專利名稱：：一種檢測用生物標(biāo)記物及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種胃癌生物標(biāo)記物及其在胃癌診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胃癌是嚴(yán)重危害我國人民生命健康的重大疾病，其年齡標(biāo)化發(fā)病率和死亡率均居我國常見惡性腫瘤年齡標(biāo)化發(fā)病率和死亡率的第二位。由于絕大多數(shù)胃癌患者缺乏特異性臨床癥狀，目前早期胃癌的診斷率較低，其病例僅占胃癌手術(shù)病例的10-20%，就診的患者大多處于胃癌的中晚期，其五年生存率仍徘徊于20-30%。胃癌的發(fā)生是機體遺傳因素和外界環(huán)境因素相互作用、多基因參與、多步驟發(fā)生的過程。近年研究結(jié)果顯示，各分子事件之間存在以關(guān)鍵調(diào)控基因為重要節(jié)點的多中心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些重要節(jié)點通過各種信號傳導(dǎo)通路參與正常胃粘膜到胃癌這一復(fù)雜的演變過程。目前胃癌的臨床診斷主要依據(jù)組織學(xué)形態(tài)觀察結(jié)果，而未應(yīng)用胃癌特征性分子事件變化對上述病變進行分型和分級，因此上述病變的分型和分級具有較大的人為主觀性，且無法為患者提供個性化治療。而現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)記物如CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的陽性率約60%，但敏感性和特異性均不高，并與其他腫瘤存在交叉。因此，我們迫切需要了解胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的生物標(biāo)記物和藥物靶標(biāo)來早期診斷胃癌和有效治療胃癌。MicroRNA(miRNA)是一類長度約1925個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,廣泛存在于植物、線蟲、果蠅和哺乳動物等生物中，主要通過不完全互補的方式與編碼蛋白mRNA的3'-UTR區(qū)結(jié)合引起靶mRNA的降解、活性降低或翻譯受抑，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控。研究表明miRNA幾乎在所有的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括個體發(fā)育、細胞增殖、分化、代謝、凋亡和應(yīng)激等。約50。/。的已知人類miRNA基因定位于和腫瘤相關(guān)的染色體區(qū)域，而不斷累積的研究成果也已充分證實miRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。最新的數(shù)據(jù)顯示腫瘤組織普遍具有特征性的miRNA表達譜，即腫瘤細胞某幾種miRNA表達水平常與同一組織中的正常細胞存在顯著的差異，而特征性的miRNA異常表達可望作為有效工具用于腫瘤的診斷、病理分級、臨床分期、預(yù)后和對治療的反應(yīng)性等，顯示了良好的臨床應(yīng)用前景。因此，開發(fā)一種可輔助胃癌診斷的miRNA作為生物標(biāo)記物，具有廣泛的科研價值和臨床應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測用生物標(biāo)記物，以檢測樣本中microRNA-375(miR-375)的表達量作為生物標(biāo)記，以miR-375表達量小于等于0.2為臨界值。該生物標(biāo)記物在胃癌組織中的表達量約為正常組織的四分之一。利用組織中miR-375的表達量作為生物標(biāo)記，檢測胃癌的特異性達72.7%，敏感性達82.8%。本發(fā)明的另一個目的在于提供所述生物標(biāo)記物在檢測胃癌組織中的應(yīng)用。取氮凍存的組織1-3塊，使用mirVanamiRNAIsolation試劑盒(美國Ambion公司)提取總RNA，再使用miR-375特異的TaqmanMicroRNAAssays(美國AppliedBiosystems公司)試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測；采用相對定量的方法，得到目標(biāo)組織相對于參照組織miR-375的含量，參照組織為病理確診后的正常胃組織；以0.2為臨界值，miR-375表達量小于等于0.2的組織檢測認為是腫瘤組織，大于0.2的組織檢測認為是非腫瘤組織。本發(fā)明的有益效果在于1.提供的該生物標(biāo)記物在胃癌組織中的表達量僅為正常組織的四分之一，該生物標(biāo)記物的特異性72.7%,敏感性82.8%，具有敏感性和特異性高，操作方便等特點，有較高的診斷參考價值。2.有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制，為腫瘤的個體化靶向治療奠定基礎(chǔ)。圖1:手術(shù)胃癌組織中miR-375的相對定量。圖2:胃鏡組織中miR-375的相對定量。圖3:胃鏡組織中miR-375的相對定量(非腫瘤組vs.腫瘤組)。具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合實施例和附圖作進一步的說明。實施例11、組織樣品的準(zhǔn)備收集液氮凍存的胃癌手術(shù)切除樣本共34例，每例為腫瘤組織及癌旁非腫瘤組織各一塊，并收集液氮凍存的胃鏡樣本60例(29例胃癌組織和31例慢性淺表性胃炎組織)。2、組織總RNA提取使用mirVanamiRNAIsolationKit(Catalog#1560,1561,Ambion)試劑盒，根據(jù)試劑盒所提供的操作步驟，提取上述34例胃癌手術(shù)切除樣本及60例胃鏡樣本的總RNA(每塊組織取50毫克)，分裝-80。C冰箱凍存，直至檢測。3、Real-timePCR檢測miR-375表達量使用hsa-miR-375TaqmanMicroRNAAssays(AppliedBiosystems,P/N:4373151)檢測組織樣本中miR-375的表達量，Real-timePCR在Real-TimePCRDetectionSystem(ABI7500)上進行。逆轉(zhuǎn)錄PCR使用10ng總RNA和蓮環(huán)樣引物(looperprimer),20Real-timePCR體系中包含1.33逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，lO[iL2xTaqmanUniversalPCRMasterMix，NoAmpEraseUNG(P/N4369016，AppliedBiosystems),l|aLrealtimeprimer(20xTaqmanMicroRNAAssaysMix,P/N4373027)。反應(yīng)在96孔板中進行，95°C,10分鐘，繼以4個循環(huán)的95。C，15秒60°C,1分鐘。使用mRNAU6(RNU6B，P/N:4373381;AppliedBiosystems)作為內(nèi)參。MiRNA的相對定量使用2'A^t算法計算。手術(shù)腫瘤樣本以同患者鄰近非瘤樣本作為參照，胃鏡樣本以病理鑒定為正常的胃組織作為參照。所得相對定量(RelativeQuantitation,RQ)取logl0對數(shù)，以便于使用t-檢驗統(tǒng)計。結(jié)果顯示，在33例受檢手術(shù)樣本中，胃癌組織中miR-375的表達量在87.9%的樣本中較癌旁非瘤組織有明顯的降低，平均降低倍數(shù)為3.94，差異有顯著性(參見圖l，p<0.01)。而在胃鏡樣本中，腫瘤組miR-375的表達量較非腫瘤組亦有明顯的降低，腫瘤組和非腫瘤組miR-375的表達量的幾何平均數(shù)分別為0.07497和0.33977，平均下降倍數(shù)為4.53，具統(tǒng)計學(xué)差異(參見圖2，3，p<0.05)。4、以miR-375作為胃癌檢測的輔助生物標(biāo)記物以病理形態(tài)學(xué)檢査結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，60位患者中共29位患者的被檢組織為腫瘤組織，31位患者為非腫瘤組織。Real-timePCR檢測組織中miR-375的相對定量(以編號611的組織中miR-375的RQ值為參照)。以0.2為臨界值，miR-375的表達量小于等于臨界值的組織診斷為腫瘤組織，大于0.2的組織診斷為非腫瘤組織。以miR-375的相對含量作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，胃癌組織中>0.2的共5例，<=0.2共24例，非胃癌組織中>0.2的共22例，<=0.2共9例。miR-375作為診斷指標(biāo)的特異性為72.7%(24/33)，敏感性為82.8%(24/29)。具體檢測結(jié)果參見表l。表l:miR-375診斷實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1.一種檢測用生物標(biāo)記物，其特征在于以檢測樣本中microRNA-375的表達量作為生物標(biāo)記，以miR-375表達量小于等于0.2為臨界值。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測用生物標(biāo)記物，其特征在于通過以下步驟實現(xiàn)取氮凍存的組織l-3塊，使用mirVanaTMmiRNAIsolation試劑盒提取總RNA,再使用miR-375特異的TaqmanMicroRNAAssays試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測；采用相對定量的方法，得到目標(biāo)組織相對于參照組織miR-375的含量，參照組織為病理確診后的正常胃組織；以0.2為臨界值，miR-375表達量小于等于0.2的組織檢測認為是腫瘤組織，大于0.2的組織檢測認為是非腫瘤組織。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測用生物標(biāo)記物，其特征在于所述實時熒光定量PCR體系中包含1.33逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，反應(yīng)在96孔板中進行，反應(yīng)條件是95°C，10分鐘，繼以4個循環(huán)的95。C，15秒60。C，1分鐘。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測用生物標(biāo)記物在檢測組織中胃癌miR-375表達量中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種檢測用生物標(biāo)記物，以檢測樣本中microRNA-375的表達量作為生物標(biāo)記，以miR-375表達量小于等于0.2為臨界值，miR-375表達量小于等于0.2的認為是腫瘤組織，大于0.2的認為是非腫瘤組織。本發(fā)明提供的生物標(biāo)記物檢測胃癌的特異性72.7％，敏感性82.8％，具有敏感性和特異性高，操作方便等特點，有較高的參考價值，可在檢測胃癌組織中應(yīng)用。本發(fā)明有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制，為腫瘤的個體化靶向治療奠定基礎(chǔ)。文檔編號C12Q1/68GK101423869SQ20081016315公開日2009年5月6日申請日期2008年12月18日優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日發(fā)明者玲丁,周天華,姒健敏,陳淑潔申請人:浙江大學(xué);杭州博通胃腸病診治技術(shù)有限公司