對(duì)hec1活性調(diào)節(jié)劑具有反應(yīng)的癌癥的生物標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】所考慮的組合物和方法涉及到用Hec1抑制劑進(jìn)行腫瘤疾病治療的相關(guān)的生物標(biāo)記和方法。Hec1(HEC)、Rb(RB1)和/或p53(TP53)的基因狀態(tài)和/或表達(dá)水平可用作對(duì)Hec1抑制劑治療的敏感性的生物標(biāo)記。另外，當(dāng)與細(xì)胞毒性藥聯(lián)用時(shí)，Hec1抑制劑可顯示出協(xié)同效應(yīng)。
【專利說(shuō)明】對(duì)HEC1活性調(diào)節(jié)劑具有反應(yīng)的癌癥的生物標(biāo)記
[0001] 本申請(qǐng)要求于2011年11月21日申請(qǐng)的、同時(shí)待審的序列號(hào)為61/562, 177的美 國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明領(lǐng)域是鑒定和使用用于判定增殖性疾病對(duì)分子靶向治療藥的敏感性的生 物標(biāo)記，尤其是HEC1抑制劑與細(xì)胞毒性劑組合。
[0003] 發(fā)明背景 在2012年美國(guó)預(yù)計(jì)有超過(guò)160萬(wàn)個(gè)新增癌癥診斷病例，且有約580, 000人死于癌癥。 癌癥是目前美國(guó)第二最常見(jiàn)的致死病因，僅次于首位致死疾病心臟病。雖然在過(guò)去十年中， 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出各種新的癌癥治療方法，但在1999年和2006年之間，所有診斷出癌癥的5年相 對(duì)生存率為68%，估計(jì)死亡率對(duì)于肺癌的男性和女性分別為28%和26%，女性乳腺癌是15%， 前列腺癌是11%。這些統(tǒng)計(jì)資料表明迫切需要進(jìn)一步改善可用的治療。
[0004] 通過(guò)利用生物標(biāo)記譜以更有效地預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物的反應(yīng)并減少花費(fèi)在讓疾病發(fā) 展的無(wú)效治療上的時(shí)間，個(gè)性化醫(yī)療已經(jīng)革新了現(xiàn)有醫(yī)學(xué)治療的試驗(yàn)及出錯(cuò)過(guò)程并改善了 患者的反應(yīng)率。至少在某些情況下，這種做法允許更有靶向從而更有效的治療，突出在定制 提1?治療成功率的患者治療方案中使用生物標(biāo)記的潛在利益。
[0005] 例如，在第47屆美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)年會(huì)（Annual Meeting of the American Society of Clinical 0ncology，2011 年 6 月）上，來(lái)自 MD 安德森癌癥中心（Anderson Cancer Center)的Tsimberidou等人提交了一份研究，描述了在帶有一個(gè)基因畸變的175 例患者中，靶向PIK3CA、mTOR、BRAF、MEK、multikinases、KIT或EGFR的成功治療方案。這 項(xiàng)研究說(shuō)明，相匹配的靶向療法的反應(yīng)率為27%，而不相匹配療法治療的患者反應(yīng)率為5%。 Duffy和Crown (Clinical Chemistry, 2008，54(11) :1770-1779)描述了改善用于個(gè)性化 醫(yī)療的治療后果的至少某些成功的其它標(biāo)記。該文以及本文討論的所有其它外部引用材料 都通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。當(dāng)所結(jié)合的文獻(xiàn)中某術(shù)語(yǔ)的定義或使用與本文所提供 的該術(shù)語(yǔ)的定義不一致或有矛盾時(shí)，則該術(shù)語(yǔ)的定義以本文提供的為準(zhǔn)，而不適用于文獻(xiàn) 中的定義。
[0006] 錯(cuò)誤的染色體分離以及不受控制的有絲分裂增殖是腫瘤疾病的標(biāo)志。然而，盡 管有越來(lái)越多的腫瘤標(biāo)記可使用，但仍然缺乏指示對(duì)靶向紡錘體和著絲粒的調(diào)控或有絲 分裂檢查點(diǎn)控制的藥物的敏感度的標(biāo)記。例如，Heel是紡錘體檢查點(diǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵 組分，其在癌癥中高度表達(dá)并有助于在細(xì)胞分裂期間確保染色體的正確分離。近期已經(jīng) 報(bào)道了若干可能有效的Heel抑制劑（參見(jiàn)例如Lau和Huang的W0 2011/115998 ;Qiu等 人，J. Med. Chem.，2009，52 (6) :1757 - 1767 ;Wu 等人，Cancer Res.，2008 Oct 15， 68(20) :8393-9)。盡管至少某些化合物已經(jīng)顯示出有前景的結(jié)果，然而，對(duì)任何生物標(biāo)記沒(méi) 有指導(dǎo)表明用這類化合物增加治療成功。
[0007] 因此，仍然需要對(duì)Heel活性調(diào)節(jié)劑具有反應(yīng)的癌癥的生物標(biāo)記。
[0008] 發(fā)明概述 本發(fā)明的主題涉及治療腫瘤疾病的相關(guān)的生物標(biāo)記和方法，其中所述疾病用Heel抑 制劑治療。更具體地講，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Heel (HEC)、Rb(RBl)和/或p53 (TP53) 的狀態(tài)和/或表達(dá)水平可用作治療多種疾病狀態(tài)的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記，其中所述疾病用Heel 抑制劑治療，其中所述狀態(tài)是關(guān)于野生型與突變基因型和/或缺陷的/缺乏的基因表達(dá)。
[0009] 因此，在本發(fā)明主題的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)生物標(biāo)記譜的鑒定用于判定增殖性疾 病例如癌癥對(duì)Heel抑制劑或其它Heel靶向化合物的敏感性。因此，考慮了在受試者中判 定增殖性疾病和/或腫瘤細(xì)胞對(duì)Heel抑制劑治療的敏感性的方法，包括在來(lái)自受試者的樣 品中判定Heel (HEC)、Rb (RB1)和p53 (TP53)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的狀態(tài)和/或表達(dá)水平的步 驟。這樣的判定可以包括形成可檢測(cè)復(fù)合物，其提供測(cè)試結(jié)果。在某些實(shí)施方案中，可將所 述測(cè)試結(jié)果與Heel (HEC)、Rb (RB1)和p53 (TP53)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的狀態(tài)和/或表達(dá)水平 的相關(guān)參考結(jié)果進(jìn)行比較。
[0010] 在本發(fā)明構(gòu)思的另一實(shí)施方案中，考慮了選擇受試者和/或評(píng)價(jià)增殖性或腫瘤 疾病的患者對(duì)Heel抑制劑治療的方法，包括在來(lái)自所述受試者的樣品中判定Heel (HEC)、 Rb(RBl)和p53 (TP53)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的狀態(tài)和/或表達(dá)水平的步驟。這樣的判定可以包 括形成可檢測(cè)的復(fù)合物并可提供測(cè)試結(jié)果。在某些實(shí)施方案中，可將所述測(cè)試結(jié)果與得自 參考細(xì)胞的Heel (HEC)、Rb (RB1)和p53 (TP53)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的狀態(tài)和/或表達(dá)水平的 相關(guān)參考結(jié)果進(jìn)行比較，以確定敏感性。這樣的敏感性可用于提供評(píng)價(jià)或選擇結(jié)果。
[0011] 在本發(fā)明構(gòu)思的某些實(shí)施方案中，可以判定Heel的表達(dá)水平；在這樣的實(shí)施方案 中，增加的表達(dá)水平可以指示腫瘤細(xì)胞或增殖細(xì)胞對(duì)Heel抑制劑的敏感性。在本發(fā)明構(gòu)思 的其它實(shí)施方案中，可以判定Rb和p53中的至少一項(xiàng)的狀態(tài)；在這樣的實(shí)施方案中，Rb和/ 或P53的缺失或者突變型Rb和/或p53的存在可以指示腫瘤細(xì)胞或增殖細(xì)胞對(duì)Heel抑制 劑的敏感性。Heel、Rb和/或p53的狀態(tài)和/或表達(dá)可通過(guò)以下來(lái)表征：通過(guò)Heel、Rb和 /或P53的編碼核酸的定量測(cè)定，通過(guò)Heel、Rb和/或p53的編碼核酸的測(cè)序，通過(guò)Heel、 Rb和/或p53的編碼核酸的雜交，或通過(guò)這些的組合?；蛘?，Hecl、Rb和/或p53狀態(tài)和/ 或表達(dá)可以通過(guò)Heel蛋白、Rb蛋白和p53蛋白的定量測(cè)定和/或序列特征來(lái)表征。在本 發(fā)明構(gòu)思的某些實(shí)施方案中，Heel、Rb和/或p53相關(guān)的核酸和蛋白兩者均可被表征。
[0012] 在本發(fā)明主題的再一個(gè)實(shí)施方案中，考慮了腫瘤疾病患者用Heel抑制劑治療的 方法，包括判定來(lái)自受試者樣品的腫瘤疾病的分子類型并判定Heel、Rb和p53的至少一項(xiàng) 的表達(dá)水平的分子類型的步驟。這樣的判定可以包括形成可檢測(cè)的復(fù)合物，并可提供評(píng)價(jià) 結(jié)果。在這樣的實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)的參考值或結(jié)果而言，增加的Heel表達(dá)水平和/ 或Rb和/或p53的缺失或其突變形式的存在可以指示患者的腫瘤疾病對(duì)Heel抑制劑的適 用性。這類實(shí)施方案的腫瘤疾病包括但不限于乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和肝癌。
[0013] 本發(fā)明主題的另一實(shí)施方案是通過(guò)使所述腫瘤細(xì)胞與Heel抑制劑和第二化療 藥/細(xì)胞毒性劑接觸治療對(duì)Heel抑制劑敏感的腫瘤細(xì)胞的方法。這樣的方法可以利用 對(duì)于抑制所述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有效實(shí)現(xiàn)協(xié)同作用的一個(gè)或多個(gè)劑量。合適的Heel抑制劑 包括但不限于N-(4-(4-異丙氧基-2, 6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（100951); N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基）-2,6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（101001); 2_氟-N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基）-2, 6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（101015); N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基）吡嗪-2-基氧基）-2, 6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙 酰胺（Heel 10091) ;N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基）吡嗪-2-基硫基）-2,6-二甲基苯基） 噻唑-2-基）異煙酰胺（110095);和N-(4-(4-(5-(2-(二甲基氨基）乙氧基）吡嗪-2-基 硫基）-2, 6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺。這樣的Heel抑制劑可以是游離堿形式 或鹽形式。這樣的實(shí)施方案可以使用細(xì)胞毒性劑和/或化療藥例如泰素、多柔比星和托泊 替康，然而也考慮使用任何合適的細(xì)胞毒性劑和/或化療藥。
[0014] 本發(fā)明主題的再一實(shí)施方案是治療多重耐藥性（或?qū)σ榴R替尼治療有抵抗 性）的腫瘤細(xì)胞的方法，即通過(guò)使所述腫瘤細(xì)胞與有效實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)抑制的劑量的Heel抑制 劑接觸。在本發(fā)明構(gòu)思的某些實(shí)施方案中，所述Heel抑制劑可以與第二化療藥或細(xì)胞 毒性劑聯(lián)合使用。合適的Heel抑制劑包括但不限于N-(4-(4-異丙氧基-2, 6-二甲基 苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（100951) ;N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基）-2,6-二甲基苯 基）噻唑-2-基）異煙酰胺（101001) ;2_氟-N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基）-2,6-二甲基 苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（101015) ;N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基）吡嗪-2-基 氧基）-2,6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（Hecll0091) ;N-(4-(4-(5-(2-甲氧 基乙氧基）吡嗪-2-基硫基）-2, 6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（110095);和 N-(4-(4-(5-(2-(二甲基氨基）乙氧基）吡嗪-2-基硫基）-2,6-二甲基苯基）噻唑-2-基） 異煙酰胺。這樣的Heel抑制劑可以是游離堿形式或鹽形式。這樣的實(shí)施方案可以使用細(xì) 胞毒性劑和/或化療藥例如泰素、多柔比星和托泊替康，然而也考慮使用任何合適的細(xì)胞 毒性劑和/或化療藥。
[0015] 本發(fā)明主題的多個(gè)目標(biāo)、特征、方面和優(yōu)勢(shì)將透過(guò)以下優(yōu)選實(shí)施例的詳述及附圖 而更加顯而易見(jiàn)，其中相同的數(shù)字代表類似的組件。
[0016] 附圖簡(jiǎn)述 圖1顯示Heel抑制化合物的GI50和Heel表達(dá)之間的關(guān)系：圖1A顯示在來(lái)自異步 維持的細(xì)胞系的總蛋白中Heel蛋白表達(dá)水平。定量測(cè)定Heel蛋白表達(dá)水平并表示為 相對(duì)于HeLa表達(dá)水平的％并將其分為對(duì)Heel抑制劑非常敏感（GI50〈50nM)、中度敏感 (50nm〈GI50〈100nm)、部分敏感（100nm〈GI50〈l ii M)或抵抗（GI50>10 ii M)。圖 1B 顯示總 RNA 中的Heel RNA表達(dá)水平。定量測(cè)定Heel RNA表達(dá)，表示為相對(duì)于HeLa表達(dá)水平的％，并針 對(duì)蛋白表達(dá)以相關(guān)性作圖。圖1C顯示在響應(yīng)不同Heel抑制劑時(shí)分類為敏感（GI50〈300 y M) 或抵抗（GI50>300iiM)的癌細(xì)胞系中的Heel蛋白表達(dá)的編輯數(shù)據(jù)。圖1D-1和圖1D-2顯 示從細(xì)胞系篩選測(cè)定中收集的GI50數(shù)據(jù)的loglO,使用4種Heel化合物類似物（100951、 101001、101015和110095)，針對(duì)Heel蛋白表達(dá)水平作圖。雙側(cè)T檢驗(yàn)用于判定顯著性（所 有測(cè)試藥物的P-值為4. 3X 10_17)。圖1E顯示按照總RNA%的Heel RNA表達(dá)水平和按照總 蛋白％的Heel蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān)性。
[0017] 圖2顯示在不同癌細(xì)胞系和在來(lái)自人類患者樣本的肺癌和乳腺癌的亞型中的 Heel表達(dá)。圖2A和圖2B顯示分別得自GE0數(shù)據(jù)庫(kù)GSE8894和GSE14814的人肺癌腫瘤的 Heel (NDC80)表達(dá)數(shù)據(jù)，表示為表達(dá)強(qiáng)度的對(duì)數(shù)；結(jié)果顯示在鱗狀細(xì)胞癌中的高Heel表達(dá)。 圖2C顯示得自GE0數(shù)據(jù)庫(kù)GSE 20685的乳腺癌腫瘤樣品的Hecl(NDC80)表達(dá)數(shù)據(jù)，表示為 表達(dá)強(qiáng)度的對(duì)數(shù)；結(jié)果顯示在I型中的高Heel表達(dá)。
[0018] 圖3顯示siRNA敲除Rb對(duì)于癌細(xì)胞對(duì)Heel抑制化合物的敏感性的影響。圖3A顯 示用對(duì)照siRNA或靶向Rb的siRNA (siRb)轉(zhuǎn)染的野生型Rb MDA-MB-231細(xì)胞的轉(zhuǎn)染敲除 對(duì)于對(duì)Heel抑制化合物101001的敏感性（按照GI50)的影響。還顯示了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的Rb RNA 表達(dá)。圖 3B 顯示所選的具有野生型 Rb (231、MDA-MB-231、K562、ZR-75-l、T47D、A549、 HCT116)或突變型Rb (HeLa細(xì)胞）的細(xì)胞系的細(xì)胞敏感性，所述細(xì)胞系用靶向Rb的2個(gè) siRNA中的1個(gè)轉(zhuǎn)染并如圖3A處理，表示為相對(duì)于非藥物處理的細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制％。來(lái)自 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解液的檢測(cè)Rb的免疫印跡在相應(yīng)的抑制圖下方顯示。
[0019] 圖4顯示siRNA敲除p53對(duì)于癌細(xì)胞對(duì)Heel抑制化合物的敏感性的影響。圖4A 顯示用對(duì)照siRNA或靶向p53的siRNA (sip53)轉(zhuǎn)染的野生型p53細(xì)胞（A549、HCT116)的 轉(zhuǎn)染敲除對(duì)于對(duì)Heel抑制化合物101001的敏感性（按照GI50)的影響。細(xì)胞敏感性表示 為GI50(nM)。還顯示了來(lái)自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的p53 RNA表達(dá)。圖4B顯示所選的具有野生型p53 (A549、HCT116、ZR-75-l、U20S)或突變型p53 (HeLa)的細(xì)胞系的細(xì)胞敏感性，所述細(xì)胞系 用靶向P53的2個(gè)不同的siRNA中的1個(gè)轉(zhuǎn)染并如圖4A處理，表示為相對(duì)于非藥物處理的 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制％。來(lái)自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解液的檢測(cè)P53的免疫印跡在相應(yīng)的抑制圖下方顯 /_J、i 〇
[0020] 圖5顯示在藥物反應(yīng)性細(xì)胞（GI50 <10uM)及非藥物反應(yīng)性細(xì)胞（GI50 >10uM)中， 在Heel抑制劑作用下，p73磷酸化的誘導(dǎo)、凋亡標(biāo)記的活化和抗凋亡標(biāo)記的下調(diào)的差異。 還顯示了肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照。圖5A顯示免疫印跡，證明在藥物反應(yīng)性HeLa細(xì)胞及非藥物 反應(yīng)性A549細(xì)胞中，在不同時(shí)間點(diǎn)以200nM選擇性Heel抑制化合物處理后，Heel抑制化 合物（200nM)對(duì)磷酸化P73 (P-P73)的表達(dá)的影響。圖5B顯示免疫印跡，證明在藥物反 應(yīng)性HeLa細(xì)胞中，Heel抑制化合物（1 ii M)對(duì)于凋亡標(biāo)記胱冬蛋白酶3、PARP和抗凋亡標(biāo) 記Mcl-1、XIAP、Bel-2的表達(dá)的影響。圖5C顯示免疫印跡，證明在非藥物反應(yīng)性A549細(xì) 胞中，所選Heel抑制化合物和泰素對(duì)于凋亡標(biāo)記胱冬蛋白酶3、PARP和抗凋亡標(biāo)記Mcl-1、 XIAP、Bcl-2的表達(dá)的影響。圖ro顯示免疫印跡，證明在藥物反應(yīng)性HeLa細(xì)胞和非藥物反 應(yīng)性A549細(xì)胞中，Heel抑制化合物101001對(duì)于凋亡標(biāo)記胱冬蛋白酶3、PARP和抗凋亡標(biāo) 記Mcl-l、XIAP、Bcl-2的表達(dá)的影響。
[0021] 圖6顯示在藥物反應(yīng)性細(xì)胞（GI50〈10 ii M)和非藥物反應(yīng)性細(xì)胞（GI50 >10 ii M) 中，在Heel抑制劑作用下，Heel和Nek2蛋白表達(dá)的不同細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和Nek2蛋白的不同 下調(diào)。圖6A顯示在不同時(shí)間點(diǎn)，來(lái)自同步化的藥物反應(yīng)性細(xì)胞（HeLa、MDA-MB-468、HCT116) 和非藥物反應(yīng)性細(xì)胞（A549)的Heel和Nek2的免疫印跡。包括肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。 圖6B顯示來(lái)自用DMS0對(duì)照和不同濃度Heel抑制化合物處理的藥物反應(yīng)性細(xì)胞（HeLa、 HCT116)和非藥物反應(yīng)性細(xì)胞（A549)的Nek2的免疫印跡。圖6C顯示在不同時(shí)間周期，用 DMS0對(duì)照或Heel抑制化合物處理的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白B1和細(xì)胞周期蛋白D1的免 疫印跡。包括肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。
[0022] 在附圖中給出的實(shí)施方案在本質(zhì)上是說(shuō)明性的，而無(wú)意用于限制由權(quán)利要求書限 定的本發(fā)明。此外，附圖的個(gè)別特征和本發(fā)明將通過(guò)發(fā)明詳述而更加顯而易見(jiàn)。
[0023] 發(fā)明詳述 根據(jù)可選擇性地和/或特異性地靶向Hecl/Nek2途徑的小分子的近期發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人 已開(kāi)發(fā)出了祀向著絲粒組分Heel的各種改進(jìn)的Heel抑制劑，Heel在多種人類癌癥中過(guò)量 表達(dá)。這些化合物引導(dǎo)本發(fā)明人去研究在癌細(xì)胞中Heel、Rb和P53對(duì)Heel抑制劑藥物敏 感性的作用。
[0024] 細(xì)胞依靠貫穿有絲分裂的正常調(diào)節(jié)的細(xì)胞周期控制來(lái)正常運(yùn)行。癌細(xì)胞中觀察到 的失調(diào)的有絲分裂過(guò)程牽涉到例如異常紡錘體形成和染色體分離的過(guò)程。Heel在快速分 裂的細(xì)胞中表達(dá)水平最多，而非在最終分化的細(xì)胞中。在全基因組表達(dá)譜中已顯示Heel在 腦、肝、乳腺和肺的腫瘤細(xì)胞中上調(diào)，而在子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、肺癌細(xì)胞系以及 結(jié)腸直腸癌及胃癌組織中過(guò)量表達(dá)。因此，在快速分化的細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和癌組織中Heel 差異表達(dá)，表明Heel可能是人類癌癥的靶向治療的優(yōu)秀候選物。同樣，通過(guò)Heel表達(dá)和 IC50相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，可支持Heel作為用于癌癥治療靶標(biāo)的可能性。
[0025] Heel與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因（Rb)有關(guān)，后者在細(xì)胞周期的G2-M期起到重要 作用。更具體而言，在G2-M期Rb與蛋白磷酸酶la相互作用，該蛋白顯示對(duì)于著絲粒 (kinetochore)功能是必不可少的。在細(xì)胞周期G1-S期中的Rb磷酸化與G2-M期的細(xì) 胞周期蛋白的誘導(dǎo)和降解相協(xié)調(diào)。Rb在G2-M期還直接調(diào)節(jié)染色體分離并與Heel相互 作用。缺乏功能性Rb的細(xì)胞，不能正確完成有絲分裂，這樣的細(xì)胞有絲分裂造成超倍性 (hyperploidy)。這些關(guān)系表明Rb可能在涉及Heel的有絲分裂步驟中起作用。
[0026] P53蛋白是包含不同的結(jié)構(gòu)域的多功能蛋白，所述結(jié)構(gòu)域涉及與DNA、RNA、蛋白質(zhì) 和細(xì)胞代謝物的特定而復(fù)雜的相互作用。在癌癥中P53基因經(jīng)常突變，主要是導(dǎo)致單一氨 基酸置換的錯(cuò)義突變。這樣的突變型P53蛋白被歸類到不同的結(jié)構(gòu)群。例如，具有在DNA結(jié) 合域內(nèi)發(fā)生的"熱點(diǎn)"突變的P53蛋白可被表征為DNA的接觸突變體或構(gòu)象突變體。突變 型P53在整個(gè)腫瘤進(jìn)程（包括晚期和遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移）中通常高度表達(dá)，意味著它可能具有功能 獲得性（G0F)屬性。這樣的G0F屬性允許突變型P53與染色質(zhì)上的位點(diǎn)（所述位點(diǎn)不同于 與野生型P53相互作用的染色質(zhì)位點(diǎn)）相互作用，并與分別上調(diào)或阻遏基因例如多重抗藥 性1基因（multi-drug resistance 1 gene)或胱冬蛋白酶-3的各種轉(zhuǎn)錄因子相互作用。 還證明了野生型P53的失活增加了對(duì)多種化療藥物（包含順鉬、卡鉬和泰素）的敏感性。
[0027] 基于上述考慮和其他因素，本發(fā)明人現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)Hecl(HEC)、Rb(RBl)和/ 或p53 (TP53)的狀態(tài)及/或表達(dá)水平來(lái)準(zhǔn)確而可靠地預(yù)測(cè)細(xì)胞對(duì)Heel抑制劑的敏感性。 這有利地允許早期鑒定可受益于Heel抑制劑治療的癌癥患者，這進(jìn)而可在他們的疾病仍 處于早期階段時(shí)更有效地治療疾病。
[0028] 更具體地講，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Heel表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)Heel抑制劑治療的 敏感性正相關(guān)，并且Rb和/或P53的缺失、失調(diào)或功能障礙與腫瘤細(xì)胞對(duì)Heel抑制劑治療 的敏感性也呈正相關(guān)。因此，應(yīng)理解，這樣的相關(guān)性可能不僅允許預(yù)測(cè)Heel抑制劑對(duì)腫瘤 細(xì)胞和組織的治療成功性，而且某些癌癥類型對(duì)Heel抑制劑治療天生敏感或抵抗。
[0029] 例如，還如下文更詳細(xì)地進(jìn)一步所示，具有相對(duì)高的Heel表達(dá)的某些腫瘤細(xì)胞系 和腫瘤細(xì)胞（例如，H印3B/肝細(xì)胞癌、HeLa/子宮頸癌、T47D/轉(zhuǎn)移、胸膜癌、侵入性癌、導(dǎo) 管癌）可能對(duì)Heel抑制劑治療高度敏感，而Heel表達(dá)非常低或無(wú)表達(dá)的其它細(xì)胞系（例 如，M0LT-4/急性成淋巴細(xì)胞性白血病，N87/胃癌）可能對(duì)Heel抑制劑治療明顯地較不敏 感（或抵抗）。
[0030] 這樣的不同敏感性還可用于單一類型或類別的癌癥的分類和/或治療。例如，乳 腺癌的分子亞型分為I-VI型，但只有I和IV表現(xiàn)出顯著的Heel表達(dá)水平，因此對(duì)Heel抑 制劑治療可能敏感。同樣，對(duì)患者癌癥的具體類型或類別的鑒定，可能指示對(duì)Heel抑制劑 的敏感性，并因此可用于優(yōu)化治療。
[0031] 因此，本發(fā)明構(gòu)思的一個(gè)實(shí)施方案是選擇使用Heel抑制劑（任選與細(xì)胞毒性劑聯(lián) 用）治療的患有增殖性疾病的受試者的方法，其中這樣的選擇基于先前判定的Heel表達(dá) 和/或狀態(tài)。在本發(fā)明主題的一個(gè)特別優(yōu)選的方面，Heel表達(dá)和/或狀態(tài)通過(guò)野生型Heel (HEC)基因的表達(dá)水平的定量測(cè)定、突變型Heel (HEC)基因的存在、或通過(guò)Heel (HEC)基 因的缺乏、不足（相對(duì)于健康對(duì)照）或缺失的測(cè)定而得以判定。同樣，還應(yīng)該理解，這樣的 定量測(cè)定也可包括在得自受試者的樣品中的Heel的表達(dá)水平及/或翻譯后修飾的測(cè)定。 例如，可以通過(guò)測(cè)定受試者的野生型Heel基因的表達(dá)水平并與健康對(duì)照受試者的野生型 Heel (HEC)基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較，來(lái)進(jìn)行這樣的判定。另外或備選地，對(duì)照受試者也可 代表對(duì)具體治療（最典型的是用Heel抑制劑治療）有或無(wú)反應(yīng)的腫瘤。在對(duì)照代表對(duì)治 療有反應(yīng)的腫瘤的情況下，與對(duì)照相比，個(gè)體的野生型Heel (HEC)基因的較高表達(dá)可預(yù)測(cè) 對(duì)治療的可能反應(yīng)性。相反，當(dāng)對(duì)照代表對(duì)治療抵抗的腫瘤，與對(duì)照相比，個(gè)體的Heel的較 低表達(dá)水平可預(yù)測(cè)對(duì)治療的可能抵抗。
[0032] 本發(fā)明主題的另一實(shí)施方案（特別但并非必要，在相對(duì)于對(duì)照具有高Heel (HEC) 表達(dá)水平的受試者中），考慮了這樣的方法：其中選擇患者用于用Heel抑制劑治療，其中所 述患者罹患適合用Heel抑制劑治療的增殖性疾病，并且其中所述患者選擇依賴（至少部分 地）于表征或判定Rb狀態(tài)的步驟。Rb狀態(tài)可以通過(guò)判定在得自受試者的樣品中野生型Rb (RB1)基因的存在、突變型Rb (RB1)基因的存在、Rb (RB1)基因的缺乏、不足或缺失、和/ 或Rb表達(dá)水平和/或翻譯后修飾來(lái)表征。如前所述，應(yīng)該理解，減少或缺乏Rb的表達(dá)，或 具有失調(diào)和/或機(jī)能障礙的Rb (RB1)，可能指示腫瘤細(xì)胞對(duì)Heel抑制劑治療的反應(yīng)性。因 此，可以依照顯示不足/突變/缺失的Rb (RB1)狀態(tài)的受試者，選擇用Heel抑制劑治療的 患者群。
[0033] 同樣，在本發(fā)明構(gòu)思的又一實(shí)施方案中，考慮了選擇用Heel抑制劑治療（任選與 細(xì)胞毒性劑聯(lián)用）的患有增殖性疾病的受試者的方法，其中所述方法包括以下步驟：通過(guò) 表征或判定P53狀態(tài)，在所述受試者中測(cè)定增殖性疾病對(duì)Heel抑制劑治療的敏感性。例 如，所述方法可包括下列步驟：經(jīng)由在來(lái)自所述受試者的樣品中鑒定和/或定量測(cè)定野生 型p53 (TP53)基因、突變型p53 (TP53)基因、或p53 (TP53)基因的缺乏、不足或缺失、和 /或P53表達(dá)水平和/或翻譯后修飾，而判定P53狀態(tài)。因此，可根據(jù)顯示不足/突變/缺 失的P53(TP53)狀態(tài)的受試者，選擇用Heel抑制劑治療的患者群。
[0034] 應(yīng)當(dāng)理解，Hecl、Rb和p53基因的狀態(tài)和表達(dá)除了用作單獨(dú)的指示物以外，還可聯(lián) 合用作選擇用Heel抑制劑治療的患者群的基礎(chǔ)。例如，Heel基因型、Heel表達(dá)、Rb基因型、 Rb表達(dá)、P53基因型和/或P53表達(dá)可單獨(dú)或以任意組合用作腫瘤疾病或細(xì)胞系對(duì)Heel抑 制劑化合物的敏感性的指示物。
[0035] 應(yīng)當(dāng)理解，基因和基因產(chǎn)物（例如與Heel、Rb和p53相關(guān)的基因和基因產(chǎn)物）的 檢測(cè)、定量測(cè)定及/或表征，可包括對(duì)基因或基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記或標(biāo)簽，和/或形成可檢測(cè) 的復(fù)合物。這樣的標(biāo)記可以是直接或間接的。例如，基因或基因產(chǎn)物（如RNA或蛋白質(zhì)） 可以通過(guò)修飾其組成而直接標(biāo)記，使其可例如通過(guò)將可檢測(cè)部分連結(jié)到有待表征的基因和 /或基因產(chǎn)物上以形成可檢測(cè)復(fù)合物而被檢測(cè)。同樣，基因或基因產(chǎn)物也可通過(guò)與攜帶可檢 測(cè)部分的結(jié)合配體（例如，互補(bǔ)的核酸序列、互補(bǔ)的核酸類似物序列、適體或抗體）相互作 用形成可檢測(cè)復(fù)合物而被間接標(biāo)記?；蛘撸蚧蚧虍a(chǎn)物（例如，來(lái)自患者樣本）可通過(guò) 其以下能力而被標(biāo)記：置換攜帶可檢測(cè)部分的基因類似物或攜帶來(lái)自結(jié)合配體（例如，互 補(bǔ)的核酸序列、互補(bǔ)的核酸類似物序列、適體或抗體）的可檢測(cè)部分的基因產(chǎn)物類似物，從 而調(diào)節(jié)可檢測(cè)復(fù)合物的形成。合適的可檢測(cè)部分包括，但不限于，熒光分子、磷光發(fā)光性分 子、發(fā)光分子、酶、金屬、生物素和/或生物素類似物、量子點(diǎn)、微粒、放射性核素、核酸和/或 核酸類似物、同位素質(zhì)量標(biāo)記、自旋標(biāo)記、正電荷或負(fù)電荷或這些的組合。
[0036] 在本文中，應(yīng)當(dāng)注意，基因型的測(cè)定和/或Hecl、Rb和/或p53核酸和蛋白質(zhì)產(chǎn)物 的定量測(cè)定的所有已知方式，皆被認(rèn)為適用于本文。特別合適的方法包括（但不限于）DNA 測(cè)序、拷貝數(shù)測(cè)定、單倍型測(cè)定、RNA測(cè)序、qPCR、RT-PCR、q-RT-PCR、數(shù)字PCR、DNA雜交和/ 或RNA雜交、FISH、微陣列分析、液相雜交/定量測(cè)定、電流分析（amperometric)和/或熒 光定量測(cè)定、免疫測(cè)定和/或適于表征基因和/或基因產(chǎn)物的任何方法。備選地或另外，當(dāng) 細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)分析指示Heel、Rb和/或p53特定狀態(tài)時(shí)，可以完全省略單獨(dú)的定量 分析。
[0037] 關(guān)于用Heel抑制劑治療，應(yīng)當(dāng)理解，所有已知的Heel抑制劑皆被視為適用于本發(fā) 明，且優(yōu)選的Heel治療劑包括描述于W0 2011/115998和同時(shí)待審的順序號(hào)為64/564, 773 的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)中的那些。因此，在特別考慮的化合物中，特別優(yōu)選的Heel抑制劑包括 N-(4-(4-異丙氧基-2, 6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（100951)、N-(4-(4-(4-甲 氧基苯氧基）-2,6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（101001)、2_氟-N-(4-(4-(4-甲 氧基苯氧基）-2,6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（101015)、N-(4-(4-(5-(2-甲 氧基乙氧基）吡嗪-2-基氧基）-2, 6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（110091)、 N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基）吡嗪-2-基硫基）-2, 6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙 酰胺（110095)和N-(4-(4-(5-(2-(二甲基氨基）乙氧基）吡嗪-2-基硫基）-2, 6-二甲基 苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（110096)。
[0038] 還進(jìn)一步考慮到Heel抑制劑可以與例如以下一種或多種細(xì)胞毒性劑共給予：抗 腫瘤代謝物、拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑和/或微管活性劑。所有這些已知的作用劑已被認(rèn) 為適用于本發(fā)明。對(duì)于這類試劑的劑量，可以目前已知?jiǎng)┝浚蛏缘陀谒鲆阎獎(jiǎng)┝拷o予所 述試劑。
[0039] 令人驚訝的是，當(dāng)所考慮的Heel抑制劑與一種或多種細(xì)胞毒性劑共給予時(shí)，觀察 到與所選化合物的協(xié)同活性，如下文更詳細(xì)地描述。最有利的是，Heel抑制劑和泰素、多柔 比星和托泊替康組合時(shí)觀察到協(xié)同反應(yīng)。盡管并不限制本發(fā)明的主題，考慮到在細(xì)胞和/ 或組織中可以觀察到協(xié)同作用，其中所述細(xì)胞和/或組織對(duì)濃度等于或小于lOOnM的Heel 抑制劑敏感（表9至表11)。
[0040] 同樣要注意的是，所考慮的Heel抑制劑化合物還對(duì)被認(rèn)為具有抗藥性的多種細(xì) 胞系表現(xiàn)出顯著的活性，從而提供了治療其它難治性細(xì)胞和組織的另外的方法（表8)。此 夕卜，本發(fā)明人還觀察到，本文考慮的Heel抑制劑在反應(yīng)性細(xì)胞（GI50〈liiM)中顯示出活性 并觸發(fā)凋亡反應(yīng)，但在非反應(yīng)性細(xì)胞（GI50 >liiM)中不觸發(fā)凋亡反應(yīng)的誘導(dǎo)（圖5)。 實(shí)施例
[0041] 材料與方法 細(xì)朐培養(yǎng)：A549、MDA-MB231、K562、HCT116癌細(xì)胞系是由Y. S. Lee博士（臺(tái)灣， 新北市，生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心（Development Center for Biotechnology, New Taipei City, Taiwan))提供。T47D、ZR-75-l細(xì)胞系得自BCRC (臺(tái)灣，生物資源收集和研究中心 (Bioresource Collection and Research Center, Taiwan))。將細(xì)胞系最初維持在所建 議的培養(yǎng)基中并適應(yīng)于37° C在含5% C02的空氣中維持在含有10%胎牛血清、低葡萄糖 (lg/L) Dulbecco's Modified Eagle's (DME) Medium 的培養(yǎng)基中。
[0042] 藥物敏感件：將細(xì)胞系以適當(dāng)接種量接種在含低葡萄糖DME和10% FBS的96孔 板中之后,通過(guò)用指定藥物處理24小時(shí)，進(jìn)行藥物敏感性篩選。將藥物添加于板的3個(gè)重 復(fù)孔中，再將細(xì)胞在藥物處理的培養(yǎng)基中孵育96小時(shí)，再使用CellTiter 96?水性非放射 性細(xì)胞增殖測(cè)定系統(tǒng)（Promega，Madison, WI 53711 USA)，通過(guò)MTS測(cè)定來(lái)檢測(cè)細(xì)胞活力。 MTS測(cè)定根據(jù)制造商的說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行。使用Bio-Tek 340分光光度計(jì)（Bio-Tek，Winooski， VT 05404)進(jìn)行光密度測(cè)定，然后在 Excel (Microsoft, Redmond, WA 98052-7329)和 GraphPad Prism 5 線性回歸軟件（GraphPad Software，La Jolla, CA 92037 USA)中處理 光學(xué)讀數(shù)，以確定濃度反應(yīng)曲線，用于計(jì)算相對(duì)GI50。GI50值是指引起50%生長(zhǎng)抑制的濃 度。計(jì)算測(cè)試藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制％為：[1 _ (試驗(yàn)值V(對(duì)照值）]x 100;這些值被用 來(lái)繪制濃度-反應(yīng)曲線，然后再用線性回歸軟件分析。
[0043] 協(xié)同作用:對(duì)所選藥物測(cè)定GI50,并用于計(jì)算用于與Heel抑制劑的協(xié)同測(cè)定的濃 度比例。將細(xì)胞以適當(dāng)接種量接種在含低葡萄糖DME和10% FBS的96孔板中后，用藥物 處理24小時(shí)。將Heel抑制劑及所選藥物以所確定的GI50濃度比例加至板的三個(gè)重復(fù)孔 中，并將細(xì)胞培養(yǎng)在藥物處理的培養(yǎng)基中孵育96小時(shí)，然后測(cè)定細(xì)胞活力。按照制造商說(shuō) 明書使用CellTiter 96?水性非放射性細(xì)胞增殖測(cè)定系統(tǒng)（Promega，Madison, WI 53711 USA)，通過(guò)MTS測(cè)定來(lái)檢測(cè)細(xì)胞活力。使用Bio-Tek 340分光光度計(jì)（Bio-Tek，Winooski, VT 05404)進(jìn)行光密度測(cè)定，然后使用 Excel (Microsoft, Redmond, WA 98052-7329)和 GraphPad Prism 5 線性回歸軟件（GraphPad Software，La Jolla, CA 92037 USA)處理以 確定濃度-反應(yīng)曲線，用于計(jì)算相對(duì)GI50。通過(guò)使用算式Cl (組合指數(shù)）=(CA，X/ICx，A )+ (CB，X/ICx，B)計(jì)算組合指數(shù)值來(lái)確定協(xié)同作用，其中CA，X和CB，X是組合用于達(dá)到x% 的藥物效果的藥物A和藥物B的濃度。ICx，A和ICx，B為達(dá)到相同效果的單一試劑的濃度。
[0044] 某閔沉默:將細(xì)胞以適當(dāng)細(xì)胞數(shù)量鋪板于96孔板中并經(jīng)siPort NeoFx轉(zhuǎn)染方法 (Life Technologies，Carlsbad, California 92008 USA )，根據(jù)制造商的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn) 染，維持24小時(shí)，然后用藥物處理。將細(xì)胞在藥物處理的培養(yǎng)基中孵育48小時(shí)，然后通過(guò) MTS測(cè)定進(jìn)行分析。使用對(duì)照 siRNA (Life Technologies, Carlsbad, California 92008; Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 USA;和 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. 95060 USA)> Rb siRNA (#1: Life Technologies, Carlsbad, California 92008 USA; #2: Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. 95060 USA) 和 p53 siRNA (#1: Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 USA; #2: Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 USA)。細(xì)胞在接種后用藥物處理24小時(shí)并 與藥物一起孵育48小時(shí)，然后進(jìn)行MTS測(cè)定。按照制造商的說(shuō)明書（Promega, Madison, WI 53711 USA)進(jìn)行 MTS 測(cè)定。
[0045] 免疫印跡：通討在放射免疫沉淀測(cè)定（RIPA)緩沖液（50mM Tris-HCl, pH7. 4， 150mM NaCl, 1% NP40, 0? 25% DOC, 0? 1% SDS, ImM NaV04, ImM EDTA, lug/ml 亮抑酶 肽，lyg/ml 胃酶抑素）或2.5X 樣品緩沖液（50mMTris-HCl，pH6.8，1%SDS，2.5% BME，7. 5%甘油，漠酚藍(lán)）中孵育細(xì)胞獲得細(xì)胞裂解物。將組織標(biāo)本浸淸在RIPA緩沖液 中，用均質(zhì)器破碎，再離心至澄清。接著對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE，印跡到免疫印跡膜上，并與 第一抗體在3%BSA-TBST中孵育。用辣根過(guò)氧化物酶綴合的第二抗體，通過(guò)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光 (Millipore，Billerica, MA 01821 USA)進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)。以下抗體用于蛋白質(zhì)印跡：抗 Rb 單克隆抗體 1F8 (Abeam, Cambridge, MA 02139-1517 USA);抗 p53 單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. 95060 USA);抗-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體AC-15 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)。
[0046] 實(shí)時(shí)定量 PCR:使用 Quick-RNA miniPrep 試劑盒（Zymo Research, Irvine, CA 92614 USA)分離總 RNA。使用 One St印 SYBR ExTaq qRT-PCR試劑盒（Takara-Bio, Shiga, Japan)，按照制造商的說(shuō)明書，在 ABI Prism 7500 (Life Technologies, Carlsbad, California 92008 USA)上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量實(shí)時(shí)PCR。用于GAPDH的引物序列是：5'-GGT TTACATGITCCAATATGAITCCA-3 '（正向）、5 ' -ATGGGAITTCCAITGATGACAAG-3 '（反向）。用于 Rb 的引物序列是：5'-GCAGTATGCTTCCACCAGGC-3'（正向）、5'-AAGGGCTTCGAGGAATGTGAG-3' (反向）。用于p53的引物序列是：5' -GCCCCCAGGGAGCACTA-3' （正向）、 5' -GGGAGAGGAGCTGGTGITG-3'（反向）。
[0047] 臨床樣品的某閔表汰：HEC某閔表汰數(shù)據(jù)得自GSE數(shù)據(jù)庫(kù)，講行分析并表示為以2 為底數(shù)的基因表達(dá)強(qiáng)度的對(duì)數(shù)。
[0048] 以下討論提供了本發(fā)明主題的多個(gè)示例性實(shí)施方案。雖然每個(gè)實(shí)施方案代表本發(fā) 明要素的單一組合，但本發(fā)明的主題被認(rèn)為包括所公開(kāi)要素的所有可能的組合。因此，如果 一個(gè)實(shí)施方案中包括要素A、B和C，而第二實(shí)施方案包括要素B和D，則本發(fā)明的主題也被 認(rèn)為是包括A、B、C或D的其它剩余組合，即使沒(méi)有被明確公開(kāi)。此外，除非另有相反規(guī)定， 否則本文中所給出的所有范圍應(yīng)視為包括其端點(diǎn)，且末端開(kāi)放式的范圍應(yīng)視為僅包括商業(yè) 上實(shí)用的值。同樣，除非另有相反規(guī)定，否則所有的值列表應(yīng)視為包括中間值。
[0049] Heel表汰和細(xì)朐對(duì)Heel抑制劑的敏感件之間的關(guān)聯(lián)：表征各種癌癥細(xì)朐系對(duì) Heel抑制劑敏感性的結(jié)果顯示于表1中。顯而易見(jiàn)，所述細(xì)胞對(duì)Heel抑制劑的敏感性不 同。在此，所述細(xì)胞系用Heel抑制劑（101001)處理，并分析其增殖活性和代謝活性。表1 以GI50遞增的順序列舉了篩選的細(xì)胞系，并依照它們對(duì)Heel抑制劑的敏感性而將其分組。
【權(quán)利要求】
1. 判定腫瘤細(xì)胞對(duì)Heel抑制劑的敏感性的方法，包括： 自患者獲取包含腫瘤細(xì)胞的樣品； 形成Heel、Rb和p53中的至少一項(xiàng)的可檢測(cè)復(fù)合物，其中Heel、Rb和p53中的至少一 項(xiàng)源自所述樣品； 使用所述可檢測(cè)復(fù)合物，以判定Heel、Rb和p53中的至少一項(xiàng)的表達(dá)水平和狀態(tài)的至 少一項(xiàng)，以獲得測(cè)試結(jié)果；和 將所述測(cè)試結(jié)果與非腫瘤細(xì)胞的參考結(jié)果進(jìn)行比較，從而判定所述腫瘤細(xì)胞對(duì)所述 Heel抑制劑的敏感性，所述非腫瘤細(xì)胞的參考結(jié)果包括非腫瘤細(xì)胞的Hecl、Rb和p53中的 至少一項(xiàng)的表達(dá)水平和狀態(tài)的至少一項(xiàng)。
2. 評(píng)價(jià)腫瘤疾病患者對(duì)Heel抑制劑的可能治療的方法，包括： 獲取包含腫瘤細(xì)胞的患者樣品； 形成Heel、Rb和p53中的至少一項(xiàng)的可檢測(cè)復(fù)合物； 使用所述可檢測(cè)復(fù)合物，以判定Heel、Rb和p53中的至少一項(xiàng)的表達(dá)水平和狀態(tài)的至 少一項(xiàng)，以獲得測(cè)試結(jié)果； 將所述測(cè)試結(jié)果與參考結(jié)果進(jìn)行比較，從而判定所述腫瘤細(xì)胞對(duì)Heel抑制劑的敏感 性，所述參考結(jié)果包括非腫瘤參考細(xì)胞的Heel、Rb和p53中的至少一項(xiàng)的表達(dá)水平和狀態(tài) 的至少一項(xiàng)；和 將所述患者納入接受Heel抑制劑治療的治療組。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述判定步驟包括判定Heel的表達(dá)水平。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中相對(duì)于相應(yīng)參考結(jié)果，增加的表達(dá)水平指示所述腫瘤細(xì)胞 對(duì)所述Heel抑制劑的敏感性。
5. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述判定步驟包括判定Rb和p53中的至少一項(xiàng)的狀 態(tài)。
6. 權(quán)利要求6的方法，其中相對(duì)于相應(yīng)參考結(jié)果，Rb和p53中的至少一項(xiàng)的突變或缺 失形式指示所述腫瘤細(xì)胞對(duì)所述Heel抑制劑的敏感性。
7. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述判定步驟包括Heel、Rb和p53的編碼核酸的定量 測(cè)定。
8. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述判定步驟包括Heel、Rb和p53的編碼核酸的測(cè)序 或雜交或這兩者的組合。
9. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述判定步驟包括Heel蛋白、Rb蛋白和p53蛋白的定 量測(cè)定。
10. 評(píng)價(jià)腫瘤疾病患者對(duì)Heel抑制劑的可能治療的方法，包括： 自患者樣品判定腫瘤疾病的分子類型； 形成Heel、Rb和p53中的至少一項(xiàng)的可檢測(cè)復(fù)合物； 使用所述可檢測(cè)復(fù)合物，以判定Heel、Rb和p53中的至少一項(xiàng)的表達(dá)水平和狀態(tài)的至 少一項(xiàng)的分子類型； 使用Hecl、Rb和p53中的至少一項(xiàng)的表達(dá)水平和狀態(tài)的至少一項(xiàng)，從而提供評(píng)價(jià)結(jié)果； 和 其中相對(duì)于相應(yīng)參考結(jié)果，增加的Heel表達(dá)水平和/或相對(duì)于相應(yīng)參考結(jié)果，Rb和 P53中的至少一項(xiàng)的突變或缺失形式的存在，指示用Heel抑制劑治療所述腫瘤疾病的適用 性。
11. 權(quán)利要求11的方法，其中所述腫瘤疾病是乳腺癌。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述腫瘤疾病是肺癌。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中所述腫瘤疾病是結(jié)腸癌。
14. 權(quán)利要求11的方法，其中所述腫瘤疾病是肝癌。
15. 治療對(duì)Heel抑制劑治療敏感的腫瘤細(xì)胞的方法，包括使所述腫瘤細(xì)胞與Heel抑制 劑和第二化療藥接觸，其劑量為有效實(shí)現(xiàn)對(duì)所述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的協(xié)同效應(yīng)。
16. 權(quán)利要求16的方法，其中所述Heel抑制齊選自N-(4-(4-異丙氧基-2, 6-二甲基苯 基）噻唑-2-基）異煙酰胺（100951)、N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基）-2, 6-二甲基苯基）噻 唑-2-基）異煙酰胺（101001)、2_氟-N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基）-2,6-二甲基苯基）噻 唑-2-基）異煙酰胺（101015)、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基）吡嗪-2-基氧基）-2, 6-二 甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（Hecll0091)、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基）吡 嗪-2-基硫基）-2,6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（110095)和N-(4-(4-(5-(2-(二 甲基氨基）乙氧基）吡嗪-2-基硫基）_2, 6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺以及它 們的鹽形式。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述第二化療藥選自泰素、多柔比星和托泊替康。
18. 治療多重耐藥性或?qū)σ榴R替尼治療有抵抗性的腫瘤細(xì)胞的方法，包括使所述腫瘤 細(xì)胞與Heel抑制劑和任選的第二化療藥接觸，其劑量為有效實(shí)現(xiàn)所述腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑 制。
19. 權(quán)利要求19的方法，其中所述Heel抑制劑選自N-(4-(4-異丙氧基-2, 6-二甲基 苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（Hec 100951)、N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基）-2, 6-二甲基苯 基）噻唑-2-基）異煙酰胺（Hec 101001)、2-氟-N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基）-2,6-二甲基 苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（Hecl01015)、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基）吡嗪-2-基 氧基）-2,6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（Hecll0091)、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基 乙氧基）吡嗪-2-基硫基）-2,6-二甲基苯基）噻唑-2-基）異煙酰胺（Hecll0095)和 N-(4-(4-(5-(2-(二甲基氨基）乙氧基）吡嗪-2-基硫基）-2,6-二甲基苯基）噻唑-2-基） 異煙酰胺或其鹽形式。
【文檔編號(hào)】G01N33/566GK104395752SQ201280067630
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月21日
【發(fā)明者】Y-L.黃, J.劉 申請(qǐng)人:泰緯生命科技股份有限公司