C為脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷，A是脫氧腺苷 且T是脫氧胸苷。
[0014] 對TLR-9激動劑治療有反應者具有的活化的NKT細胞頻率為活化的NKT細胞在全 部NKT細胞群體中占至少3%。
[0015] 進一步的意圖是可進行先前的使用非DNA藥物的誘導治療。這樣的治療包括使用 或不使用血管再生抑制劑的化學治療或抗體的使用。
[0016] 本公開的另一目的是TLR-9激動劑在癌癥治療方法中的使用，特征在于患者具有 增加水平的活化NKT細胞。
[0017] 意圖是使用的TLR-9激動劑包括至少一種DNA構建體，其包括至少一個序列基序 N'NWN4,其中N1#和N3N4是A、C、T和G的任意組合，并且C為脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷， A是脫氧腺苷且T是脫氧胸苷。所述激動劑進一步特征在于N1#是選自包含GT、GG、GA、AT 或AA的組的元件，N3N4是選自包含CT或TT的組的元件。
[0018] 所述激動劑可以包括DNA，其為包含單鏈或雙鏈DNA的線性開鏈DNA構建體，或是 包含至少一個具有單鏈環(huán)的末端的線性雙鏈DNA構建體。代替使用環(huán)來保護線性雙鏈DNA 的末端，至少一個L-DNA核苷酸可被用作DNA雙鏈的一部分。
[0019] 序列基序N￥CGN3N4可以位于所述DNA序列的單鏈和/或雙鏈區(qū)域內(nèi)。進一步的 意圖是DNATLR-9激動劑的至少一個核苷酸被選自以下的官能團修飾，所述官能團選自包 括羧基、胺基、酰胺基、醛亞胺基、縮酮基、縮醛基、酯基、醚基、二硫基、硫醇基和醛基的組。
[0020] 包括DNA構建體的激動劑可以連接到化合物，所述化合物選自包括肽、蛋白質(zhì)、碳 水化合物、抗體、脂質(zhì)、膠束、囊泡、合成分子、聚合物、微彈、金屬顆粒、納米顆?；蚬滔嗟?組。
[0021] 進一步的意圖是包括DNA構建體的激動劑可為藥物組合物的一部分，其中所述藥 物組合物可以為疫苗。
[0022] 本公開的另一目的為預測或監(jiān)測患癌癥或自身免疫疾病的患者是否對TLR-9激 動劑的治療有反應的試劑盒，其包括對活化的NKT細胞在全部NKT細胞群體中的頻率進行 檢測和定量的工具（means)。
[0023] 所述試劑盒的意圖在于所述TLR-9激動劑可以包括DNA構建體，所述DNA構建體 包括至少一個序列基序WfCGN3#，其中N1#和N3N4是A、C、T和G的任意組合，并且C為脫 氧胞苷，G是脫氧鳥苷，A是脫氧腺苷且T是脫氧胸苷。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :verum患者的活化NKT細胞的ROC曲線。
[0025] 圖2 :活化NKT細胞對敏感度和特異度。
[0026] 圖3:a:對verum和安慰劑的生物標記物陽性患者的Kaplan-Meier圖；b:在 verum和安慰劑組的生物標記物陰性患者的Kaplan-Meier曲線。
[0027] 圖4:a:verum組的生物標記物陽性患者對生物標記物陰性患者的Kaplan-Meier 圖；b:安慰劑組的生物標記物陽性患者對生物標記物陰性患者的Kaplan-Meier圖。
[0028] 發(fā)明詳沐
[0029] 本發(fā)明公開的含義中MGN1703表示共價閉合的部分自互補的DNA鏈的DNA構建 體，所述DNA鏈具有雙鏈莖和帶有未甲基化的CG基序的單鏈端部環(huán)。
[0030] 根據(jù)本公開的"莖"應當理解為DNA雙鏈，其通過同一DNA分子內(nèi)（其然后部分自 我互補）或不同DNA分子內(nèi)（其部分或完全互補）的堿基配對形成。分子內(nèi)堿基配對指的 是在同一分子內(nèi)的堿基配對，而不同DNA分子之間的堿基配對稱作分子間堿基配對。
[0031] 在本公開的含義中，"環(huán)"應當理解為在莖結(jié)構內(nèi)部或其末端的未配對的、單鏈的 區(qū)域。"發(fā)夾"是莖和環(huán)的不同組合，其在同一DNA分子的兩個自我互補的區(qū)域雜交形成具 有未配對的莖時出現(xiàn)。
[0032] "啞鈴狀"描述在莖區(qū)域側(cè)翼兩端都具有發(fā)夾的線性DNA構建體。因此，本公開上 下文中的"線性DNA構建體"描述在雙鏈DNA莖兩端包含單鏈環(huán)的線性啞鈴狀DNA構建體。
[0033] 本公開的免疫調(diào)節(jié)指的是免疫活化和免疫抑制。免疫活化優(yōu)選地指的是活化免疫 系統(tǒng)的效應細胞以便其增殖、迀移、分化或以任何其它方式變得有活性。例如無共