用于診斷癌侵襲性和遺傳不穩(wěn)定性的標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于從患者的癌樣本診斷所述患者中癌侵襲性和/或遺傳不穩(wěn)定性的方法，其包括：a）體外測量所述患者癌樣本中POLQ基因的表達(dá)水平和對照基因的表達(dá)水平；b）計(jì)算所述患者癌樣本中所述POLQ基因的POLQ的表達(dá)水平相對于所述對照基因的表達(dá)的表達(dá)水平比；c）比較所述POLQ表達(dá)水平比與相應(yīng)的閾值，和d）如果所述POLQ表達(dá)水平比高于相應(yīng)的閾值，則診斷癌為侵襲性和遺傳不穩(wěn)定性。本發(fā)明還描述了專用的微陣列和試劑盒，以及選擇適當(dāng)?shù)闹委煹姆椒ā?br> 【專利說明】用于診斷癌侵襲性和遺傳不穩(wěn)定性的標(biāo)記
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及癌的控制領(lǐng)域，包括所述癌的侵襲性和遺傳不穩(wěn)定性的診斷，以及適當(dāng)?shù)闹委熯x擇。本發(fā)明是在POLQ的過度表達(dá)與腫瘤的侵襲性、以及因此患者的生存高度相關(guān)這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上的。同樣其過度表達(dá)還與遺傳不穩(wěn)定性相關(guān)，其然后可用于殺傷腫瘤細(xì)胞。例如，輻射療法對已經(jīng)損傷的DNA更有效。同樣地，DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)、或DNA復(fù)制許可/起始或DNA修復(fù)抑制因子可以防止DNA損傷的信號傳導(dǎo)(signaling)或修復(fù),從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡(合成疾病致死)(synthetic sickness lethality)。
【背景技術(shù)】
[0002]癌是多元的疾病，其中一組細(xì)胞顯示出不受控的增長、侵入并摧毀相鄰組織的浸潤(invasion)，并且有時(shí)經(jīng)由淋巴或血液轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散至身體的其它部位。癌的這三種惡性性質(zhì)將其與不浸潤或轉(zhuǎn)移的良性腫瘤區(qū)分開來。
[0003]目前有一些方法被用于治療各種類型的癌，包括手術(shù)、輻射療法和化學(xué)療法。成功的癌的療法涉及原發(fā)腫瘤以及任何轉(zhuǎn)移瘤，無論是臨床上顯著的或是顯微的。
[0004]對于患者，選擇合適的治療是重要的。有必要知道為了防止侵襲性癌的擴(kuò)散，什么時(shí)候立刻使用劇烈的積極治療操作。相反地，當(dāng)患者所攜帶的腫瘤沒有必要的時(shí)候而進(jìn)行劇烈的積極治療，對于患者也是不利的。事實(shí)上，劇烈的積極治療常常導(dǎo)致不利的毒性，可能嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。例如，其中的多數(shù)是致突變性的并因此容易誘導(dǎo)繼發(fā)性腫瘤。
[0005]另外，這樣劇烈的積極治療通常是非常昂貴的，因而僅應(yīng)在必要的時(shí)候進(jìn)行。
[0006]目前，對實(shí)體瘤的治療的選擇根據(jù)腫瘤的期，其通常使用來自美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)的腫瘤/結(jié)節(jié)/轉(zhuǎn)移(TW)測試進(jìn)行。TW系統(tǒng)根據(jù)三種類型分配一個(gè)數(shù)字。“T”表示腫瘤大小，"N"表示淋巴結(jié)浸潤程度，以及“M”表示轉(zhuǎn)移程度。癌的較寬的期通常被引作數(shù)字1、I1、II1、IV，其來自預(yù)后分組的--Μ值；更高的數(shù)字代表更加進(jìn)展的癌，其可能有更不好的結(jié)果。
[0007]盡管此測試和分期(staging)系統(tǒng)提供了一些關(guān)于患者被診斷為實(shí)體癌期的有價(jià)值的信息，通常認(rèn)為其不精確和不充分。特別是，其不能鑒定腫瘤進(jìn)展的最早期。另外，?M測試不能給出腫瘤侵襲性的信息，因而其對預(yù)后的用處是有限的。最后，其對實(shí)體腫瘤是有限的。在另一方面，大多根據(jù)細(xì)胞生成改變的鑒定來表征液體腫瘤。
[0008]已描述了一些蛋白和遺傳標(biāo)志物用于意圖改善預(yù)后信息。特別是，基因表達(dá)分析允許多基因預(yù)后標(biāo)記的鑒定。然而，從不同研究中搜集的信息卻常證明為混亂的(見例如，Lenz, Gastrointest Cancer Res, I (4Suppl2):S29_32, 2007;Walther 等人，Nat Rev Cancer, 9(7):489-99, 2009;Sotiriou&Pusztai, New England J Med, 360:790-800, 2009;Subramanian.&Simon, J Natl Cancer Inst., 102:464-468，2010)。例如，同一癌的不同標(biāo)記之間的重疊可能是貧乏的。因?yàn)槎嗷驑?biāo)記主要關(guān)注細(xì)胞周期或增殖相關(guān)的基因，其可靠性也受到質(zhì)疑，因此其對標(biāo)準(zhǔn)臨床-病理(clinico-pathological)分期沒有作用。此外，每個(gè)標(biāo)記限定在癌的具體類型中。因此，這些標(biāo)記不用在常規(guī)臨床中。[0009]真正需要更好的癌的預(yù)后測試，其不僅僅改善患者的全面生存，還改善了他們的生活質(zhì)量，并且使真正能從積極的高花費(fèi)化學(xué)療法受益的患者堅(jiān)持該化學(xué)療法。特別是，需要能夠可靠用于盡可能多類型的癌的預(yù)后的單基因預(yù)后標(biāo)志物。
[0010]在正常細(xì)胞的增殖中，DNA復(fù)制是通過已知作為復(fù)制聚合酶(P0LA、P0LD和POLE)的三種DNA聚合酶進(jìn)行的?？墒牵谌祟惣?xì)胞中鑒定了 10種其它的DNA聚合酶，其被認(rèn)為是專門的聚合酶，其功能仍大部分未知。因?yàn)樗鼈兡芗庸けM管受損了的DNA的能力，所以這些專門的聚合酶看起來是經(jīng)歷了進(jìn)化而保留的。看起來這些聚合酶還是非常致突變的，其活性被嚴(yán)格控制。
[0011]POLQ (也稱為POL theta或POL Θ )是這些專門的DNA聚合酶的一種，在其N末端部分包含一個(gè)解旋酶域，在其C末端包含一個(gè)聚合酶域。盡管此特殊的專門的DNA聚合酶的功能仍大部分未知，看起來其參與基因組穩(wěn)定性的維持和DNA修復(fù)(Seki等人，EMBOJ, 23:4484-4494，2004; Masuda 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，102:13986-13991，2005，Yoshimura等人，Mol.Cell, 24:115-125, 2006)，其可能通過促進(jìn)復(fù)制起始的開始(firing)也參與DNA復(fù)制的許可和起始(未發(fā)表數(shù)據(jù))。
[0012]POLQ的表達(dá)已經(jīng)在多種腫瘤中得以分析(Kawamura等人，Int JCancer, 109:9-16,2004;Pillaire 等人，Oncogene, 29(6):876-887,2010;Lemee 等人，Proc Natl Acad Sci U S A.，107 (30): 13390-5，2010; Higgins 等人，Oncotarget, I (3): 175-184，2010)。特別是，Kawamura等人(Int J Cancer, 109:9-16，2004)在許多不同的癌性組織中檢測到POLQ mRNA表達(dá)水平的升高。然而，mRNA水平的測量通過Northern印跡法來進(jìn)行，其是一種與定量PCR等方法一樣靈敏的技術(shù)。此外，研究的患者數(shù)目非常少，因此很難 從這項(xiàng)研究中得出任何有意義的結(jié)論。例如，患腺癌的患者數(shù)目僅為
7。因此，這些結(jié)果的可靠性和顯著性似乎是還有討論的余地。本發(fā)明人分析了腫瘤相對于正常組織POLQ基因表達(dá)的變化，比較了這些數(shù)據(jù)與疾病進(jìn)展和臨床特征。其顯示POLQ在腫瘤組織中顯著地過度表達(dá)。另外，其證明POLQ的失控表達(dá)積極地有助于腫瘤進(jìn)展。事實(shí)上，POLQ過度表達(dá)導(dǎo)致遺傳的不穩(wěn)定和明顯的DNA損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明人已經(jīng)顯示POLQ在多種不同癌中過度表達(dá)，這種過度表達(dá)給出關(guān)于患者預(yù)后的信息。例如，在93例肺癌中的大多數(shù)中發(fā)現(xiàn)POLQ過度表達(dá)。無論生存期檢驗(yàn)如何(總體生存、無復(fù)發(fā)生存、無疾病生存)，這種過度表達(dá)與患者生存相關(guān)。顯著地，POLQ與患者生存之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)不依賴于腫瘤期和治療。
[0014]因而，本發(fā)明提供了用于診斷患者中癌的侵襲性的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，提高的POLQ基因表達(dá)水平表明所述癌的侵襲性。
[0015]因此，本發(fā)明提供了用于從患者的癌樣本診斷所述患者中癌的侵襲性的方法，其包括:
[0016]a)體外測量所述患者癌樣本中POLQ基因的表達(dá)水平和對照基因的表達(dá)水平，
[0017]b)計(jì)算所述患者的癌樣本中所述POLQ基因的POLQ表達(dá)水平相對于所述對照基因的表達(dá)的表達(dá)水平比，
[0018]c)比較所述POLQ表達(dá)水平比與相應(yīng)的閾值，和[0019]d)如果所述POLQ表達(dá)水平比高于相應(yīng)的閾值，則診斷癌為侵襲性。
[0020]在另一方面，本發(fā)明的方法允許檢測展現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性的癌細(xì)胞，即DNA損傷或因起點(diǎn)開始的擾動導(dǎo)致的“復(fù)制壓力”。POLQ的失控表達(dá)導(dǎo)致增加的有絲分裂的異常，例如染色單體斷裂、染色體端-端融合、雙著絲粒的染色體以及其它異常。因此，POLQ的過度表達(dá)導(dǎo)致DNA損傷和染色體的不穩(wěn)定性。
[0021]因此，本發(fā)明提供了用于從患者的癌樣本診斷所述患者中癌的遺傳不穩(wěn)定性的方法，其包括:
[0022]a)體外測量所述患者癌樣本中POLQ基因的表達(dá)水平和對照基因的表達(dá)水平，
[0023]b)計(jì)算所述患者癌樣本中所述POLQ基因的POLQ的表達(dá)水平相對于所述對照基因的表達(dá)的表達(dá)水平比，
[0024]c)比較所述POLQ表達(dá)水平比與相應(yīng)的閾值，和
[0025]d)如果所述POLQ表達(dá)水平比高于其相應(yīng)的閾值，則診斷癌為遺傳不穩(wěn)定或復(fù)制壓力。
[0026]應(yīng)該理解兩種方法可以結(jié)合。因而，在另一方面，本發(fā)明涉及用于診斷患者中癌的侵襲性和用于檢測表現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性的癌細(xì)胞的方法。因而，本發(fā)明的方法呈現(xiàn)出允許檢測與不良生存預(yù)后和遺傳不穩(wěn)定性相關(guān)的遺傳事件的優(yōu)點(diǎn)。 [0027]如本文所用，術(shù)語“癌”和“癌性的”指或描述哺乳動物中通常以細(xì)胞生長失控為特點(diǎn)的病理狀態(tài)。本文使用的術(shù)語“癌”和“癌性的”意為包括該疾病的所有期。因此，本文所用的“癌”可包括良性和惡性腫瘤兩者。有利地，所述癌是早期或中期癌?！霸?中期”，在本文中其意為包括介于IA期和IIIA期之間的癌。發(fā)生于癌前細(xì)胞中的最早期事件之一是由起點(diǎn)開始的擾動導(dǎo)致的“復(fù)制壓力”。本發(fā)明人顯示出POLQ與參與復(fù)制起始的蛋白相互作用，并且它的失控通過擾動起點(diǎn)的時(shí)間來干擾起點(diǎn)許可。本發(fā)明人顯示POLQ可能更多地參與DNA復(fù)制的起始而不是延伸。因此，POLQ是早期癌特別有用的標(biāo)志物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的癌是處于早期的癌。癌的實(shí)例包括但不限于，癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴惡性腫瘤。這樣癌的更具體的實(shí)例包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌(如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗狀細(xì)胞癌的肺癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、包括胃腸道癌和胃腸道間質(zhì)癌的胃部或胃癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝癌、乳癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎臟的或腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴(kuò)散性黑色素瘤、雀斑惡性黑色素瘤、肢端雀斑樣黑色素瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴瘤(包括低等級的/濾泡性的非霍奇金氏淋巴瘤(NHL);小淋巴細(xì)胞(SL) NHL、中間級/濾泡性NHL ;中間級的彌漫性NHL ;高等級的免疫母細(xì)胞性NHL ；高等級的淋巴母細(xì)胞性NHL ;高等級的小無核裂細(xì)胞NHL ;巨大腫塊(bulky disease) NHL ；套細(xì)胞淋巴瘤；艾滋相關(guān)淋巴瘤和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血病)；慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL);急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL);毛細(xì)胞白血?。宦运杓?xì)胞性白血??；和移植后淋巴增生性障礙(PTLD)、以及與瘢痣病相關(guān)的異常血管增生、水腫(如腦腫瘤相關(guān)的)、梅格斯綜合征、腦、以及頭頸癌，以及相關(guān)的轉(zhuǎn)移。
[0028]在具體的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法可預(yù)后的癌包括除乳癌之外的任何類型的癌。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的癌包括除結(jié)腸癌之外的任何類型的癌。在又一實(shí)施方案中，除乳癌和結(jié)腸癌之外的所有癌都對本發(fā)明的方法有響應(yīng)。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于上述的2、3、4或更多種癌的組合。
[0029]在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于肺癌。
[0030]如文中使用的，術(shù)語“P0LQ”指編碼DNA聚合酶Θ (Entrez基因ID號:10721;mRNA序列參照號:NM_199420.3;蛋白序列參照號:NP_955452.3)。此外，本發(fā)明包括所述POLQ基因的所有同種型。同種型，如此處所用，涉及POLQ基因的所有不同形式，并可能由突變造成，或可能通過可選的剪接來自同一基因。多數(shù)同種型由單核苷酸多態(tài)性或SNP、相同基因的等位基因間小的遺傳差別引起的。這些發(fā)生在一個(gè)基因內(nèi)特定的個(gè)別的核苷酸位點(diǎn)。在此定義中也包括通過采用不同的啟動子從相同的基因產(chǎn)生不同版本的信使RNA的情況，該啟動子引起越過某些外顯子的轉(zhuǎn)錄。因而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的方法不局限于POLQ本身，也包含一個(gè)或多個(gè)POLQ同種型。根據(jù)本發(fā)明的方法，測量POLQ基因和/或一個(gè)或多個(gè)其同種型的表達(dá)水平，并計(jì)算表達(dá)比。
[0031]根據(jù)本發(fā)明，癌的“侵襲性”意指所述癌浸潤相鄰組織、發(fā)生轉(zhuǎn)移的傾向以及所述浸潤可能出現(xiàn)的速度。癌的侵襲性顯然與生存相關(guān)，可以使用上述方法預(yù)后患者的生存，其中診斷為侵襲性的病例導(dǎo)致不好的生存預(yù)后，而沒有侵襲性的診斷則產(chǎn)生良好的生存預(yù)后。
[0032]如文中使用的，癌的“遺傳不穩(wěn)定性”意指所述癌的腫瘤細(xì)胞具有遭受DNA損傷或“復(fù)制壓力”(例如休眠起點(diǎn)的再激活)的傾向。遺傳不穩(wěn)定性是更加常常發(fā)生DNA損傷的癌的標(biāo)志。通過“DNA損傷”，表明對DNA的損傷通過引起DNA的共價(jià)修飾、DNA斷裂或使其偏離其正常的雙螺旋構(gòu)象而影響DNA的正常功能。DNA損傷包括結(jié)構(gòu)變形，其干擾復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，以及能使堿基對斷裂并改變DNA序列的點(diǎn)突變。一般而言，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時(shí)，細(xì)胞周期停止在三個(gè)檢驗(yàn)點(diǎn)之一(GI/S、S期內(nèi)或G2/M)。細(xì)胞周期停止可導(dǎo)致DNA修復(fù)過程的激活(在DNA損傷相對小的情況)，或者導(dǎo)致凋亡的誘導(dǎo)(在嚴(yán)重的DNA損傷的情況)。
[0033]DNA損傷可由內(nèi)源的過程自發(fā)產(chǎn)生，如由正常代謝產(chǎn)生的活性氧和自由基引起的堿基的氧化和DNA鏈中斷的發(fā)生，在DNA復(fù)制期間由DNA聚合酶產(chǎn)生的堿基的甲基化、脫嘌呤、脫嘧啶、堿基的錯(cuò)配等等。DNA損傷也可以由環(huán)境危害引起，如輻射(例如，紫外線輻射、X-射線、Y射線、電離輻射)、天然毒素(例如，植物毒素)、合成毒素、藥物(例如，癌癥化學(xué)療法，輻射療法)，烷化劑，等等。DNA損傷可導(dǎo)致或來自于各種疾病，包括遺傳性的遺傳疾病和由于暴露于環(huán)境危害引起的疾病。DNA損傷也可由吸煙(煙包含遺傳毒性的芳香化合物)弓丨起，其導(dǎo)致例如心臟病，或由其它疾病如癌(包括肺癌)的治療引起。
[0034]使用待檢測患者的癌樣本進(jìn)行上述方法。在某些情況中，根據(jù)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括從患者獲取癌樣本的預(yù)備步驟。通過“癌樣本”，指腫瘤組織樣本。甚至在癌患者中，腫瘤位點(diǎn)的組織也包括非腫瘤的健康組織。因而“癌樣本”應(yīng)當(dāng)被限定于取自患者的腫瘤組織。所述“癌樣本”可以是活檢樣本或取自外科手術(shù)切除療法的樣本。
[0035]另外，根據(jù)本發(fā)明的方法可以在從患者獲取樣本以及如上述步驟a)之間包括其它的預(yù)備步驟，相應(yīng)的為將癌樣本(以及任選地健康的組織樣本)轉(zhuǎn)換成mRNA(或相應(yīng)的cDNA)樣本或轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)樣本，隨后其可備用于步驟a)中的體外基因表達(dá)水平的測量。mRNA(以及逆轉(zhuǎn) 錄為cDNA)或蛋白質(zhì)從組織樣本中的制備或提取僅僅是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)程序。[0036]一旦獲得了即用的癌mRNA (或?qū)?yīng)的cDNA)或蛋白質(zhì)樣本，可進(jìn)行POLQ基因表達(dá)水平的測量，其取決于轉(zhuǎn)換和可獲得的即用樣本的類型，是在mRNA(即，根據(jù)樣本中mRNA的含量)還是在蛋白質(zhì)(即，根據(jù)樣本中蛋白質(zhì)的含量)水平。在某些實(shí)施方案中，可以在mRNA水平測量一些基因的表達(dá)水平，而在蛋白質(zhì)的水平測量其它基因的表達(dá)水平。在這個(gè)情況中，取自患者的癌樣本的一部分被轉(zhuǎn)換為mRNA (或?qū)?yīng)的cDNA)樣本而另一部分被轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)樣本。在其它實(shí)施方案中，所有被測試的基因的表達(dá)水平是在mRNA水平測量或在蛋白質(zhì)水平測量。
[0037]當(dāng)在mRNA水平測量表達(dá)水平時(shí)，顯著地可以使用熟知的技術(shù)進(jìn)行，如定量PCR或核酸微陣列技術(shù)(包括cDNA和寡核苷酸微陣列)。這些技術(shù)現(xiàn)在已被本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用，因此不需要在此詳細(xì)地描述。使用定量PCR的實(shí)施方案的實(shí)施例在實(shí)驗(yàn)部分描述?？蛇x地，可以使用允許根據(jù)mRNA含量評價(jià)基因表達(dá)水平的任何已知或未來技術(shù)。例如，可以使用原位雜交中偶聯(lián)熒光的組織微陣列。組織微陣列(也稱為TMA)由石蠟塊組成，其中多至1000個(gè)獨(dú)立的組織核以陣列形式組裝，以允許多重組織學(xué)分析。在組織微陣列技術(shù)中，使用空心針從石蠟包埋的組織(如臨床活檢或腫瘤樣本)的目標(biāo)區(qū)域取出直徑小如0.6mm的組織核。然后將該組織核以精確的空間陣列模式插入受體石蠟塊中。使用切片機(jī)對所述塊切片，裝于顯微鏡玻片上，然后通過任何標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)分析的方法分析。每個(gè)微陣列塊可被切為100-500個(gè)切片，其可被用于獨(dú)立的測試。在組織微陣列中通常采用的測試包括免疫組織化學(xué)和原位雜交中的熒光。對于在mRNA水平的分析，可以將組織微陣列技術(shù)偶聯(lián)至原位雜交中的熒光。
[0038]當(dāng)在蛋白質(zhì)水平測量表達(dá)水平時(shí)，顯著地可以使用特異性的抗體進(jìn)行，特別地使用熟知的技術(shù)，如Western印跡、ELISA或ELISP0T、抗體微陣列、或偶聯(lián)免疫組織化學(xué)的組織微陣列。
[0039]通過計(jì)算所述患者癌樣本中的POLQ基因的表達(dá)水平相對于對照基因表達(dá)水平的表達(dá)水平比，通過比較得到的表達(dá)水平比與相應(yīng)的閾值，進(jìn)行所述患者的癌樣本中被測量基因的表達(dá)水平的比較。根據(jù)本發(fā)明，所述的對照基因是在所有細(xì)胞類型中表達(dá)的基因。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的對照基因是在構(gòu)成腫瘤位點(diǎn)的組織的所有細(xì)胞中表達(dá)的基因。在另一方面，對照基因的表達(dá)水平不受細(xì)胞狀態(tài)的影響，即，在健康細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中對照基因表達(dá)為相同的水平。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，對照基因是管家基因。管家基因是在所有細(xì)胞類型中表達(dá)的基因，其為所有細(xì)胞類型的維持提供了基本的功能。人類管家基因的列表可在Eisenberg等人(Trends in Geneticsl9:362_365, 2003)中找到。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的管家基因是選自 B2M、TFRC, YffHAZ, RPLO, 18S、GUSB, UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB,PGKU HPRTU IP08和HMBS的基因。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步優(yōu)選的管家基因選自IP08、HMBS,GUSB 和 UBC。
[0040]根據(jù)本發(fā)明，“閾值”意指允許區(qū)分樣本的值，其中目標(biāo)基因的表達(dá)水平比對應(yīng)于患者癌樣本中所述目標(biāo)基因或低或高的表達(dá)水平。特別地，如果基因表達(dá)水平比低于或等于閾值，那么在患者癌樣 本中的該基因表達(dá)水平被認(rèn)為是低的，而如果基因表達(dá)水平比高于閾值，那么在患者癌樣本中的該基因表達(dá)水平被認(rèn)為是高的。對于每個(gè)基因，且取決于用于測量基因表達(dá)水平的方法的不同，最佳的閾值可不同。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于多種對照癌樣本的分析以及比較其與對照基因(例如，管家基因)的表達(dá)，可以容易地確定該閾值，在所述對照癌樣本中對于該特定基因的表達(dá)水平(低或高)是已知的。
[0041]本發(fā)明進(jìn)一步涉及專用于實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明方法的微陣列，其包括最多500個(gè)、優(yōu)選最多300個(gè)、最多200個(gè)、更優(yōu)選最多150個(gè)、最多100個(gè)、甚至更優(yōu)選最多75個(gè)、最多50個(gè)、最多40個(gè)、最多30個(gè)、最多20個(gè)、最多10個(gè)不同的探針，其中至少I個(gè)特異性地結(jié)合POLQ mRNA (或相應(yīng)的cDNA)或蛋白質(zhì)。
[0042]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微陣列是核酸微陣列，其包括最多500個(gè)、優(yōu)選最多300個(gè)、最多200個(gè)、更優(yōu)選最多150個(gè)、最多100個(gè)、甚至更優(yōu)選最多75個(gè)、最多50個(gè)、最多40個(gè)、最多30個(gè)、最多20個(gè)、最多10個(gè)不同的探針(因而，例如排除了全基因組(pangenomic)微陣列),其中至少I個(gè)特異性地與POLQ mRNA (或相應(yīng)的cDNA)雜交。除特異性地雜交POLQ的探針外，所述微陣列還包含至少一個(gè)特異性地雜交管家基因的探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述管家基因選自B2M、TFRC, YffHAZ, RPL0、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGKl、HPRTl、IP08 和 HMBS。更優(yōu)選地，管家基因選自 IP08、HMBSjUSB和UBC基因。根據(jù)本發(fā)明，“核微陣列”由不同的核酸探針組成，其附著于基底，該基底可以是微芯片、玻片或微球大小的珠。微芯片可以由聚合物、塑料、樹脂、多糖、硅或基于硅的物質(zhì)、碳、金屬、無機(jī)玻璃或硝化纖維構(gòu)成。探針可以是核酸，例如cDNA (“cDNA微陣列”)或寡核苷酸(“寡核苷酸微陣列”，寡核苷酸長度為大約25至大約60個(gè)堿基對或更短)。
[0043]可選擇地，在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列可以是抗體微陣列，其包括最多500個(gè)、優(yōu)選最多300個(gè)、最多200個(gè)、更優(yōu)選最多150個(gè)、最多100個(gè)、甚至更優(yōu)選最多75個(gè)、最多50個(gè)、最多40個(gè)、最多30個(gè)、最多20個(gè)、最多10個(gè)不同的抗體，其中至少I個(gè)特異性地結(jié)合POLQ蛋白質(zhì)。除特異性地結(jié)合POLQ蛋白質(zhì)的抗體外，所述微陣列還包含至少一個(gè)特異性地結(jié)合管家蛋白質(zhì)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述管家蛋白質(zhì)選自B2M、TFRC、YWHAZ、RPL0、18S、(；USB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08 和 HMBS 蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述管家蛋白質(zhì)選自IP08、HMBS、⑶SB和UBC蛋白質(zhì)。
[0044]除核酸或抗體微陣列技術(shù)外，可以使用定量PCR，因而待檢測的基因特異的擴(kuò)增引物對于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法也非常有用。因而，本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于從患者的癌樣本中診斷所述患者癌的侵襲性和遺傳不穩(wěn)定性的試劑盒，其包括如上所述的專用微陣列或POLQ特異的擴(kuò)增引物。在此，當(dāng)試劑盒包含擴(kuò)增引物時(shí)，所述試劑盒還可包含其它基因特異的擴(kuò)增引物，所述試劑盒優(yōu)選包含最多100、最多75、50、最多40、最多30、優(yōu)選最多25、最多
20、最多15、更優(yōu)選最多10、最多8、最多6、甚至更優(yōu)選最多5、最多4、最多3或甚至2或I或甚至O對其它基因而非POLQ特異的擴(kuò)增引物。例如，除POLQ的引物外，所述試劑盒可以包含至少一對用于至少一個(gè)管家基因的擴(kuò)增引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述管家基因選自B2M、TFRC, YffHAZ, RPLO, 18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKl、HPRTl、IP08和HMBS。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述管家基因選自IP08、HMBS、⑶SB和UBC基因。
[0045]如上提及的，預(yù)后與其侵襲性相關(guān)聯(lián)的癌進(jìn)展的能力，對于選擇適當(dāng)?shù)闹委煼浅Ｖ匾碛墒浅齻鹘y(tǒng)的外科治療外，每次必要時(shí)且僅在必要時(shí)，使用具有潛在嚴(yán)重副作用的劇烈且昂貴的治療。因而，本發(fā)明還涉及用于在患者中選擇適當(dāng)?shù)陌┲委煹姆椒?，其包?
[0046]a)使用如上所述的根據(jù)本發(fā)明的方法診斷所述患者中所述癌是或不是侵襲性，以及
[0047]b)如果所述癌在步驟a)中診斷為侵襲性，則在外科治療中增加輔助的輻射療法或化學(xué)療法。
[0048]除了其對癌侵襲性的預(yù)后價(jià)值外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)基于POLQ表達(dá)水平分析的相同測試也允許診斷是否存在遺傳不穩(wěn)定性，因而導(dǎo)致上述方法可用于診斷遺傳不穩(wěn)定性。特別地，本發(fā)明人顯示失控的POLQ表達(dá)與DNA斷裂頻率的增加相關(guān)。因而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用于診斷DNA斷裂。
[0049]這種遺傳不穩(wěn)定性以及DNA斷裂頻率的顯著增加，可能導(dǎo)致有關(guān)輔助療法的選擇。特別地，遺傳不穩(wěn)定性可能有助于腫瘤細(xì)胞突變，以及因此增殖和粘附的失控，DNA損傷的出現(xiàn)也可被用于抗腫瘤細(xì)胞。事實(shí)上，對于連續(xù)的增殖，那些DNA斷裂被修復(fù)，而具有大量DNA損傷的細(xì)胞通常容易引起細(xì)胞死亡。結(jié)果，輻射療法可能不能在所有情況中有效，但其對已經(jīng)存在增加的DNA斷裂頻率的腫瘤細(xì)胞的效率可被改善。例如，輻射療法可能對于被本發(fā)明的方法鑒定的POLQ過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞高度有效，原因是這些細(xì)胞含有高水平的DNA斷裂和染色體不穩(wěn)定性。以同樣的方式，使用DNA修復(fù)抑制因子可允許凍結(jié)DNA斷裂而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。
[0050]事實(shí)上，發(fā)明人顯示DNA修復(fù)的抑制導(dǎo)致POLQ過度表達(dá)的細(xì)胞的活力降低。如在實(shí)驗(yàn)例中所示，POLQ過度表達(dá)的細(xì)胞顯示對DNA修復(fù)抑制因子增加的敏感性。
[0051]因而，本發(fā)明還涉及用于預(yù)后輻射療法或DNA修復(fù)抑制因子在患者癌的治療中效率的方法，其包括:
[0052]a)使用如上所述的根 據(jù)本發(fā)明的方法診斷所述患者的所述癌是或不是遺傳不穩(wěn)定性，和
[0053]b)如果在步驟a)診斷為遺傳不穩(wěn)定性，則預(yù)后輻射療法或DNA修復(fù)、DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)或DNA復(fù)制許可/起始抑制因子的效率。
[0054]根據(jù)本發(fā)明，“DNA修復(fù)抑制因子”意指能夠抑制DNA斷裂(特別是雙鏈DNA斷裂)修復(fù)的分子。然而，這種表述不應(yīng)當(dāng)被理解為限定性的，DNA修復(fù)抑制因子的實(shí)例包括DNA修復(fù)蛋白 PARP 的抑制因子(參見，例如 W02004080976、W02005/053662、W02009/046205)、組蛋白脫乙酰基酶的抑制因子，如PCT申請W02008/082856中描述的那些，和DNA聚合酶β的抑制因子(參見W02007001684)?！癉NA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)抑制因子”是能夠阻斷參與DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)中任何蛋白質(zhì)活性的分子。此種蛋白質(zhì)的實(shí)例包括ATM/ATR、Chk2和Chkl?！癉NA復(fù)制許可/起始抑制因子”是能夠阻斷參與DNA復(fù)制許可中任何蛋白質(zhì)活性的分子，例如Cdtl、Cdc6、Mcml-7和其它為技術(shù)人員所知的。
[0055]本發(fā)明還涉及用于治療患過度表達(dá)POLQ的癌的患者的方法,其包括對所述患者實(shí)施輻射療法和/或向所述患者施用有效量的一種或多種DNA修復(fù)抑制因子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]圖1:P0LQ基因表達(dá)水平對患者的癌特異性生存的影響。(A)根據(jù)原發(fā)腫瘤中DNAPOLQ表達(dá)水平與相鄰正常組織相比，肺腺癌患者的Kaplan-Meier總體生存?；颊?n=93 ；表明來自每次對數(shù)秩(log-rank)檢驗(yàn)的P值。(B)根據(jù)原發(fā)腫瘤中DNA POLQ表達(dá)水平與相鄰正常組織相比，肺腺癌患者的Kaplan-Meier無進(jìn)展生存?；颊?n=93;表明來自每次對數(shù)秩檢驗(yàn)的P值。(C)根據(jù)原發(fā)腫瘤中DNA POLQ表達(dá)水平與相鄰正常組織相比，肺腺癌患者的Kaplan-Meier無復(fù)發(fā)生存?；颊?n=93;表明來自每次對數(shù)秩檢驗(yàn)的p值。[0057]圖2 =POLQ基因過度表達(dá)對敏感于DNA修復(fù)抑制因子的細(xì)胞的影響。使用亞有效(sub-efficient)劑量的PARP抑制因子處理使用攜帶POLQ的pcDNA載體(A)或?qū)?yīng)的空白載體(C)轉(zhuǎn)染的肺MRC5成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物，并監(jiān)測細(xì)胞增殖。在亞致死(sub-lethal)劑量(4Gy)下輻射使用攜帶POLQ的載體(B)或?qū)?yīng)的空白載體(D)轉(zhuǎn)染的MRC5細(xì)胞的培養(yǎng)物，在PARP抑制因子存在下監(jiān)測細(xì)胞增殖。
[0058]圖3:P0LQ消耗對DNA復(fù)制的影響。在轉(zhuǎn)染有POLQ siRNA的MRC5細(xì)胞中評估POLQ消耗對S期的影響，并與LUC siRNA對照(Ctrl)作比較:(A)在胸苷追蹤后(thymidinechase) 8小時(shí)處于S期的細(xì)胞平均數(shù)的定量；(B) PCNA染色陽性的細(xì)胞的平均數(shù)的定量；(C)相對于肌動蛋白轉(zhuǎn)錄物的細(xì)胞周期蛋白E的mRNA水平的定量。
【具體實(shí)施方式】
[0059]實(shí)施例
[0060]1.材料與方法
[0061]1.1.研究設(shè)計(jì)、患者和腫瘤樣本、差異的基因表達(dá)
[0062]在2006年至2010年間，在圖盧茲大學(xué)Rangueil-Larrey (無對應(yīng)中譯文)醫(yī)學(xué)中心(法國)選擇93位攜帶I至IIIA期的肺腺癌的患者。本研究包含的患者的評估標(biāo)準(zhǔn)是冷凍的腫瘤組織和相鄰的非腫瘤組織的有效性、以及獲得非常高質(zhì)量的RNA樣本的可能性。排除標(biāo)準(zhǔn)是非腺癌組織學(xué)、IHB或IV期的腫瘤、或少于70%的腫瘤細(xì)胞的比例。
[0063]基于臨床和解剖病理學(xué)數(shù)據(jù)使用--Μ系統(tǒng)來確定腫瘤期。解剖病理學(xué)家對腫瘤形態(tài)的分析依據(jù)2004年的 世界衛(wèi)生組織分類(Travis, William D;Brambilla, Elisabeth;MulIer-Hermelink, H Konrad 等人，eds, Pathology and Genetics of Tumours ofthe Lung, Pleura, Thymus and Heart, World Health Organization Classification ofTumours, Lyon:1ARC Press, 2004)來進(jìn)行。只有包含70%以上腫瘤細(xì)胞的腫瘤才能留作本發(fā)明分析。
[0064]所有的腫瘤組織樣本為外科收集的，即刻放于液氮中速凍，并儲藏直至RNA提取。使用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的說明來制備腫瘤RNA。在提取過程中，通過在60個(gè)10 μ m厚的或者5個(gè)300 μ m厚的冰凍組織切片上進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，來控制所有的腫瘤樣本使其具有足夠的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成(cellularity) (即，>70%的腫瘤細(xì)胞)。同樣地，用蘇木精-伊紅玻片對每個(gè)正常樣本的玻片染色，由病理學(xué)家分析。檢查每一個(gè)正常樣本，以(i)確保沒有任何贅生病變；(ii)定量正常上皮、纖維和脂肪成分百分比。使用Agilent BioAnalyzer2100評價(jià)所有法國人RNA樣本的質(zhì)量和數(shù)量,僅選擇呈現(xiàn)合適比28S/18S(≥ 1.7)和具有合適的 RNA 完整指數(shù)(RNA integrity number) (RIN ≥ 7)的 RNA用于分析。
[0065]使用High-Capacity cDNA Archive 試劑盒(Applied Biosystems)逆轉(zhuǎn)錄總 RNA。使用TaqMan低密度陣列(Applied Biosystems) 一式三份地測量轉(zhuǎn)錄水平。使用TaqManUniversal PCR Master Mix 和 TaqMan 低密度陣列技術(shù)(Applied Biosystems)從腫瘤和正常樣本中一式三份地?cái)U(kuò)增所有被研究的基因。使用TaqMan低密度陣列技術(shù)和7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過使用從各cDNA擴(kuò)增的4個(gè)對照(GUSB、HMBS, IP08和UBC)，基因表達(dá)在樣品之間得以歸一化。通過使用GeNorm程序，選擇這4個(gè)對照基因作為在TaqMan低密度人內(nèi)源對照陣列(Applied Biosystems)上被測試的16個(gè)中最穩(wěn)定的(B2M、TFRC, YffHAZ, RPL0、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKl、HPRTl、IP08、HMBS)。
[0066]用于分析每個(gè)測試和對照基因的引物DNA序列內(nèi)容和Applied Biosystems的參照都選自 Applied Biosystem 網(wǎng)站(http: //products, appliedbiosystems, com)。在
稀釋100倍的不同探針存在時(shí)以及TaqMan? Preamp Master Mix (Early Access)試劑(Applied Biosystems)存在時(shí)，在 StepOne 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems)中以14個(gè)循環(huán)擴(kuò)增cDNA。預(yù)先擴(kuò)增的產(chǎn)物隨后稀釋5倍。預(yù)先擴(kuò)增的cDNA隨后在Master Mix (Applied Biosystems)存在下重懸于DNA結(jié)合樣本上樣試劑緩沖液(AppliedBiosystems)中。同時(shí)，每探針在分析上樣試劑緩沖液(Applied Biosystems)中稀釋至1/100。在Fluidigm Biomark?中進(jìn)行擴(kuò)增。預(yù)先擴(kuò)增的cDNA和探針分開上樣于96.96動態(tài)陣列(Dynamic Array) (Fluidigm)。在 Biomark Reader (Fluidigm)上進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)的檢測。
[0067]分析參數(shù)如制造者的建議(質(zhì)量閾值=0.65;基線校正=線性；Ct閾值法=自動全面)。Fluidigm PCR數(shù)據(jù)以單拷貝(monoplicates)形式生成；它們隨后用GenEx軟件(http: //genex.gene-quantification.1nfo/, MultiD)來分析，使用下列規(guī)程:&)使數(shù)據(jù)相對于TLDA鑒定的管家基因(⑶SB、IP08、UBC、HMBS)進(jìn)行歸一化:組織中的Ct一同一組織中4個(gè)管家基因的Ct平均值，2)腫瘤組織相對于相鄰非腫瘤組織的歸一化:RNA拷貝數(shù)=2ACt?？杀容^腫瘤組織與相鄰非腫瘤組織的比:Nrel=2ACt正常/2ACt腫瘤=2A(Ct正常-Ct腫瘤)。若Nrel>l則基因過度表達(dá)，若Nrel〈l則基因低表達(dá)，3/二項(xiàng)式轉(zhuǎn)化(binomial transformation):為獲得允許統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)性能的正態(tài)分布:Log2(Nrel)=Log2(2ACt正常/2ACt腫瘤)=Ct正常-Ct腫瘤。若Ct健康-Ct腫瘤>0貝丨J基因過度表達(dá)，若Ct健康-Ct腫瘤〈O則基因低表達(dá)。
[0068]1.2統(tǒng)計(jì)分析
[0069]作為第一步，對于每個(gè)被研究的基因，通過二項(xiàng)式檢驗(yàn)來評估觀察到50%以上的患者過度表達(dá)或低表達(dá)所述基因的可能性(閾值:對于過度表達(dá)Nrel>2，對于低表達(dá)Nres<l/2)0顯著水平是0.05,Benjamini和Yekutieli的程序用作評估測試的多重性。用非參數(shù)Spearman’s相關(guān)性(Spearman’s rho)評價(jià)基因之間的相關(guān)性。通過卡方檢驗(yàn)或Fisher s精確檢驗(yàn)，來比較表達(dá)水平(根據(jù)Nrel分布的百分位點(diǎn)分為3類)相對于治療(僅有手術(shù)、手術(shù)-化學(xué)療法-輻射療法、或手術(shù)-化學(xué)療法)、腫瘤分級(n*?m)、腫瘤分化(很少分化、中等分化、或完全分化)、栓的存在、以及吸煙習(xí)慣。與表達(dá)水平(分為3類)相關(guān)的患者的生存通過Kaplan Meier方法來評估，并通過對數(shù)秩檢驗(yàn)來比較。與基因表達(dá)水平相關(guān)的生存用Cox模型以多變量來分析。
[0070]1.3POLQ 的亞克隆
[0071]將人POLQ cDNA 以 2 步轉(zhuǎn)移至載體 pcDNA3.1 (Invitrogen)中。首先用 RsrII和 XhoI 消化含有 POLQ cD NA 的 pFast Bac HTC POLQ (Seki 等人，Nucleic AcidsRes.31:6117-6126，2003)，給出 POLQ cDNA 的 N端部分(1.2kb)。隨后該產(chǎn)物先被EcoRV和XhoI消化，而后被插入pcDNA3.1 (Invitrogen)。然后通過用XhoI和SacII消化pFast BacHTC POLQ分離POLQ cDNA的C端部分(6.7kb)，用XhoI消化該載體后，將C端部分插入已含有POLQ cDNA的N端部分的pcDNA3.1載體中的。然后確認(rèn)POLQ cDNA的完整序列。
[0072]1.4細(xì)胞工程
[0073]如(Pillaire等人，Cell Cycle6:471-7, 2007)所述，使 MRC5-SV 細(xì)胞(ATCC)生長并轉(zhuǎn)染。還如(Bergoglio 等人，J Cell Sciencell5:4413-4418, 2002)公開的，進(jìn)行細(xì)胞周期分析研究。如前所公開的(Bergoglio等人,J Cell Sciencell5:4413_4418, 2002),進(jìn)行細(xì)胞周期分析和細(xì)胞毒性研究。秋水仙酰胺處理3小時(shí)后收集細(xì)胞，制備中期涂片(spread)ο對于每個(gè)克隆，在3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中最少分析100個(gè)中期,通過學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算P 值(Bergoglio 等人，Cancer Res62:3511_3514, 2002)。
[0074]2.結(jié)果
[0075]2.1.大多DNA復(fù)制基因在配對的(coupled)肺腫瘤中失控
[0076]根據(jù)選擇的多于80個(gè)基因，生成93例配對原發(fā)性肺腺癌在進(jìn)展的不同期的基因表達(dá)譜(表1)，所述基因已知在DNA復(fù)制的起始/許可、跨損傷(translesional, TLS)或常規(guī)的DNA延伸、DNA損傷反應(yīng)(DDR)、DNA叉保護(hù)或復(fù)制引發(fā)的雙螺旋斷裂的修復(fù)中起作用。
[0077]特別地，通過實(shí)時(shí)PCR分析顯示POLQ在93例患者的大多數(shù)中高度表達(dá)。事實(shí)上，與所述患者的相鄰對照組織(N)相比，POLQ在腫瘤組織(T)中上調(diào)(表1)。
[0078]表1:在配對的NSCLC腫瘤中POLQ的差異表達(dá)
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種用于從患者的癌樣本診斷所述患者中癌的侵襲性的方法，其包括: a)體外測量所述患者癌樣本中POLQ基因和/或一種或多種其同種型的表達(dá)水平、和對照基因的表達(dá)水平， b)計(jì)算所述患者癌樣本中所述POLQ基因和/或同種型的POLQ和/或一種或多種其同種型的表達(dá)水平相對于所述對照基因的表達(dá)的表達(dá)水平比， c)比較所述基因表達(dá)水平比與相應(yīng)的閾值，和 d)如果所述比高于其相應(yīng)的閾值，則診斷癌為侵襲性。
2.一種用于從患者的癌樣本診斷所述患者中癌的遺傳不穩(wěn)定性的方法，其包括: a)體外測量所述患者癌樣本中POLQ基因和一種或多種其同種型的表達(dá)水平、和對照基因的表達(dá)水平， b)計(jì)算所述患者癌樣本中所述POLQ基因和/或同種型的POLQ和/或一種或多種其同種型的表達(dá)水平相對于所述對照基因的表達(dá)的表達(dá)水平比， c)比較所述基因表達(dá)水平 比與相應(yīng)的閾值，和 d)如果所述比高于其相應(yīng)的閾值，則診斷癌為遺傳不穩(wěn)定性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌既不是乳癌也不是結(jié)腸直腸癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌是肺癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對照基因是管家基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述管家基因是選自B2M、TFRC、YWHAZ、RPL0、18S、(；USB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IP08 和 HMBS 的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述基因選自IP08、HMBS,⑶SB和UBC。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表達(dá)水平在mRNA水平上測量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述表達(dá)水平使用定量PCR或微陣列技術(shù)加以測量。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表達(dá)水平在蛋白質(zhì)水平上測量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述表達(dá)水平使用特異性抗體加以測量。
12.—種包含至多500個(gè)探針的微陣列，其中至少一個(gè)探針特異性地與POLQ雜交。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的微陣列，其中至少一個(gè)其它探針特異性地與選自B2M、TFRC, YffHAZ, RPL0、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKl、HPRTl、IP08 和HMBS的基因雜交。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的微陣列，其中所述基因選自IP08、HMBS、⑶SB和UBC。
15.一種用于從患者的癌樣本中診斷所述患者乳癌的侵襲性和/或遺傳不穩(wěn)定性的試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)所述的微陣列或POLQ特異性擴(kuò)增引物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括特異于選自B2M、TFRC、YWHAZ、RPL0、18S、⑶SB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、P0LR2A、ACTB, PGKl、HPRTl、IP08 和 HMBS 的基因的擴(kuò)增引物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述基因選自IP08、HMBS,⑶SB和UBC。
18.一種用于選擇患者中癌的適當(dāng)治療的方法，其包括:a)使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法診斷所述患者中所述癌是否為侵襲性，和 b)如果所述癌在步驟a)中診斷為侵襲性，則在外科治療中增加輔助的輻射療法或化學(xué)療法。
19.一種用于預(yù)后輻射療法或DNA修復(fù)、DNA損傷信號傳導(dǎo)或核苷酸代謝抑制因子在患者癌的治療中效率的方法，其包括: a)使用根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法診斷所述患者的所述乳癌是否為遺傳不穩(wěn)定性，和 b)如果在步驟a)中診斷為遺傳不穩(wěn)定性，則預(yù)后輻射療法或DNA修復(fù)抑制因子的效率。`
【文檔編號】G01N33/574GK103827314SQ201280023741
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月18日
【發(fā)明者】C·卡佐, J-S·奧夫曼 申請人:國家科學(xué)研究中心