本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒、該標(biāo)志物的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)是一種主要以關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)為病理改變的慢性自身免疫性疾病。RA的病變過程與患者體內(nèi)產(chǎn)生多種自身抗體并與相應(yīng)抗原形成抗原抗體免疫復(fù)合物(ICs)密切相關(guān)，部分循環(huán)中的ICs可反復(fù)沉積于關(guān)節(jié)滑膜組織，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起滑膜炎癥，造成關(guān)節(jié)損傷。RA患者關(guān)節(jié)液和血清中的ICs可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長、NO的生成和細(xì)胞凋亡，提示ICs在RA發(fā)病中扮演著重要的作用。ICs在RA檢測(cè)中具有較高的敏感性，ICs持續(xù)增高常提示RA患者預(yù)后較差。只有含有IgG和IgM類抗體的復(fù)合物才能活化補(bǔ)體的經(jīng)典途徑而引起炎癥。這兩類抗體在血清中含量較大，是構(gòu)成免疫復(fù)合物的主要抗體；可溶性抗原與相應(yīng)抗體形成的較大免疫復(fù)合物活化補(bǔ)體的能力較強(qiáng)。IgG抗體為雙價(jià)，可與相應(yīng)的多價(jià)抗原交互結(jié)合形成較大的免疫復(fù)合物；IgM分子可形成更大的免疫復(fù)合物?？乖贵w親和力高時(shí)易形成大而穩(wěn)定的免疫復(fù)合物。RA患者關(guān)節(jié)液和血清中存在較高水平的瓜氨酸肽與ACPA形成的免疫復(fù)合物，正常情況下，抗原抗體復(fù)合物在機(jī)體中被吞噬清除，然而在病例狀態(tài)下，ICs可誘發(fā)炎癥反應(yīng)。RA發(fā)病過程中伴隨多種免疫活性細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞(Fibroblast-likesynovicyte,FLS)和中性粒細(xì)胞等的活化及細(xì)胞因子(IL6、TNF-α)、趨化因子和炎性介質(zhì)的釋放。RAFLS增殖與局部關(guān)節(jié)炎癥和血管翳形成、骨破壞密切相關(guān)，F(xiàn)LS增殖和細(xì)胞因子分泌異常在RA發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。RA血清中存在含有瓜氨酸化蛋白與ACPA的ICs具有促FLS增殖能力，并可刺激FLS分泌更多細(xì)胞因子，參與RA發(fā)病機(jī)制。自身免疫性是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要特征,最佳例證是血漿中可檢測(cè)出高滴度的自身抗體,其中研究最為透徹的是類風(fēng)濕因子(rheumatoidfactors，RF)，但RF不只在RA中出現(xiàn),也可見于正常人,并在其他一些疾病中升高。近年來，抗瓜氨酸化蛋白抗體(anti-citrullinatedproteinantibodies，ACPA)雖然在RA常規(guī)診斷中尚未完全取代RF的地位，但其已成為診斷RA的首選指標(biāo)?？傮w而言，ACPA與RF敏感性相近，但特異性更高。這些抗體識(shí)別轉(zhuǎn)錄后被瓜氨酸化的多種蛋白，包括聚絲蛋白(filaggrin)、波形蛋白(vimentin)、α和β纖維蛋白(α-andβ-fibrin)、α-烯醇化酶(α-enolase)及I型和Ⅱ型膠原多肽(TypeIandtypeⅡcollagen)。ACPA的檢測(cè)是通過ELISA法檢測(cè)血清對(duì)環(huán)瓜氨酸多肽(CCP)的反應(yīng)。最初的臨床檢驗(yàn)以檢測(cè)抗瓜氨酸化聚絲蛋白的環(huán)狀多肽的反應(yīng)為基礎(chǔ)，因?yàn)榄h(huán)瓜氨酸多肽與天然構(gòu)象表位更為接近，從而提高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前這一實(shí)驗(yàn)已被結(jié)果更準(zhǔn)確的第二代試驗(yàn)——抗CCP2Elisa——所取代，它使用從瓜氨酸化多肽庫中篩選的瓜氨酸化多肽，這些瓜氨酸化的多肽均為人工合成。近期研究顯示瓜氨酸化殘基可在肺和滑膜表達(dá)，ACPA的產(chǎn)生可能為肽基精氨酸脫亞胺酶(Peptidylargininedeiminase，PAD)介導(dǎo)的蛋白在肺及滑膜脫亞氨基作用而致。這些蛋白可被特異性抗原遞呈細(xì)胞或通過B細(xì)胞形成的免疫復(fù)合物所攝取，并遞呈給T細(xì)胞，促進(jìn)激活A(yù)CPA反應(yīng)性B細(xì)胞。目前關(guān)于RF的檢測(cè)特異性較低；采用人工合成瓜氨酸化多肽用于ACPA的檢測(cè)，僅可以反映自生抗體的水平，且ACPA水平未必與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒、該標(biāo)志物的檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的是利用內(nèi)源瓜氨酸化抗原與ACPA可以形成抗原抗體免疫復(fù)合物的原理，尋找和摸索一種瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物的檢測(cè)方法及相關(guān)ELISA試劑盒，不僅可以反映ACPA的水平，還可以反映瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物的水平，并且瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，其量的變化可以直接反映病情的進(jìn)展情況和治療的效果評(píng)價(jià)，以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、方便診斷和評(píng)價(jià)RA的目的。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種標(biāo)志物(ECP)，其為內(nèi)源瓜氨酸化抗原與抗瓜氨酸化抗體的免疫復(fù)合物。利用內(nèi)源RA特異性瓜氨酸化蛋白抗原檢測(cè)ACPA，其結(jié)果不僅可以反映患者血清中ACPA的水平，還可以進(jìn)一步反映患者內(nèi)源瓜氨酸化抗原與ACPA抗原抗體復(fù)合物的水平或免疫復(fù)合物反應(yīng)的能力，循環(huán)中的ECP可反復(fù)沉積于關(guān)節(jié)滑膜組織引起滑膜炎癥，造成關(guān)節(jié)損傷。因此，ECP不僅可作為RA診斷和判斷預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志，并且可在疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用，對(duì)于目前的理論研究和臨床實(shí)踐將具有重要的意義。RA患者血清中具有天然構(gòu)象表位的瓜氨酸化蛋白更易于與ACPA形成抗原抗體免疫復(fù)合物，目前尚未有關(guān)利用內(nèi)源瓜氨酸化蛋白抗原檢測(cè)ACPA的方法。本發(fā)明利用內(nèi)源瓜氨酸化抗原與ACPA可以形成抗原抗體免疫復(fù)合物的原理，尋找和摸索一種瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物的檢測(cè)方法及相關(guān)ELISA試劑盒，不僅可以反映ACPA的水平，還可以反映瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物的水平，并且瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，其量的變化可以直接反映病情的進(jìn)展情況和治療的效果評(píng)價(jià)，以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、方便診斷和評(píng)價(jià)RA的目的。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述標(biāo)志物中所述內(nèi)源瓜氨酸化抗原為一類內(nèi)源瓜氨酸化蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述標(biāo)志物中所述抗瓜氨酸化抗體為IgG和/或IgM類抗體。本發(fā)明還提供了所述標(biāo)志物相應(yīng)的所述抗瓜氨酸化抗體在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷試劑或診斷工具中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的所述應(yīng)用中所述診斷工具為診斷試劑盒。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括抗瓜氨酸化抗體和檢測(cè)中可接受的試劑；所述抗瓜氨酸化抗體與待測(cè)樣品中內(nèi)源瓜氨酸化抗原形成所述標(biāo)志物。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的所述試劑盒中所述試劑還包括載體、封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、標(biāo)記抗體、底物、顯色液、終止液中的一種或兩者以上的混合物。本發(fā)明涉及的瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物的檢測(cè)方法及相關(guān)ELISA試劑盒，包括抗瓜氨酸化抗體預(yù)包被的載體、標(biāo)記好的抗人IgG/IgM抗體以及相關(guān)的樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述抗瓜氨酸化抗體是指采用PAD催化牛血清白蛋白(BSA)形成的具有多種瓜氨酸化位點(diǎn)的BSA(cit-BSA)作為抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗瓜氨酸化抗體。具體位點(diǎn)為BSA蛋白的所有可以被瓜氨酸化的精氨酸位點(diǎn)；所述抗體可由市場購買得到。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述cit-BSA可以用其它蛋白，尤其是人關(guān)節(jié)滑膜特有蛋白經(jīng)PAD等酶催化形成瓜氨酸化蛋白抗原免疫動(dòng)物獲得抗人瓜氨酸化抗體。具體有PAD4/PAD2兩種酶，可以將蛋白質(zhì)上的精氨酸位點(diǎn)催化形成瓜氨酸。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述抗瓜氨酸化抗體預(yù)包被的載體是指將抗瓜氨酸化抗體以包被緩沖液稀釋至0.5-100ug/ml，常規(guī)包被的酶標(biāo)板。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述標(biāo)記好的抗人IgG抗體是指以常規(guī)方法經(jīng)酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記、熒光素標(biāo)記或金標(biāo)記的抗人IgG，其種屬來源要求與制備瓜氨酸化抗體的種屬來源一致。本發(fā)明還提供了所述試劑盒在檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述標(biāo)志物的檢測(cè)方法，包括如下步驟：步驟1：取載體包被所述抗瓜氨酸化抗體，與待測(cè)樣品混合，孵育，獲得包含有樣品待測(cè)液的載體；步驟2：取載體包被所述抗瓜氨酸化抗體，與陰性參考樣品混合，孵育，獲得包含有陰性參考樣品待測(cè)液的載體；步驟3：分別取步驟1制得的包含有樣品待測(cè)液的載體與步驟2制得的包含有陰性參考樣品待測(cè)液的載體，洗滌后，分別與標(biāo)記二抗混合，孵育，洗滌，顯色，檢測(cè)所述待測(cè)樣品的光吸收值和所述陰性參考樣品的光吸收值，獲得所述標(biāo)志物的濃度。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的所述檢測(cè)方法步驟3中所述獲得所述標(biāo)志物的濃度＝所述待測(cè)樣品的光吸收值/所述陰性參考樣品的光吸收值。本發(fā)明還提供了一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)方法，根據(jù)所述標(biāo)志物的濃度獲得檢測(cè)結(jié)果。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的所述檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果為半定量檢測(cè)結(jié)果，用S/N值來表示。所述標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果S/N大于3.2為陽性；所述標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果S/N小于等于3.2為陰性。本發(fā)明利用內(nèi)源瓜氨酸化抗原與ACPA可以形成抗原抗體免疫復(fù)合物的原理，尋找和摸索一種瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物的檢測(cè)方法及相關(guān)ELISA試劑盒，不僅可以反映ACPA的水平，還可以反映瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物的水平，并且瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，其量的變化可以直接反映病情的進(jìn)展情況和治療的效果評(píng)價(jià)，以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、方便診斷和評(píng)價(jià)RA的目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一種瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物(ECP)檢測(cè)方法，其優(yōu)點(diǎn)可以歸納如下：1.與類風(fēng)濕因子檢測(cè)相比，本發(fā)明具有更高的特異性(90％以上)，且具有較高的靈敏度。2.與ACPA檢測(cè)相比，本發(fā)明的方法不用人工合成的瓜氨酸化多肽，避免了由于人工合成瓜氨酸肽種類的差異造成各ACPA檢測(cè)方法之間的差異。3.本發(fā)明利用內(nèi)源瓜氨酸化蛋白與ACPA形成免疫復(fù)合物，從而不僅可以檢測(cè)到ACPA，而且可以檢測(cè)到瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物。4.本發(fā)明僅用常規(guī)ELISA方法即可檢測(cè)瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物，方法簡單，耗時(shí)短。5.循環(huán)中的ECP可反復(fù)沉積于關(guān)節(jié)滑膜組織，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起滑膜炎癥，造成關(guān)節(jié)損傷。6.RA患者體內(nèi)瓜氨酸化抗原抗體形成免疫復(fù)合物的能力與水平對(duì)于RA診斷，病情評(píng)估及發(fā)病機(jī)制研究具有重要的指導(dǎo)作用和意義。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示本發(fā)明檢測(cè)原理；其中圖1(A)示內(nèi)源瓜氨酸化蛋白與ACPA形成瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物(ECP)示意圖；圖1(B)示ECPElisa檢測(cè)原理示意圖；圖2示不同稀釋倍數(shù)下樣品血清ECP檢測(cè)水平；圖3示正常人與RA患者ECP水平比較。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒、該標(biāo)志物的檢測(cè)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明技術(shù)方法的原理是：以抗人瓜氨酸化抗體作為一抗包被，加樣孵育時(shí)樣品中存在的瓜氨酸化蛋白與ACPA形成免疫復(fù)合物(ECP)，ECP免疫復(fù)合物中的瓜氨酸化蛋白與包被的一抗結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合蛋白，加入標(biāo)記抗人IgG/IgM抗體作為二抗，標(biāo)記二抗與ECP免疫復(fù)合物中的ACPA結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的標(biāo)記二抗，加入二抗標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的底物進(jìn)行反應(yīng)，使用相關(guān)儀器檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，結(jié)果高低反映了樣品中ECP的含量水平(見圖1)。本發(fā)明涉及的瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物的檢測(cè)方法及相關(guān)ELISA試劑盒，包括抗瓜氨酸化抗體預(yù)包被的載體、標(biāo)記好的抗人IgG/IgM抗體以及相關(guān)的樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液。其中，上述抗瓜氨酸化抗體是指采用PAD催化牛血清白蛋白(BSA)形成的具有多種瓜氨酸化位點(diǎn)的BSA(cit-BSA)作為抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗瓜氨酸化抗體。具體位點(diǎn)為BSA蛋白的所有可以被瓜氨酸化的精氨酸位點(diǎn)；所述抗體可由市場購買得到。其中，上述cit-BSA可以用其它蛋白，尤其是人關(guān)節(jié)滑膜特有蛋白經(jīng)PAD等酶催化形成瓜氨酸化蛋白抗原免疫動(dòng)物獲得抗人瓜氨酸化抗體。具體有PAD4/PAD2兩種酶，可以將蛋白質(zhì)上的精氨酸位點(diǎn)催化形成瓜氨酸。其中，上述抗瓜氨酸化抗體預(yù)包被的載體是指將抗瓜氨酸化抗體以包被緩沖液稀釋至0.5-100ug/ml，常規(guī)包被的酶標(biāo)板。其中，上述標(biāo)記好的抗人IgG抗體是指以常規(guī)方法經(jīng)酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記、熒光素標(biāo)記或金標(biāo)記的抗人IgG，其種屬來源要求與制備瓜氨酸化抗體的種屬來源一致。具體技術(shù)方案如下：1)抗體制備采用PAD催化牛血清白蛋白(BSA)形成的具有多種瓜氨酸化位點(diǎn)的BSA(cit-BSA)，取健康免疫動(dòng)物，用cit-BSA作為抗原進(jìn)行免疫，第一次以抗原加卡介苗和弗氏佐劑研勻，注射動(dòng)物勁淋巴結(jié)或皮下肌肉組織，每二周1次，共免疫4-5次，抗原量根據(jù)動(dòng)物體重增減,免疫最后一次的二周后采血，動(dòng)物抗血清用飽和硫酸銨二級(jí)沉淀后上離子交換層析柱,得到動(dòng)物抗人瓜氨酸化抗體，測(cè)定效價(jià)，冷凍備用。所用抗體由市場購買，也可以按照此制備方法制備獲得。2)抗體標(biāo)記動(dòng)物抗人IgG/IgM抗體采用常規(guī)方法經(jīng)酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記或熒光素標(biāo)記。3)包被抗體聚苯乙烯微孔板制備取抗人瓜氨酸化抗體，用0.01M，pH7.4PBS緩沖液稀釋到0.5-100ug/ml，每孔加量100微升加入到聚苯乙烯微孔板底部，并于2-8℃條件孵育8-48小時(shí)；取出用0.01-0.5％TritonX-100洗滌4次，然后加入0.5-5％脫脂奶粉室溫封閉0.5-3小時(shí)，倒掉封閉液，37℃烘干0.5-3小時(shí)，用鋁箔袋密封包裝。其中，聚苯乙烯微孔板可采用磁珠或其它具有抗體吸附能力的介質(zhì)代替。4)其他應(yīng)用試劑：(1)包被緩沖液：PBS緩沖液(0.01M,PH7.4)；(2)封閉液：BSA、脫脂奶粉、酪蛋白(濃度在0.1％到5％范圍)；(3)稀釋液：BSA、脫脂奶粉、酪蛋白(濃度在0.1％到5％范圍)；(4)洗滌液：Tween20、TritonX-100(濃度在0.05％到1％范圍)；(5)顯色液：TMB(6)終止液：硫酸(7)其它：用于酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記或熒光素標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的底物及相關(guān)試劑。5)ECP診斷試劑盒的具體操作方法：A.用0.5-5％脫脂奶粉稀釋樣品血清或血漿5-100倍，滴加100ul的上述樣品于ELISA反應(yīng)板的樣品孔中；選取其余孔加入陰性參考品和陽性參考品；B.將反應(yīng)板置于室溫孵育0.5-3小時(shí)，使血清或血漿中瓜氨酸化蛋白與反應(yīng)板板上的抗體交聯(lián)，同時(shí)存在于血清或血漿中的ACPA與瓜氨酸化蛋白交聯(lián)形成抗原抗體免疫復(fù)合物；C.用0.01-0.5％TritonX-100洗滌液洗板4次，每次洗板0.5-5min，洗去未交聯(lián)蛋白；D.用5％脫脂奶粉稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgG抗體1:500-1:20000倍，滴加100ul抗體于反應(yīng)板樣品孔中，將平板置于室溫孵育0.5-3h，使抗人IgG抗體與反應(yīng)板上已吸附的ACPA結(jié)合；E.用0.01-0.5％TritonX-100洗滌液洗板4次，每次洗板0.5-5min，洗去未交聯(lián)抗人IgG抗體；F.滴加100ul含顯色劑TMB的顯色液，室溫下顯色反應(yīng)30min；G.滴加100ul1M硫酸的終止液終止反應(yīng)；H.用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)在400-500nm波長范圍內(nèi)選取最適吸光度下檢測(cè)光吸收值，同時(shí)以600-650nm任取一波長同時(shí)測(cè)定作為背景參考，以待測(cè)樣品吸光度與陰性參考品吸光度的比值代表樣品中ECP的濃度水平。其中，上述抗人IgG/IgM抗體可以為酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記或熒光素標(biāo)記；其中，上述所用底物對(duì)應(yīng)于各自相對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記或熒光素標(biāo)記。(1)瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物(ECP)可以作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)體外診斷的一種生物標(biāo)志物。(2)針對(duì)(1)中的生物標(biāo)志物——ECP，發(fā)明了一種檢測(cè)此生物標(biāo)志物的Elisa方法。該方法可同時(shí)檢測(cè)含IgG和IgM類抗體的瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物，也可以分別檢測(cè)含IgG類抗體的ECP和含IgM類抗體的ECP。(3)用于檢測(cè)ECP的Elisa試劑盒包括了包被酶標(biāo)板、封閉液、洗滌液、樣品稀釋液，酶標(biāo)抗體、底物、終止液。(4)(3)中所述包被酶標(biāo)板是指用抗瓜氨酸化抗體包被，經(jīng)洗滌，封閉，干燥，封裝而制成的酶標(biāo)板。(5)(4)中所述的瓜氨酸化抗體是指用體外催化形成的瓜氨酸化蛋白作為抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗瓜氨酸化抗體。(6)(4)中所述抗瓜氨酸化抗體包被濃度為0.5-100ug/ml；包被體積為50-200ul，所用包被緩沖液為常規(guī)PBS或碳酸鹽緩沖液；包被條件為2-8℃下包被8-48小時(shí)或37℃條件下包被1-8小時(shí)；(7)(4)中所述洗滌液為0.01-0.5％TritonX-100或0.01-0.5％Tween20，采用常規(guī)PBS緩沖液配制，采用手工或機(jī)器洗板。(8)(4)中所述樣品稀釋液為0.1％-5％BSA、脫脂奶粉或酪蛋白，采用常規(guī)PBS緩沖液配制。(9)(4)中所述酶標(biāo)板為聚苯乙烯材質(zhì)，聚氯乙烯材質(zhì)，或可用磁珠或其它可與抗體穩(wěn)定結(jié)合的材質(zhì)制成。(10)(3)中所述封閉液為0.1％-5％BSA、脫脂奶粉或酪蛋白，采用常規(guī)PBS緩沖液配制。(11)(3)中所述酶標(biāo)抗體為抗人IgG/IgM抗體，采用酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記或熒光素標(biāo)記。(12)(3)中所述底物與酶標(biāo)抗體所采用的標(biāo)記相對(duì)應(yīng)使用。(13)ECP檢測(cè)特異性高，在90％以上,且具有較高的靈敏度；(14)ECP檢測(cè)即可以反映ACPA的水平，又可以反映抗原抗體形成復(fù)合物的能力和水平。(15)循環(huán)中的ECP可反復(fù)沉積于關(guān)節(jié)滑膜組織，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起滑膜炎癥，造成關(guān)節(jié)損傷。ECP與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，其量的變化可以直接反映病情的進(jìn)展情況和治療的效果評(píng)價(jià)。本發(fā)明提供的標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒、該標(biāo)志物的檢測(cè)方法中所用原料及試劑均可由市場購得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1測(cè)定一例RA病人血清不同稀釋度下的瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物(ECP)水平1)血清制備采用不添加任何抗凝劑的采血管收集RA患者的新鮮血液，用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液即為血清，置于-20℃～-80℃保存?zhèn)溆谩?)ECPElisa檢測(cè)試劑盒準(zhǔn)備包被酶標(biāo)板；樣品稀釋液(5％脫脂奶粉)；洗滌液(0.5％TritonX-100)；酶標(biāo)抗體；顯色液(TMB)；終止液(1M硫酸)。3)實(shí)驗(yàn)操作步驟A.將血清樣品用樣品稀釋液稀釋10倍、20倍、50倍、100倍；分別加入反應(yīng)板的樣品孔中，每孔加入體積為100ul；B.室溫(25℃)孵育1小時(shí)；C.每孔加入洗滌液200ul，洗板4次，每次洗板2min；D.將酶標(biāo)抗體用樣品稀釋液按1:10000稀釋，每孔加入稀釋酶標(biāo)抗體100ul；E.室溫(25℃)孵育1小時(shí)；F.每孔加入洗滌液200ul，洗板4次，每次洗板2min；G.每孔加入顯色液100ul；室溫(25℃)顯色反應(yīng)30min；H.每孔加入終止液100ul；I.用酶標(biāo)儀450nm下檢測(cè)各孔的光吸收值(結(jié)果見圖2及表1)。表1血清不同稀釋度下的瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物(ECP)水平稀釋倍數(shù)OD10倍1.07820倍0.61950倍0.490100倍0.300結(jié)果表明樣品稀釋倍數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，稀釋倍數(shù)與OD值呈線性關(guān)系。本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)含IgG和IgM類抗體的瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物，也可以分別檢測(cè)含IgG類抗體的ECP和含IgM類抗體的ECP，按照上述檢測(cè)方法，檢測(cè)不同的抗體的ECP，結(jié)果見表2。表2采用不同三抗用于檢測(cè)含不同抗體的ECP采用的三抗檢測(cè)含不同抗體的ECP檢測(cè)結(jié)果(S/N)標(biāo)記的抗人IgG抗體含IgG類抗體的ECP16.89標(biāo)記的抗人IgM抗體含IgM類抗體的ECP14.84標(biāo)記的抗人IgG和IgM抗體含IgG和IgM類抗體的ECP24.77結(jié)果表明分別加標(biāo)記的抗人IgG抗體或標(biāo)記的抗人IgM抗體，或同時(shí)加標(biāo)記的抗人IgG和IgM抗體都可以檢測(cè)出陽性結(jié)果(S/N>3.2為陽性)，因此本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)含IgG和IgM類抗體的瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物，也可以分別檢測(cè)含IgG類抗體的ECP和含IgM類抗體的ECP。實(shí)施例2比較35個(gè)正常人和45例RA病人血清中瓜氨酸化抗原抗體免疫復(fù)合物(ECP)水平1)血清制備采用不添加任何抗凝劑的采血管收集正常人和RA患者的新鮮血液，用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液即為血清，置于-20℃～-80℃保存?zhèn)溆谩?)ECPElisa檢測(cè)試劑盒準(zhǔn)備包被酶標(biāo)板；樣品稀釋液(5％脫脂奶粉)；洗滌液(0.5％TritonX-100)；酶標(biāo)抗體；顯色液(TMB)；終止液(1M硫酸)。3)實(shí)驗(yàn)操作步驟A.將血清樣品用樣品稀釋液稀釋10倍；分別加入反應(yīng)板的樣品孔中，每孔加入體積為100ul；選取其余孔加入陰性參考樣品和陽性參考樣品各100ulB.室溫(25℃)孵育1小時(shí)；C.每孔加入洗滌液200ul，洗板4次，每次洗板2min；D.將酶標(biāo)抗體用樣品稀釋液按1:10000稀釋，每孔加入稀釋酶標(biāo)抗體100ul；E.室溫(25℃)孵育1小時(shí)；F.每孔加入洗滌液200ul，洗板4次，每次洗板2min；G.每孔加入顯色液100ul；室溫(25℃)顯色反應(yīng)30min；H.每孔加入終止液100ul；I.用酶標(biāo)儀450nm和630nm下檢測(cè)各孔的光吸收值，以A450-A630的差值表示樣品的光吸收值；J.結(jié)果計(jì)算：吸光度比值＝待測(cè)樣品孔的光吸收值/陰性參考樣品孔的光吸收值結(jié)果見表3、表4及圖3。表3為35例正常樣品檢測(cè)吸光度比值；表4為45例RA病人血清檢測(cè)吸光度比值表3正常樣品檢測(cè)吸光度比值表4RA病人血清檢測(cè)吸光度比值由表3、4可知：1、本發(fā)明的可行性：正常人血清中ECP水平平均值較低；RA患者血清中ECP水平平均值顯著升高(P＜0.05)，為正常人3倍。2、靈敏度和特異性：特異性為92.5％時(shí)，靈敏度為66.7％。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3