本申請要求2014年2月3日提交的美國臨時申請No.61/935,040和2014年8月13日提交的美國臨時申請No.62/036,876的權(quán)益，所述美國臨時申請的內(nèi)容均以引用的方式整體并入本文。

關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明

本發(fā)明在美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的資助號R01CA149623-01A1下通過政府支持進行。政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。

背景

硼酸化合物顯示各種藥學(xué)上有用的生物活性。Shenvi等的美國專利No.4,499,082公開了肽硼酸是某些蛋白水解酶的抑制劑。Kettner和Shenvi的美國專利No.5,187,157、美國專利No.5,242,904和美國專利No.5,250,720公開了抑制胰蛋白酶樣蛋白酶的一類肽硼酸。Kleeman等的美國專利No.5,169,841公開了抑制腎素作用的N-末端修飾的肽硼酸。Kinder等的美國專利No.5,106,948公開了抑制癌細胞生長的某些三肽硼酸化合物。

由于公開了硼酸酯和酸性化合物而通過引用整體并入本文的Adams等的美國專利No.5,780,454、美國專利No.6,066,730、美國專利No.6,083,903和美國專利No.6,297,217，公開了用作蛋白酶體抑制劑的肽硼酸酯和酸性化合物。所述引用也描述了使用硼酸酯和酸性化合物，以降低肌肉蛋白的降解速率，以降低細胞中NF-κB的活性，以降低細胞中p53蛋白的降解速率，以抑制細胞中細胞周期蛋白降解，以抑制癌細胞的生長，以抑制細胞中抗原呈遞，以抑制NF-κB依賴性的細胞粘附，并且以抑制HIV復(fù)制。Brand等的WO 98/35691公開了蛋白酶抑制劑(包括硼酸化合物)可用于治療梗塞，諸如那些在中風(fēng)或心肌梗塞期間發(fā)生的梗塞。Elliott等的WO 99/15183公開了蛋白酶抑制劑可用于治療炎性疾病和自身免疫疾病。

硼替佐米(BTZ)是目前由美國食品和藥品管理局批準的用于治療多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤的硼酸蛋白酶體抑制劑。BTZ在臨床上通過皮下注射或靜脈內(nèi)注射施用。盡管用BTZ治療是有效的，但游離BTZ的施用依然被高毒性、非特異性組織攝取、副作用和從循環(huán)中迅速清除所困擾。BTZ還擁有有限的穩(wěn)定性(例如有限的儲存期限)，使BTZ的治療用途變得復(fù)雜。已經(jīng)努力開發(fā)改進的BTZ制劑來解決這些不足。

脂質(zhì)體是脂質(zhì)雙層(例如磷脂雙層)制成的球狀囊泡，其能夠在它們的水性核心內(nèi)包封親水性藥物，或在它們的脂質(zhì)雙層內(nèi)包封疏水性藥物。脂質(zhì)體藥物可以提供延長的全身循環(huán)時間、減少的藥物毒性和增強的藥物遞送功效。例如，某些化療劑的脂質(zhì)體制劑，包括柔紅霉素(由Gilead Sciences以名稱DAUNOXOME出售)、多柔比星(由Ortho Biotech以名稱DOXIL和由Schering-Plough以名稱CAELYX出售)和長春新堿(由Spectrum Pharmaceuticals以名稱MARQIBO出售)，已經(jīng)被FDA批準，并且相對于這些化療劑的替代制劑表現(xiàn)出延長的全身循環(huán)時間、減少的藥物毒性和增強的藥物遞送功效。

制備硼酸和酯化合物的脂質(zhì)體制劑(諸如BTZ)的努力迄今為止已經(jīng)遭受了顯著的缺點。被動包埋方法和遠程裝載方法都被用來制備BTZ的脂質(zhì)體制劑。被動包埋方法提供非常低的包封效率，經(jīng)常低于15％，這是有問題的。為了解決這個問題，開發(fā)了遠程裝載，其中BTZ在預(yù)成形的脂質(zhì)體中的包埋由pH和化學(xué)梯度驅(qū)動。這個過程復(fù)雜并且需要過夜孵育。另外，所得到的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差，這就可以排除臨床開發(fā)。

一直利用凍干來進一步增加脂質(zhì)體的儲存期限。但是，因為被動包埋和遠程裝載工藝都是將藥物包埋在脂質(zhì)體的水性核心中，脂質(zhì)體的內(nèi)容物即使在凍干保護劑存在下，在脫水和再水合過程期間也易于泄漏。

需要表現(xiàn)出改進的性質(zhì)(諸如增強的穩(wěn)定性)的新型硼酸活性劑的制劑(諸如BTZ)來解決這些不足。本文公開的組合物和方法解決了這些和其他需要。

概述

根據(jù)所公開的主題的目的，正如本文所體現(xiàn)和廣泛描述的，在一方面，本公開涉及組合物以及制造和使用所述組合物的方法。在另外的實例中，本文公開的主題涉及硼酸治療劑的硼酸酯。硼酸酯可以用于制備包含和/或釋放具有改進的性質(zhì)(諸如增強的穩(wěn)定性)硼酸治療劑的脂質(zhì)體制劑。

例如，本文公開式I的化合物

其中

P¹可以為氫或氨基基團保護部分；

R⁰可以為氫或烷基基團；

R¹、R²和R³可以獨立地為氫、烷基基團、環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、芳基基團、雜芳基基團或-CH₂-R⁴；

R⁴可以為芳基基團、烷基芳基基團、芳基烷基基團、環(huán)烷基基團、烷基環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、烷基雜環(huán)基基團、雜芳基基團、烷基雜芳基基團、烷氧基基團或烷硫基基團；

m可以為0、1或2；

Z與O¹和O²一起表示衍生自多元醇的部分；

L可以不存在或者為連接基團；并且

A可以為親脂性部分。

在一些實例中，m為0。

在一些實例中，P¹可以為氨基基團保護部分。例如，P¹可以為R⁵-C(O)-、R⁵-S(O)₂-、R⁵-NH-C(O)-或R⁵-O-C(O)-，其中R⁵為烷基基團、芳基基團、烷基芳基基團、芳基烷基基團、環(huán)烷基基團、烷基環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、烷基雜環(huán)基基團、雜芳基基團或烷基雜芳基基團。在一些實例中，P¹可以為R⁵-C(O)-、R⁵-S(O)₂-、R⁵-NH-C(O)-或R⁵-O-C(O)-，并且R⁵為雜芳基基團。在某些實例中，P¹可以為(2-吡嗪)羰基。

在某些實例中，R³為異丁基基團。

多元醇可為任何合適的多元醇。在一些實例中，多元醇可以包括糖(例如單糖諸如果糖)。在某些實例中，多元醇可以包括還原糖(例如糖醇諸如甘露醇、山梨醇或半乳糖醇)。在某些實例中，多元醇可以包括氨基糖(例如葡甲胺(meglumine)或還原葡糖胺(glucamine))。在某些實例中，多元醇可以為葡甲胺、還原葡糖胺、甘露醇、山梨醇或半乳糖醇。

A可以為任何合適的親脂性部分。所述親脂性部分可以衍生自脂質(zhì)。在一些實例中，所述脂質(zhì)可以包括脂肪酸、甘油酯、磷脂、鞘脂、固醇或異戊烯醇。

在一些實例中，A可以為C₈-C₄₀烷基基團、C₈-C₄₀烯基基團、C₈-C₄₀烷氧基基團、C₈-C₄₀烷硫基基團、C₈-C₄₀烷基亞磺?；鶊F、C₈-C₄₀烷基磺?；鶊F、C₈-C₄₀烷基氨基基團、C₈-C₄₀二烷基氨基基團、C₈-C₄₀烷基羰基基團、C₈-C₄₀烷氧基羰基基團、C₈-C₄₀烷基氨基羰基基團、C₈-C₄₀二烷基氨基羰基基團或由式定義的部分

其中

虛線指示單鍵或雙鍵存在；

R⁶可以為烷基基團、烯基基團、炔基基團、芳基基團、烷基芳基基團、芳基烷基基團、環(huán)烷基基團、烷基環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、烷基雜環(huán)基基團、雜芳基基團、烷基雜芳基基團、烷氧基基團或烷硫基基團；并且

R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹可以獨立地為氫、羥基基團、氨基基團、烷基基團、烯基基團、炔基基團、芳基基團、烷基芳基基團、芳基烷基基團、環(huán)烷基基團、烷基環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、烷基雜環(huán)基基團、雜芳基基團、烷基雜芳基基團、烷氧基基團、烷硫基基團、烷基亞磺?；鶊F、烷基磺?；鶊F、烷基氨基基團、二烷基氨基基團、烷基羰基基團、烷氧基羰基基團、烷基氨基羰基基團或二烷基氨基羰基基團。

在某些實例中，所述化合物可以由式IA定義

其中Z、L和A可以是如上面關(guān)于式I所定義的。

在某些實例中，所述化合物由式II定義

其中

P¹、R⁰、R¹、R²、R³、R⁴、m、L和A可以是如上面關(guān)于式I所定義的，

X可以為-O-或-NR¹²-；并且

R¹²可以為氫或烷基基團。

在某些實例中，R¹²可以為氫。在其他實例中，R¹²為烷基基團。例如，R¹²可以為C₁-C₆烷基基團。在一些實例中，R¹²可以為C₁-C₄烷基基團。在某些實例中，R¹²可以為甲基或乙基。

在某些實例中，X可以為-O-。在其他實例中，X可以為-NH-或-N(CH₃)-。

在某些實例中，所述化合物由式IIA定義

其中X、R¹²、L和A可以如上面關(guān)于式II所定義的。

在某些實施方案中，所述化合物可為以下中的一個：

在中性或堿性pH(例如，pH 8)時，本文所述的硼酸酯可以為陰離子。在這些情況下，附加的去質(zhì)子化的羥基基團可以附接到本文所述的化合物的硼原子上，并且所述化合物可以以鹽的形式存在。

還提供了包括由囊泡形成脂質(zhì)形成的脂質(zhì)體的藥物制劑，并且本文所述的化合物被包埋在脂質(zhì)體中。在一些實例中，可以凍干所述制劑。所述脂質(zhì)體制劑可以在凍干期間維持穩(wěn)定性，并且一旦凍干，當(dāng)儲存在室溫下時，可以保持穩(wěn)定長達六個月時間。在一些實例中，所述制劑還可以包括凍干保護劑，諸如蔗糖或海藻糖。

還提供了在受試者中治療癌癥的方法。方法可以包括給受試者施用治療有效量的本文所述的化合物或制劑。

所公開主題的其他優(yōu)點將部分在隨后的描述和圖中闡述，并且部分根據(jù)描述將是顯而易見的，或可通過實踐下述方面而了解。以下所描述的優(yōu)點將借助在所附權(quán)利要求書中具體指出的要素和組合來實現(xiàn)和達到。應(yīng)理解，前面的概述和下面的詳述都僅僅是示例性和說明性的而不是限制性的。

附圖簡述

并入本說明書中并構(gòu)成本說明書一部分的附圖，示出了下述的若干方面。

圖1是示出BTZ-OMG脂質(zhì)體制劑的裝載的Sepharose CL-4B色譜圖。

圖2是示出pH對BTZ-MEGA-12在脂質(zhì)體中的裝載效率的影響的圖。

圖3是示出BTZ-MEGA-12脂質(zhì)體制劑的裝載的Sepharose CL-4B色譜圖。

圖4是示出BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑的裝載的Sepharose CL-4B色譜圖。

圖5是表示在28周時間內(nèi)凍干的BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑的膠體穩(wěn)定性的曲線圖。

圖6是凍干的脂質(zhì)體包括BTZ-MEGA-CHOL的低溫-TEM顯微照片。

圖7是表示BTZ和BTZ-MEGA-CHOL對SUB6白血病細胞的細胞毒性的圖。

圖8是表示BTZ和BTZ-MEGA-CHOL對K562白血病細胞的細胞毒性的圖。

圖9是評價MV4-11移植的NSG小鼠響應(yīng)于BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑處理的存活的試驗1的圖。

圖10是評價MV4-11移植的NSG小鼠響應(yīng)于BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑處理的存活的試驗2的圖。

圖11是評價MV4-11移植的NSG小鼠響應(yīng)于BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑處理的存活的試驗1和試驗2的組合結(jié)果的圖。

圖12是示出用空脂質(zhì)體(頂部顯微照片)處理四周后和用BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑(底部顯微照片)處理四周后MV4-11移植的NSG小鼠中白血病母細胞的濃度差異的顯微照片。使用BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑處理4周后，從MV4-11移植的NSG小鼠中消除了白血病母細胞。

圖13示出了與用空脂質(zhì)體處理四周相比，用BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑治療四周減少了MV4-11移植的NSG小鼠的脾尺寸。

圖14是通過監(jiān)測在37℃pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中隨時間推移的脂質(zhì)體內(nèi)的藥物含量來表示BTZ從脂質(zhì)體中釋放的速度的圖。

圖15是表示在靜脈內(nèi)施用單一劑量的游離BTZ和L-BTZ(1mg/kg)后小鼠中血漿藥物濃度對時間的圖。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±SD(n＝3)。

詳述

通過參考公開主題的特定方面的以下詳細描述和其中包括的實施例和圖，可以更容易地理解本文中描述的材料、化合物、組合物、物品和方法。

在公開和描述本發(fā)明的材料、化合物、組合物和方法之前，應(yīng)理解下述方面不限于特定的合成方法或特定的藥劑，因此當(dāng)然可以變化。還應(yīng)理解，本文所使用的術(shù)語僅出于描述特定方面的目的，且并不意圖加以限制。

而且，貫穿本說明書參考了多種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容特此以引用的方式整體并入本申請以便更充分地描述所公開的主題涉及的領(lǐng)域的現(xiàn)狀。對所公開的參考文獻中包含并且在其引用的句子中討論的材料還單獨并具體地以引用的方式并入本文。

一般定義

在本說明書和隨附權(quán)利要求書中，將會提及多個術(shù)語，這些術(shù)語應(yīng)被定義為具有以下含義：

貫穿本說明書的描述和權(quán)利要求，詞語“包括(comprise)”和所述詞語的其他形式如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”意指包括但不限于并且不旨在排除例如其他添加劑、組分、整數(shù)或步驟。

除非上下文另外明確規(guī)定，否則在描述和隨附的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一個/種(a/an)”和“所述(the)”包括多個指示物。因此，例如，提及“一種組合物”包括兩種或更多種這些組合物的混合物，提及“所述化合物”包括兩種或更多種這些化合物的混合物，提及“一種藥劑”包括兩種或更多種這些藥劑的混合物等。

“任選的”或“任選地”意指后面描述的事項或情形可能發(fā)生，或者可能不發(fā)生，并且所述描述包括所述事項或情形發(fā)生的情況和不發(fā)生的情況。

本文中使用的“受試者”表示個體。因此，“受試者”可以包括馴養(yǎng)的動物(例如，貓、狗等)、家畜(例如，牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、實驗室動物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和禽類?！笆茉囌摺边€可以包括哺乳動物，如靈長類動物或人。

“降低(reduce)”或所述詞語的其他形式，如“降低(reducing)”或“降低(reduction)”意指事件或特征(例如，腫瘤生長)的減少。應(yīng)當(dāng)理解，這通常是相對于一些標準或預(yù)期值，換句話說，它是相對的，但是它對于待提及的標準或相對值來說并不總是必需的。例如，“降低腫瘤生長”意指相對于標準或?qū)φ战档湍[瘤生長的速度。

“預(yù)防(prevent)”或所述詞語的其他形式，如“預(yù)防(preventing)”或“預(yù)防(prevention)”意為終止具體的事件或特征，穩(wěn)定或延遲具體事件或特征的發(fā)展或進展，或使具體事件或特征發(fā)生的機會最小化。預(yù)防不需要與對照比較，因為它通常比例如降低更絕對。如本文所用，某事可以被降低但不可被預(yù)防，但是被降低的某事也可以被預(yù)防。同樣，某事可以被預(yù)防但是不可被降低，但是被預(yù)防的某事也可以被降低。應(yīng)當(dāng)理解，使用降低或預(yù)防時，除非特別指出，否則也明確地公開其他詞語的使用。

“治療(treat)”或所述詞語的其他形式，如“經(jīng)過治療的(treated)”或“治療(treatment)”意為為了降低、預(yù)防、抑制或消除具體的特征或事件(例如，腫瘤生長或存活)而施用組合物或執(zhí)行方法。術(shù)語“控制”可與術(shù)語“治療”同義使用。

術(shù)語“抗癌”是指以任何濃度治療或控制細胞增殖和/或腫瘤生長的能力。

應(yīng)當(dāng)理解，貫穿本說明書，使用標識符“第一”和“第二”僅僅是為了幫助區(qū)分公開的主題的各種組分和步驟。標識符“第一”和“第二”不旨在暗示由這些術(shù)語修飾的組分或步驟的任何具體的順序、量、優(yōu)先性或重要性。

化學(xué)定義

除非另外指明本文所使用的術(shù)語將具有在本領(lǐng)域中它們慣用的含義。定義本文所述的一般式中的可變位置時提到的有機部分(例如，術(shù)語“鹵素”)是所述有機部分涵蓋的單個取代基的集合性術(shù)語。前綴C_n-C_m在每種情況下指示基團中的碳原子可能的數(shù)目。

如本文所用，術(shù)語“烷基”是指飽和的直鏈的、支鏈的、伯、仲或叔烴，包括具有1至20個原子的那些烴。在某些實例中，烷基基團將包括C₁-C₁₂、C₁-C₁₀、C₁-C₈、C₁-C₆、C₁-C₅、C₁-C₄、C₁-C₃或C₁-C₂烷基基團。C₁-C₁₀烷基基團的實例包括但不限于甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、庚基、辛基、2-乙基己基、壬基和癸基基團，以及其異構(gòu)體。C₁-C₄-烷基基團的實例包括例如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基和1,1-二甲基乙基基團。

環(huán)狀烷基基團或“環(huán)烷基”基團包括具有3至10個碳原子的環(huán)烷基。環(huán)烷基基團可以包括單環(huán)或多個稠環(huán)。在某些實例中，環(huán)烷基基團包括C₃-C₄、C₄-C₇、C₅-C₇、C₄-C₆或C₅-C₆環(huán)狀烷基基團。環(huán)烷基基團的非限制性實例包括金剛烷基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基等等。

烷基和環(huán)烷基基團可以為未取代的或由選自以下的一個或多個部分取代的：烷基、鹵基、鹵代烷基、羥基、羧基、?；?、酰氧基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基、酰胺基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、疊氮基、巰基、亞氨基、磺酸、硫酸根、磺酰基、硫烷基、亞磺酰基、氨磺?；?sulfamonyl)、酯、膦?；⒀蹯⒒?、磷酰基、膦、硫酯、硫醚、酰鹵、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、磷酸、磷酸鹽、膦酸鹽，或不抑制本發(fā)明的化合物的生物活性的、未保護的或必要時保護的、如本領(lǐng)域技術(shù)人員的已知中、例如如在Greene等,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,第三版,1999(以引用方式整體并入本文)中所述的任何其他可行的官能團。

包括術(shù)語“烷基”諸如“烷基氨基”或“二烷基氨基”的術(shù)語將被理解為包含如上所定義的偶聯(lián)至另一官能團的烷基基團，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解，其中所述基團通過列出的最后一組偶聯(lián)至化合物上。

如本文所用，術(shù)語“烯基”是指具有至少一個碳-碳雙鍵的不飽和直鏈和支鏈碳鏈。在一些實例中，烯基基團可以包括C₂-C₂₀烯基基團。在其他實例中，烯基可以包括C₂-C₁₂、C₂-C₁₀、C₂-C₈、C₂-C₆或C₂-C₄烯基。在烯基的一個實施方案中，雙鍵的數(shù)目為1-3，在烯基的另一個實施方案中，雙鍵的數(shù)目是一或二。碳-碳雙鍵和碳原子數(shù)的其他范圍也考慮取決于烯基部分在分子上的位置?！癈₂-C₁₀-烯基”基團可以在鏈中包括多于一個的雙鍵。烯基基團中的一個或多個不飽和鍵可以位于化合價允許的碳鏈的任何位置。在一些實例中，當(dāng)烯基基團被共價結(jié)合到一個或多個附加部分時，共價結(jié)合到一個或多個附加部分的烯基基團中的碳原子不是烯基基團內(nèi)的碳-碳雙鍵部分。烯基基團的實例包括但不限于，乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基-乙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基、1,2-二甲基-1-丙烯基、1,2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、4-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基、1,2-二甲基-1-丁烯基、1,2-二甲基-2-丁烯基、1,2-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-1-丁烯基、1,3-二甲基-2-丁烯基、1,3-二甲基-3-丁烯基、2,2-二甲基-3-丁烯基、2,3-二甲基-1-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-3-丁烯基、3,3-二甲基-1-丁烯基、3,3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-1-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1,1,2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-甲基-1-丙烯基和1-以及-2-甲基-2-丙烯基基團。

如本文所用，術(shù)語“炔基”是指具有至少一個碳-碳三鍵的不飽和直鏈和支鏈碳鏈。在炔基的一個實施方案中，三鍵的數(shù)目為1-3，在炔基的另一個實施方案中，三鍵的數(shù)目是一或二。在一些實例中，炔基基團包括C₂-C₂₀炔基基團。在其他實例中，炔基基團可以包括C₂-C₁₂、C₂-C₁₀、C₂-C₈、C₂-C₆或C₂-C₄炔基基團。碳-碳三鍵和碳原子數(shù)的其他范圍也考慮取決于烯基部分在分子上的位置。例如，如本文所用，術(shù)語“C₂-C₁₀-炔基”是指具有2至10個碳原子并含有至少一個三鍵的直鏈或分支的不飽和烴基，諸如乙炔基、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基、正丁-1-炔-1-基、正丁-1-炔-3-基、正丁-1-炔-4-基、正丁-2-炔-1-基、正戊-1-炔-1-基，正戊-1-炔-3-基，正戊-1-炔-4-基、正戊-1-炔-5-基、正戊-2-炔-1-基、正戊-2-炔-4-基、正戊-2-炔-5-基、3-甲基丁-1-炔-3-基、3-甲基丁-1-炔-4-基、正己-1-炔-1-基、正己-1-炔-3-基、正己-1-炔-4-基、正己-1-炔-5-基、正己-1-炔-6-基、正己-2-炔-1-基、正己-2-炔-4-基、正己-2-炔-5-基、正己-2-炔-6-基、正己-3-炔-1-基、正己-3-炔-2-基、3-甲基戊-1-炔-1-基、3-甲基戊-1-炔-3-基、3-甲基戊-1-炔-4-基、3-甲基戊-1-炔-5-基、4-甲基戊-1-炔-1-基、4-甲基戊-2-炔-4-基和4-甲基戊-2-炔-5-基基團。

烯基和炔基基團可以為未取代的或由選自以下的一個或多個部分取代的：烷基、鹵基、鹵代烷基、羥基、羧基、?；ⅤＱ趸?、氨基、烷基氨基或二烷基氨基、酰胺基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、疊氮基、巰基、亞氨基、磺酸、硫酸根、磺?；?、硫烷基、亞磺?；?、氨磺?；?sulfamonyl)、酯、膦?；?、氧膦基、磷?；?、膦、硫酯、硫醚、酰鹵、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、磷酸、磷酸鹽、膦酸鹽，或不抑制本發(fā)明的化合物的生物活性的、未保護的或必要時保護的、如本領(lǐng)域技術(shù)人員的已知中、例如如在Greene等,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,第三版,1999中所述的任何其他可行的官能團。

如本文所用，術(shù)語“芳基”是指6至14個碳原子的單價碳環(huán)基團。芳基基團可以包括單環(huán)或多個稠環(huán)。在一些實例中，芳基基團包括C₆-C₁₀芳基基團。芳基基團包括但不限于苯基、聯(lián)苯基、萘基、四氫萘基、苯基環(huán)丙基和茚滿基。芳基基團可以為未取代的或由選自以下的一個或多個部分取代的：鹵基、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、鹵代烷基、鹵代烯基、鹵代炔基、鹵代環(huán)烷基、鹵代環(huán)烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、鹵代烷氧基、鹵代烯氧基、鹵代炔氧基、環(huán)烷氧基、環(huán)烯氧基、鹵代環(huán)烷氧基、鹵代環(huán)烯氧基、烷硫基、鹵代烷硫基、環(huán)烷硫基、鹵代環(huán)烷硫基、烷基亞磺酰基、烯基亞磺?；?、炔基-亞磺?；?、鹵代烷基亞磺酰基、鹵代烯基亞磺酰基、鹵代炔基亞磺?；?、烷基磺?；⑾┗酋；?、炔基磺?；Ⅺu代烷基-磺?；?、鹵代烯基磺?；Ⅺu代炔基磺?；?、烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、二(烷基)氨基、二(烯基)-氨基、二(炔基)氨基或三烷基甲硅烷基。

如本文所用，術(shù)語“烷基芳基”是指通過二價亞烷基橋(-CH₂-)_n結(jié)合到母體化合物的芳基基團，其中n為1-12(例如，n為1至6)并且其中“芳基”如上所定義。如本文所用，術(shù)語“芳基烷基”是指被如上所定義的烷基基團取代的如上所定義的芳基基團。

如本文所用，術(shù)語“烷基環(huán)烷基”是指通過二價亞烷基橋(-CH₂-)_n結(jié)合到母體化合物的環(huán)烷基基團，其中n為1-12(例如，n為1至6)并且其中“環(huán)烷基”如上所定義。

如本文所用，術(shù)語“烷氧基”是指烷基-O-，其中烷基是指如上所定義的烷基基團。類似地，術(shù)語“烯氧基”、“炔氧基”和“環(huán)烷氧基”分別指的是烯基-O-、炔基-O-和環(huán)烷基-O-基團，其中烯基、炔基和環(huán)烷基如上所定義。C₁-C₆-烷氧基基團的實例包括但不限于，甲氧基、乙氧基、C₂H₅-CH₂O-、(CH₃)₂CHO-、正丁氧基、C₂H₅-CH(CH₃)O-、(CH₃)₂CH-CH₂O-、(CH₃)₃CO-、正戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1,1-二甲基丙氧基、1,2-二甲基丙氧基、2,2-二甲基-丙氧基、1-乙基丙氧基、正己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基、1,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、2,3-二甲基丁氧基、3,3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1,1,2-三甲基丙氧基、1,2,2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基和1-乙基-2-甲基丙氧基。

如本文所用，術(shù)語“烷硫基”是指烷基-S-，其中烷基是指如上所定義的烷基基團。類似地，術(shù)語“環(huán)烷硫基”，是指環(huán)烷基-S-，其中環(huán)烷基如上所定義。

如本文所用，術(shù)語“烷基亞磺?；笔侵竿榛?S(O)-，其中烷基是指如上所定義的烷基基團。

如本文所用，術(shù)語“烷基磺?；笔侵竿榛?S(O)₂-，其中烷基如上所定義。

如本文所用，術(shù)語“烷基氨基”和“二烷基氨基”是指烷基-NH-和(烷基)₂N-基團，其中烷基如上所定義。

如本文所用，術(shù)語“烷基羰基”、“烷氧基羰基”、“烷基氨基羰基”和“二烷基氨基羰基”分別是指烷基-C(O)-、烷氧基-C(O)-、烷基氨基-C(O)-和二烷基氨基-C(O)-，其中烷基、烷氧基、烷基氨基和二烷基氨基如上述定義。

如本文所用，術(shù)語“雜芳基”是指在環(huán)內(nèi)具有一個或多個雜原子的1至15個碳原子(例如，1至10個碳原子、2至8個碳原子、3至6個碳原子或4至6個碳原子)的單價芳香基團。雜芳基基團可以包括1至4個雜原子、1至3個雜原子或1至2個雜原子。在一些實例中，并入環(huán)中的雜原子為氧、氮、硫或其組合。當(dāng)存在時，氮和硫雜原子可任選地被氧化。雜芳基基團可以具有單環(huán)(例如，吡啶基或呋喃基)或多個稠環(huán)，條件是連接點是通過雜芳基環(huán)原子。優(yōu)選的雜芳基包括吡啶基、噠嗪基、嘧啶基，吡嗪基、三嗪基、吡咯基、吲哚基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、呋喃基(furanyl)、噻吩基、呋喃基(furyl)、吡咯基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、異噻唑基、吡唑苯并呋喃基和苯并噻吩基。雜芳環(huán)可以為未取代或被一個或多個如上對芳基所述的一個或多個部分取代。

如本文所用，術(shù)語“烷基雜芳基”是指通過二價亞烷基橋(-CH₂-)_n結(jié)合到母體化合物的雜芳基基團，其中n為1-12并且其中“雜芳基”如上所定義。

術(shù)語“雜環(huán)基(heterocyclyl)”、“雜環(huán)的(heterocyclic)”和“雜環(huán)基(heterocyclo)”在本文中互換使用，并且是指完全飽和的或不飽和的環(huán)狀基團，例如3至7元單環(huán)或4至7元單環(huán)、7至11元雙環(huán)或10至15元三環(huán)環(huán)系，其中所述環(huán)內(nèi)具有一個或多個雜原子。雜環(huán)基團可以包括1至4個雜原子、1至3個雜原子或1至2個雜原子。在一些實例中，并入環(huán)中的雜原子為氧、氮、硫或其組合。當(dāng)存在時，所述氮和硫雜原子可任選地被氧化，并且氮雜原子可以任選地被季銨化。雜環(huán)基團可以附接在環(huán)或環(huán)系的任何雜原子或碳原子處，并且可以是未取代的或被如上文對芳基所述的一個或多個部分取代。

示例性單環(huán)雜環(huán)基團包括但不限于，吡咯烷基、吡咯基、吡唑基、氧雜環(huán)丁烷基、吡唑啉基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、異噁唑烷基、異噁唑基、噻唑基、噻二唑基、噻唑烷基、異噻唑基、異噻唑烷基、呋喃基、四氫呋喃基、噻吩基、噁二唑基、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮雜卓基、氮雜卓基、4-哌啶酮基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、四氫吡喃基、嗎啉基、硫雜嗎啉基、硫雜嗎啉基亞砜、硫雜嗎啉基砜、1,3-二氧戊環(huán)和四氫-1,1-二噁噻吩基、三唑基、三嗪基等。

示例性二環(huán)雜環(huán)基團包括但不限于，吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并二氧雜環(huán)戊烯基、苯并噻吩基、奎寧環(huán)基、喹啉基、四-氫異喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基(諸如呋喃并[2,3-c]吡啶基、呋喃并[3,2-b]吡啶基]或呋喃并[2,3-b]吡啶基)、二氫異吲哚基、二氫喹唑啉基(諸如3,4-二氫-4-氧代喹唑啉基)、四氫喹啉基等。

示例性三環(huán)雜環(huán)基團包括咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基、呫噸基等。

如本文所用，術(shù)語“烷基雜環(huán)基”是指通過二價亞烷基橋(-CH₂-)_n結(jié)合到母體化合物的雜環(huán)基基團，其中n為1-12并且其中“雜環(huán)基”如上所定義。如本文所用，術(shù)語“雜環(huán)基烷基”是指被如上所定義的烷基基團取代的如上所定義的雜環(huán)基基團。

雜環(huán)基和雜芳基基團可以為未取代的或由選自以下的一個或多個部分取代的：烷基、鹵基、鹵代烷基、羥基、羧基、?；?、酰氧基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基、酰胺基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、疊氮基、巰基、亞氨基、磺酸、硫酸根、磺?；⒘蛲榛?、亞磺?；?、氨磺酰基(sulfamonyl)、酯、膦?；?、氧膦基、磷?；?、膦、硫酯、硫醚、酰鹵、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、磷酸、磷酸鹽、膦酸鹽，或不抑制本發(fā)明的化合物的生物活性的、未保護的或必要時保護的、如本領(lǐng)域技術(shù)人員的已知中、例如如在Greene等,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,第三版,1999中所述的任何其他可行的官能團。

如本文所用，術(shù)語“鹵素”是氟、氯、溴和碘原子。前綴鹵代-(例如，如術(shù)語鹵代烷基所示)是指所有程度的鹵素取代，從單個取代至全鹵取代(例如甲基的氯甲基(-CH₂Cl)、二氯甲基(-CHCl₂)、三氯甲基(-CCl₃))。

如本文所用，術(shù)語“取代的”預(yù)期包括有機化合物的所有可允許的取代基。在廣義方面，容許的取代基包括有機化合物的無環(huán)和環(huán)狀的、支鏈或非支鏈的、碳環(huán)和雜環(huán)的、以及芳香族和非芳香族的取代基。說明性的取代基包括，例如以下所描述的那些。對于適當(dāng)?shù)挠袡C化合物，容許的取代基可以是一種或多種以及相同或不同的。出于本公開的目的，雜原子(諸如氮)可具有氫取代基和/或滿足雜原子的化合價的本文所述有機化合物的任何容許的取代基。本公開不旨在以任何方式受有機化合物的容許的取代基的限制。而且，術(shù)語“取代”或“被...取代”包括隱含條件，即這種取代符合被取代原子和取代基的容許化合價，并且取代產(chǎn)生穩(wěn)定化合物，例如不會自發(fā)地如通過重排、環(huán)化、消除等進行轉(zhuǎn)化的化合物。

除非相反規(guī)定，否則化學(xué)鍵只以實線示出而不是以楔形或虛線示出的式涵蓋各種可能的異構(gòu)體，例如各對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體和內(nèi)消旋化合物，以及異構(gòu)體的混合物諸如外消旋或非外消旋的混合物。

現(xiàn)將詳細參考公開的材料、化合物、組合物、物品和方法的特定方面，其實例在隨附的實例和附圖中說明。

化合物

本文公開了硼酸治療劑的硼酸酯。所述硼酸酯可以充當(dāng)硼酸治療劑的前藥。硼酸酯可以用于制備具有改進的性質(zhì)(諸如增強的穩(wěn)定性)的脂質(zhì)體制劑。

在某些方面，本文公開了由以式I定義的化合物

其中

P¹為氫或氨基基團保護部分；

R⁰為氫或烷基基團；

R¹、R²和R³獨立地為氫、烷基基團、環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、芳基基團、雜芳基基團或-CH₂-R⁴；

R⁴為芳基基團、烷基芳基基團、芳基烷基基團、環(huán)烷基基團、烷基環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、烷基雜環(huán)基基團、雜芳基基團、烷基雜芳基基團、烷氧基基團或烷硫基基團；

m為0、1或2；

Z與O¹和O²一起表示衍生自多元醇的部分；

L不存在或者為連接基團；并且

A為親脂性部分。

在一些實例中，P¹為氨基基團保護部分。氨基基團保護部分包括被用于衍生氨基基團(特別是肽或氨基酸的N-末端氨基基團)的基團。此類基團包括但不限于，烷基、酰基、烷氧基羰基、氨基羰基和磺酰基部分。然而，術(shù)語“氨基基團保護部分”不旨在被限定于在有機合成中常常采用的那些特定的保護基團，也不旨在被限定于易于裂解的基團。

在一些實例中，P¹為R⁵-C(O)-、R⁵-S(O)₂-、R⁵-NH-C(O)-或R⁵-O-C(O)-，其中R⁵為烷基基團、芳基基團、烷基芳基基團、芳基烷基基團、環(huán)烷基基團、烷基環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、烷基雜環(huán)基基團、雜芳基基團或烷基雜芳基基團。在某些實例中，P¹為R⁵-C(O)-、R⁵-S(O)₂-、R⁵-NH-C(O)-或R⁵-O-C(O)-，并且R⁵為雜芳基基團。在某些實例中，P¹為(2-吡嗪)羰基。

在一些實例中，R⁰為氫。在其他實例中，R⁰為烷基基團。例如，R⁰可以為C₁-C₆烷基基團。在一些實例中，R⁰可以為C₁-C₄烷基基團。在某些實例中，R⁰可以為甲基或乙基。

在一些實例中，R¹、R²和R³各自獨立地選自氫、C₁-C₈烷基、C₃-C₁₀環(huán)烷基、C₆-C₁₀芳基和—CH₂—R⁴，如上所述其中R¹、R²、R³和R⁴中的每個可以任選地被取代。在一些實例中，R¹、R²和R³各自獨立地選自C₁-C₄烷基和—CH₂—R⁴，并且R⁴為環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)基、雜芳基或烷氧基中的一個。在一些實例中，R¹、R²和R³各自獨立地選自C₁-C₄烷基和—CH₂—R⁴，并且R⁴為C₆-C₁₀芳基、(C₆-C₁₀)芳基(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷基(C₆-C₁₀)芳基、C₃-C₁₀環(huán)烷基、C₁-C₈烷氧基或C₁-C₈烷硫基、或5-至10-元雜芳環(huán)中的一個。在某些實例中，R³為異丁基。

m可以為0、1或2。當(dāng)m為0時，括號內(nèi)的殘基不存在，并且硼酸酯化合物為二肽。類似地，當(dāng)m為1時，括號內(nèi)的殘基存在，并且所述化合物為三肽。當(dāng)m為2時，所述化合物為四肽。在某些實例中，m為0。如本文所用，術(shù)語“肽”、‘二肽”和“三肽”旨在涵蓋包括天然氨基酸殘基、非天然氨基酸殘基或天然和非天然氨基酸殘基的組合的化合物。將顯而易見的是，術(shù)語“肽”、“二肽”和“三肽”用于指本文中的化合物，其中C末端氨基酸殘基的羧酸官能團由硼酸酯官能團替代。

如本文所用，術(shù)語“衍生自多元醇的部分”是指通過從多元醇的兩個羥基基團中去除氫原子形成的部分(即，包括兩個或更多個羥基基團的部分)。所述多元醇可以包括任何數(shù)目的羥基基團。例如，在一些實例中，多元醇可以包括2至8個羥基基團(例如，2至6個羥基基團)。在某些實例中，多元醇可以包括至少3個羥基基團(例如，3至8個羥基基團、3至6個羥基基團或3至5個羥基基團)。

衍生自多元醇的部分可通過所述多元醇的任何兩個羥基基團附接到硼原子上，使得所得的硼酸酯形成5-、6-、7-、8-或9-元環(huán)。在一些實例中，所述硼酸酯形成5-或6-元環(huán)。在某些實例中，多元醇可以包括1,2-二醇或1,3-二醇官能團。

多元醇可為任何合適的多元醇。例如，多元醇可以為聚合多元醇(例如聚乙烯醇)、芳族多元醇(例如，兒茶酚或鄰苯二酚衍生物)或糖(例如，單糖、二糖、寡糖或多糖)。在一些實施方案中，多元醇可以為非芳族多元醇(即，多元醇不包括芳族部分)。

在一些實例中，多元醇包括糖(例如單糖諸如果糖)。在某些實例中，多元醇可以包括還原糖(例如糖醇諸如甘露醇、山梨醇或半乳糖醇)。在某些實例中，多元醇可以包括氨基糖(例如葡甲胺或還原葡糖胺)。在某些實例中，多元醇為葡甲胺、還原葡糖胺、甘露醇、山梨醇或半乳糖醇。

在一些實例中，L不存在(即，Z直接結(jié)合到A上)。因而，本文預(yù)期了本文公開的式，其中-Z-L-A被表示為Z-A。在其他實例中，L存在并且為連接基團。所述連接基團可以是，例如，亞烷基、雜亞烷基、亞烯基、雜亞烯基、亞炔基、雜亞炔基、環(huán)亞烷基、烷基環(huán)亞烷基、環(huán)烷基亞烷基、雜亞環(huán)基、烷基雜亞環(huán)基、雜環(huán)亞烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基氨基羧基、雜烷基氨基羧基、二烷基氨基羧基或雜二烷基氨基羧基基團，Z通過所述連接基團結(jié)合至A。任選地，此類連接基團還可以包括一個或多個官能團，諸如下面描述的連接部分。所述連接基團也可以是連接Z和A的連接部分。合適連接部分是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如，仲酰胺(-CONH-)、叔酰胺(-CONR-)、仲氨基甲酸根(-OCONH-、-NHCOO-)、叔氨基甲酸根(-OCONR-、-NRCOO-)、脲(-NHCONH-、-NRCONH-、-NHCONR-、-NRCONR-)、甲醇(-CHOH-、-CROH-)、醚(-O-)和酯(-COO-、–CH₂O₂C-、CHRO₂C-)、亞胺和二硫鍵，其中R是烷基基團、芳基基團或雜環(huán)基基團。

A可以為任何合適的親脂性部分。所述親脂性部分可以包括衍生自脂質(zhì)的部分(例如，由脂質(zhì)與Z或L(當(dāng)存在時)共價反應(yīng)形成的部分)。所述脂質(zhì)可以為任何合適的天然存在的或合成的脂質(zhì)。例如，所述脂質(zhì)可以包括脂肪酸、甘油酯、磷脂、鞘脂、固醇或異戊烯醇。

在一些實例中，所述脂質(zhì)可包括脂肪酸。脂肪酸包括以羧酸基團終止的烴鏈。在一些實例中，脂肪酸可以包含至少12個碳原子。所述脂肪酸可以為飽和的、單不飽和的或多不飽和的脂肪酸。在一些實例中，所述脂肪酸可以是人體內(nèi)天然存在的脂肪酸。可以單獨使用或作為較大脂質(zhì)的一部分使用的合適的脂肪酸的實例，包括肉豆蔻酸(12:0，十四酸)、棕櫚酸(16:0，十六酸)、硬脂酸(18:0，十八酸)、花生酸(20:0，二十酸)和二十二烷酸(22:0，二十二酸)的飽和脂肪酸；棕櫚油酸(16:1(n-7)，順式-9-十六酸)、巖芹酸(18:1(n-12)，順式-6-十八酸)、油酸(18:1(n-9)，順式-十八酸)、順-異油酸(18:1(n-7)，順式-11-十八酸)、芥酸(22:1(n-9)，順-13-二十二酸)的單不飽和脂肪酸；和亞油酸(18:2(n-6)，9,12-十八碳二烯酸)、γ亞麻酸(18:3(n-6)，6,9,12-十八碳三烯酸)、α亞麻酸(18:3(n-3)，9,12,15-十八碳三烯酸)、花生四烯酸(20:4(n-6)，5,8,11,14,17-二十碳四烯酸)、EPA(20:5(n-3)，5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)和DHA(22:6(n-3)，4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)的多不飽和酸。

具有取代基或沿碳鏈分支的脂肪酸衍生物也可以在本發(fā)明中使用，條件是要維持所述衍生脂肪酸的脂質(zhì)特征。例如，所述脂肪酸可以為擁有10-30個碳原子的支鏈的脂肪酸。分支可以包括一個或多個沿飽和的或不飽和的脂肪酸鏈的任何位置取代的甲基基團，或者涉及更大的烷基基團。其他可用的脂肪酸包括那些沿脂肪酸主鏈或在末端位置具有一個或多個脂環(huán)族環(huán)的脂肪酸。另外可用的脂肪酸也包括羥基脂肪酸，其中羥基基團在羧酸的兩個碳原子之內(nèi)(α-和β-羥基脂肪酸)。羥基脂肪酸的α-或β-羥基也可通過形成醚或酯進一步衍生以在脂質(zhì)上添加第二條脂肪酸鏈，從而增加其親脂性質(zhì)。脂肪酸的前述討論也適用于其在以下類型的脂質(zhì)中的使用，其中所述脂質(zhì)包括脂肪酸組分。

除了以其天然存在的形式被使用外，上述脂肪酸還可以被修飾，例如，通過將酸頭基轉(zhuǎn)化為醇或胺、可進一步衍生為離去基團的醇或離去基團，以更好地促進共價或非共價結(jié)合到由Z或L。還有，可以通過添加一個短間隔，例如，形成具有2-氨基乙醇、乙二醇或擁有所需官能團的其他乙醇衍生物的酯使所述脂肪酸衍生。制備此類修飾的脂肪酸所需的所有化學(xué)品被有機合成領(lǐng)域的化學(xué)技術(shù)人員認為是常規(guī)和公知的。

在一些實例中，所述脂質(zhì)包括脂肪酰胺。脂肪酰胺是脂肪酸的酰胺類似物。合適的脂肪酰胺包括那些其中的脂肪酸，如上所述通過例如，用2-氨基乙醇處理轉(zhuǎn)換為酰胺，從而提供可被進一步修飾(如果需要)的醇的脂肪酰胺。類似地，脂肪酰胺可以使用二胺(諸如1,2-乙二胺)形成，從而提供用于促進連接至Z或L的伯胺。合適的脂肪酰胺也可以使用脂肪酸和氨基酸形成，然后其可以進一步衍生(如果需要)。脂肪酰胺實例包括花生四烯乙醇酰胺(anandamide)、N-花生四烯酰甘氨酸(N-arachidonoylglycine)和N-棕櫚酰乙醇胺(N-palmitoylethanolamide)。

在一些實例中，所述脂質(zhì)包括甘油酯。如上所述，合適的甘油脂包括單酰甘油酯和二酰甘油酯(例如，單?；视秃投；视秃吞腔视?glycosylglycerol))，其包括脂肪酸。

在一些實例中，所述脂質(zhì)可包括磷脂。合適的磷脂的實例包括磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰-L-蘇氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、雙磷脂酰甘油(心磷脂)和磷酸糖脂(phosphoglycolipid)。其他合適的磷脂包括醚磷脂(例如，烷酰基磷脂和烯?；字?、溶血磷脂以及上述的任何磷脂，其中所述脂肪酸鏈中的一個已經(jīng)被水解以得到單酰基、單烷基或單烯基磷酸酯。

在一些實例中，所述脂質(zhì)可包括鞘脂。合適的鞘脂的實例包括鞘氨醇和其他類鞘氨醇堿(sphingoid base)、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺磷脂和糖鞘脂。神經(jīng)酰胺磷脂的實例包括除其中的神經(jīng)酰胺結(jié)合到磷酸基團上的鞘磷脂(例如，鞘脂諸如神經(jīng)酰胺磷?；掖及贰⑸窠?jīng)酰胺磷?；视秃蜕窠?jīng)酰胺肌醇)之外的鞘脂。合適的類鞘氨醇堿可以包括具有不同碳鏈(長度、不飽和羥基化)的類鞘氨醇堿的類似物。在一些實例中，類鞘氨醇堿中的碳鏈可包括14-24個碳原子。合適的類鞘氨醇堿包括鞘氨醇(d18:1，d18:1^Δ4t，4E-d18:1，或其順式異構(gòu)體：d18:1^Δ4c，4Z-d18:1)、二氫鞘氨醇(d18:0，二氫鞘氨醇)、植物鞘氨醇(t18:0)和脫氫植物鞘氨醇(t18:1，t18:1^Δ8t，8E-t18:1，或其順式異構(gòu)體：t18:1^Δ8c，8Z-t18:1)和二十鞘氨醇(eicosasphingosine)(d20:1，4E-d20:1，d20:1^Δ4t)。

在一些實例中，所述脂質(zhì)可包括固醇。合適的固醇脂質(zhì)包括固醇和氧固醇，所述氧固醇中膽固醇的A或B環(huán)被氧化，而不是烷基鏈被氧化，例如7β-羥基膽固醇或4β-羥基膽固醇。其他合適的氧固醇包括其中膽固醇的烷基側(cè)鏈已被羥基化(并且任選地轉(zhuǎn)化為胺)并且膽固醇骨架的A和B環(huán)處于還原形式(即，脫羥基)的氧固醇。其他合適的氧固醇包括擁有被氧化為羧酸的伯羥基基團的氧固醇，包括其中所述羧酸已經(jīng)被酯化(例如，與2-氨基乙醇)的實例。

除了在哺乳動物中常見的固醇，合適的固醇可以包括來自其他來源諸如植物基固醇(植物固醇)的固醇。植物固醇實例包括但不限于菜油固醇、谷固醇、菜籽固醇、豆固醇、燕麥固醇。

其他合適的固醇包括衍生的固醇。固醇也可以通過向任何上述固醇或氧固醇的A環(huán)的3-羥基取代基或烷基側(cè)鏈的羥基取代基加入，例如，2-氨基乙醇、肌醇、絲氨酸、糖苷、磷?；掖及?、膦?；掖及贰⒘柞；z氨酸、磷?；〈?、磷?；擒栈蛴?-氨基乙醇、絲氨酸、磷?；掖及坊蜢Ⅴ；掖及费苌奶擒諄硌苌?。

在一些實例中，所述脂質(zhì)可包括異戊烯醇。合適的異戊烯醇脂質(zhì)可以包括脂溶性維生素(例如，維生素A、E和K)，以及其他異戊烯醇脂質(zhì)，包括其他生育酚、生育三烯酚、視黃酸、多萜醇和聚異戊烯醇。其他合適的異戊烯醇包括異戊烯醇的二磷酸酯衍生物，諸如焦磷酸法尼酯和前角鯊烯二磷酸酯(presqualene diphosphate)。異戊烯醇脂質(zhì)也可以通過，例如，向可用的羥基取代基添加2-氨基乙醇、肌醇、絲氨酸、糖苷、磷?；掖及?、膦?；掖及?、磷?；z氨酸、磷?；〈肌⒘柞；擒铡⒒蛴?-氨基乙醇、絲氨酸、磷?；掖及坊蜢Ⅴ；掖及费苌奶擒諄磉M一步衍生。

在一些實例中，A為C₈-C₄₀烷基基團、C₈-C₄₀烯基基團、C₈-C₄₀烷氧基基團、C₈-C₄₀烷硫基基團、C₈-C₄₀烷基亞磺酰基基團、C₈-C₄₀烷基磺酰基基團、C₈-C₄₀烷基氨基基團、C₈-C₄₀二烷基氨基基團、C₈-C₄₀烷基羰基基團、C₈-C₄₀烷氧基羰基基團、C₈-C₄₀烷基氨基羰基基團、C₈-C₄₀二烷基氨基羰基基團或由下式定義的部分

其中

虛線指示單鍵或雙鍵可以存在；

R⁶為烷基基團、烯基基團、炔基基團、芳基基團、烷基芳基基團、芳基烷基基團、環(huán)烷基基團、烷基環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、烷基雜環(huán)基基團、雜芳基基團、烷基雜芳基基團、烷氧基基團或烷硫基基團；并且

R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹獨立地為氫、羥基基團、氨基基團、烷基基團、烯基基團、炔基基團、芳基基團、烷基芳基基團、芳基烷基基團、環(huán)烷基基團、烷基環(huán)烷基基團、雜環(huán)基基團、烷基雜環(huán)基基團、雜芳基基團、烷基雜芳基基團、烷氧基基團、烷硫基基團、烷基亞磺酰基基團、烷基磺?；鶊F、烷基氨基基團、二烷基氨基基團、烷基羰基基團、烷氧基羰基基團、烷基氨基羰基基團或二烷基氨基羰基基團。

在某些實例中，A為下式定義的部分

其中虛線指示單鍵或雙鍵可以存在；并且R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹如上所定義。在一個實例中，A為以下結(jié)構(gòu)所定義。

在某些實例中，所述化合物可以由式IA定義

其中Z、L和A如上面關(guān)于式I所定義的。

在某些實例中，所述化合物由式II定義

其中

P¹、R⁰、R¹、R²、R³、R⁴、m、L和A如上面關(guān)于式I所定義的，

X為-O-或-NR¹²-；并且

R¹²為氫或烷基基團。

在某些實例中，R¹²為氫。在其他實例中，R¹²為烷基基團。例如，在一些實例中，R¹²可以為C₁-C₆烷基基團。在一些實例中，R¹²可以為C₁-C₄烷基基團。在某些實例中，R¹²可以為甲基或乙基。

在某些實例中，X為-O-。在其他實例中，X為-NH-或-N(CH₃)-。

在某些實例中，所述化合物由式IIA定義

其中X、R¹²、L和A如上面關(guān)于式II所定義的。

在某些實施方案中，化合物可為以下中的一個。

藥物制劑

也提供了包括本文所述的化合物的藥物制劑。藥物制劑可以包括治療有效量的本文所述的化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的結(jié)合。代表性的賦形劑包括溶劑、稀釋劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑、抗氧化劑、懸浮劑、潤濕劑、粘度調(diào)節(jié)劑、張力劑、穩(wěn)定劑和其組合。合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑優(yōu)選從由FDA通常公認為安全(GRAS)的材料中選擇，并且可以在不引起不需要的生物副作用或不希望的相互作用下被施用至個體。

在某些實例中，藥物制劑可以為脂質(zhì)體制劑。例如，本文提供了包括由囊泡形成脂質(zhì)形成的脂質(zhì)體的藥物制劑，并且本文所述的化合物被包埋在脂質(zhì)體中。包埋在脂質(zhì)體中的化合物可以被隔離在脂質(zhì)體中心的水性區(qū)室中、脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層之間的水性空間中、或脂質(zhì)體本身的雙層內(nèi)。

制劑中的脂質(zhì)體可以主要由囊泡形成脂質(zhì)構(gòu)成。此類囊泡形成脂質(zhì)是可以自發(fā)地在水中形成雙層囊泡的脂質(zhì)，如由磷脂所例證，其疏水部分與雙層膜的內(nèi)部的疏水區(qū)接觸，并且其頭基部分朝向膜的外部的極性表面定向。能夠穩(wěn)定并入脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)(諸如膽固醇和其各種類似物)也可以在脂質(zhì)體中使用。所述囊泡形成脂質(zhì)優(yōu)選具有通常為?；湹膬蓚€烴鏈和一個極性或非極性的頭基的脂質(zhì)。存在多種合成的囊泡形成脂質(zhì)和天然存在的囊泡形成脂質(zhì)，包括磷脂諸如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中兩個烴鏈的長度約為14-22個碳原子之間，并且具有不同程度的不飽和。上述具有不同飽和度的脂質(zhì)和磷脂的?；溈梢陨藤彨@得或根據(jù)公開的方法制備。其他合適的脂質(zhì)包括糖脂、腦苷脂和固醇，諸如膽固醇。

囊泡形成脂質(zhì)可以被選擇以實現(xiàn)指定程度的流動性或剛性，以控制脂質(zhì)體在血清中的穩(wěn)定性，和/或以控制脂質(zhì)體中的包埋劑的釋放速率。具有更剛性的脂質(zhì)雙層或凝膠相雙層的脂質(zhì)體，通過相對剛性的脂質(zhì)(例如具有相對高的相變溫度，例如高達60℃的脂質(zhì))的并入來實現(xiàn)。剛性的，即飽和的脂質(zhì)有助于提高脂質(zhì)雙層中的膜剛性。其他脂質(zhì)組分，諸如膽固醇，也已知有助于脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中的膜剛性。另一方面，脂質(zhì)流動性由并入相對的液體脂質(zhì)實現(xiàn)，通常是具有相對低的凝膠至液晶的相變溫度(例如，在室溫或低于室溫)的脂質(zhì)相的液體脂質(zhì)。

脂質(zhì)體可以任選地包括共價連接至親水性聚合物的囊泡形成脂質(zhì)。如已被描述的，例如在美國專利No.5,013,556中，包括在脂質(zhì)體組合物中的此種聚合物衍生的脂質(zhì)形成圍繞所述脂質(zhì)體的親水性聚合物鏈的表面覆層。當(dāng)與缺乏此種覆層的脂質(zhì)體相比時，親水性聚合物鏈的表面覆層能夠有效地增加脂質(zhì)體的體內(nèi)的血液循環(huán)壽命。由甲氧基(聚乙二醇)(mPEG)和磷脂酰乙醇胺構(gòu)成的聚合物衍生的脂質(zhì)(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或二油酰磷脂酰乙醇胺)可自Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,Ala.)以各種mPEG分子量(350、550、750、1,000、2,000、3,000和5,000道爾頓)獲得。mPEG-神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)聚合物還可以從Avanti Polar Lipids,Inc購買。脂質(zhì)-聚合物綴合物的制備也在文獻中描述，參加美國專利No.5,631,018、6,586,001和5,013,556；Zalipsky,S.等,Bioconjugate Chem.8:111(1997)；Zalipsky,S.等,Meth.Enzymol.387:50(2004)。這些脂質(zhì)聚合物可以如良好定義的具有最小的分子量分散度的高純度的均質(zhì)材料來制備(Zalipsky,S.等,Bioconjugate Chem.8:111(1997)；Wong,J.等,Science 275:820(1997))。所述脂質(zhì)聚合物也可以是“中性的”脂質(zhì)聚合物，諸如聚合物-二硬脂酰綴合物，如在美國專利No.6,586,001(其通過引用并入本文)中所述。

當(dāng)脂質(zhì)-聚合物綴合物被包含在脂質(zhì)體中時，通常1-20摩爾百分比之間的脂質(zhì)-聚合物綴合物被并入到總脂質(zhì)混合物中(參見，例如，美國專利No.5,013,556)。

如果需要用于特定的應(yīng)用中，脂質(zhì)體可以包括配體，諸如綴合到脂質(zhì)體的靶向配體。例如，脂質(zhì)體可以任選地包括修飾以包括配體的脂質(zhì)聚合物，形成脂質(zhì)-聚合物-配體綴合物，在本文中也稱為‘脂質(zhì)聚合物-配體綴合物’。所述配體可以是治療性分子，諸如在體內(nèi)具有活性的藥物或生物分子、診斷分子(諸如造影劑或生物分子)、或?qū)τ诮Y(jié)合配偶體(優(yōu)選細胞的表面上的結(jié)合配偶體)具有結(jié)合親和力的靶向分子。例如，配體可以對細胞表面具有結(jié)合親和力，以便促進脂質(zhì)體通過內(nèi)化進入細胞的細胞質(zhì)中。存在于包括此種脂質(zhì)聚合物-配體的脂質(zhì)體中的配體是從脂質(zhì)體表面向外定向，并因此可用于與它的同源受體相互作用。

用于將配體附接至脂質(zhì)聚合物的方法是已知的，其中所述聚合物可以官能化用于隨后與選擇的配體反應(yīng)。(美國專利No.6,180,134；Zalipsky,S.等,FEBS Lett.353:71(1994)；Zalipsky,S.等,Bioconjugate Chem.4:296(1993)；Zalipsky,S.等,J.Control.Rel.39:153(1996)；Zalipsky,S.等,Bioconjugate Chem.8(2):111(1997)；Zalipsky,S.等,Meth.Enzymol.387:50(2004))。官能化的聚合物-脂質(zhì)綴合物也可商購獲得，諸如末端官能化的PEG-脂質(zhì)綴合物(Avanti Polar Lipids,Inc.)。配體和聚合物之間的鍵可以是穩(wěn)定的共價鍵或響應(yīng)于刺激(諸如pH的變化或還原劑的存在下)裂解的可釋放的鍵。

所述配體可以是對于細胞受體或在血液中循環(huán)的病原體具有結(jié)合親和力的分子。所述配體也可以是治療劑或診斷分子，特別是當(dāng)以游離形式施用時具有短的血液循環(huán)壽命的分子。在一個實施方案中，配體是生物配體，諸如對細胞受體具有結(jié)合親和力的配體。生物配體實例包括對CD4、葉酸、胰島素、LDL、維生素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白、選擇蛋白(諸如E、L和P選擇蛋白)、Flk-1,2、FGF、EGF、整聯(lián)蛋白(α₄β₁α_vβ₃、α_vβ₁α_vβ₅、α_vβ₆整聯(lián)蛋白)、HER2和其他的受體具有結(jié)合親和力的分子。配體在本領(lǐng)域中是已知的，并且可以包括蛋白質(zhì)和肽，其包括抗體和抗體片段，諸如F(ab′)₂、F(ab)₂、Fab′、Fab、Fv(由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成的片段)和scFv(重組單鏈多肽分子，其中的輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽接頭連接)等。配體也可以是小分子肽模擬物。應(yīng)該理解，細胞表面受體或其片段可以充當(dāng)配體。靶向配體其他實例包括但不限于，維生素分子(例如，生物素、葉酸、氰鈷胺素)、寡肽、寡糖。其他的配體實例包括那些在美國專利No.6,214,388、6,316,024、6,056,973和6,043,094(其通過引用并入本文)中所述的配體。

包括本文所述的化合物的脂質(zhì)體制劑可以使用用于制備和/或裝載脂質(zhì)體的任何合適的方法形成。例如，本文所述的化合物和一種或多種囊泡形成脂質(zhì)可以溶解在合適的溶劑中，并且可以蒸發(fā)所述溶劑以形成脂質(zhì)膜。所述脂質(zhì)膜可與水溶液(例如，具有7-9的pH)水合，以形成包含包埋的化合物的脂質(zhì)體。

脂質(zhì)體形成后，脂質(zhì)體可以被設(shè)定尺寸以獲得具有基本上均勻的尺寸范圍的一組脂質(zhì)體，例如0.01至0.5微米的尺寸范圍(例如，0.03-0.40微米)。脂質(zhì)體可以通過任何合適的方法設(shè)定尺寸，諸如通過擠壓穿過具有所選的一致的孔徑尺寸的膜(例如，具有在0.03至0.2微米的范圍內(nèi)的所選的一致的孔徑尺寸的聚碳酸酯膜)。所述膜的孔徑尺寸大致對應(yīng)于通過擠壓穿過所述膜生產(chǎn)的脂質(zhì)體的最大尺寸，尤其當(dāng)擠壓穿過同一膜兩次或更多次制備時。均質(zhì)化方法也可以用于制備具有100nm或更小的尺寸的脂質(zhì)體(Martin,F.J.,Specialized Drug Delivery Systems—Manufacturing and Production Technology,P.Tyle,Ed.,Marcel Dekker,New York,267-316頁(1990))。

在一些實施方案中，制劑中的脂質(zhì)體可具有如通過動態(tài)光散射所測量的，50nm至250nm(例如，50nm至200nm、75nm至150nm、90nm至150nm、120nm至150nm、100nm至130nm或90nm至110nm)的平均顆粒尺寸。在一些實施方案中，制劑中的脂質(zhì)體可以具有-50mV至0mV(例如，-25mV至0mV、-15mV至0mV或-10mV至0mV)的ζ電位。

設(shè)定尺寸后，可以通過合適的技術(shù)(諸如透析、離心、切向流滲濾、尺寸排阻色譜或離子交換)去除未包封的化合物，以實現(xiàn)具有高濃度的包埋在脂質(zhì)體中的化合物并且在脂質(zhì)體外的溶液中幾乎沒有化合物的脂質(zhì)體懸浮液。脂質(zhì)體形成后，也可以通過滴定、透析等調(diào)節(jié)所述脂質(zhì)體的外相(如果需要)至適當(dāng)?shù)膒H。

一旦形成，可使用本領(lǐng)域中已知的方法凍干脂質(zhì)體懸浮液。所得的組合物可以是凍干粉末的形式。術(shù)語“凍干粉末”是指通過水性混合物的凍干獲得的任何固體材料。在一些實例中，凍干保護劑諸如蔗糖或海藻糖，可以在凍干之前加入到脂質(zhì)體制劑中。

可以在不同長度的儲存時間后通過結(jié)塊外觀的目視檢查、復(fù)溶時間和復(fù)溶的脂質(zhì)體的性質(zhì)來評估凍干制劑的穩(wěn)定性。在定量標準方面，脂質(zhì)體制劑可以由以下評估：通過目視檢查微粒的外觀或濁度、顏色變化、通過動態(tài)光散射在粒徑分析儀上的平均粒徑和多分散指數(shù)分析(例如，使用NICOMP370粒徑系統(tǒng))、ζ電位測量(例如，使用Malvern Instrument’s Zetasizer)、通過色譜法測量藥物包封的百分比(例如，通過在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色譜)、通過HPLC和通過LC-MS測量藥物物質(zhì)和賦形劑的化學(xué)完整性和分解產(chǎn)物的外觀。BTZ脂質(zhì)體制劑優(yōu)選的穩(wěn)定范圍為在4度儲存6個月后相對于立即復(fù)溶的樣品，其平均粒徑和藥物包封百分的變化比小于20％，藥物產(chǎn)品的化學(xué)分解小于5％。

凍干制劑在施用之前通過加入水性溶劑可以很容易地復(fù)溶。復(fù)溶溶劑可以適用于藥物施用(例如，腸胃外施用至受試者)。合適的復(fù)溶溶劑的實例包括但不限于，水、鹽水和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。

本文所述的脂質(zhì)體制劑可以與其他抗癌劑結(jié)合使用，所述抗癌劑包括各種化療劑，諸如阿糖胞苷、氟達拉濱、地西他濱、柔紅霉素和治療抗體，諸如利妥昔單抗、阿侖單抗、酪氨酸激酶抑制劑和具有抗癌活性的任何其他藥劑。另外，抗癌劑可以在相同的脂質(zhì)體制劑中作為硼酸劑共同配制。例如，柔紅霉素或阿糖胞苷可以以限定的藥物比率共同包封入脂質(zhì)體硼替佐米中。此類型的結(jié)合的可以以產(chǎn)生最佳的治療協(xié)同作用的比例介導(dǎo)治療組合的共同遞送。

使用方法

本文還提供了治療癌癥的方法。治療癌癥的方法可以包括給受試者施用治療有效量的本文所述的化合物或制劑。本文所述的化合物可充當(dāng)?shù)鞍酌阁w抑制物。蛋白酶體抑制物通過它們抑制細胞蛋白酶體活性的能力誘導(dǎo)細胞凋亡。更具體地，在真核細胞中，泛素-蛋白酶體途徑是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的蛋白降解的中心途徑。蛋白質(zhì)最初是通過附接至聚泛素鏈針對蛋白水解，并且然后被蛋白酶體迅速降解為小肽，并且釋放和再循環(huán)泛素。此協(xié)同的蛋白水解途徑依賴于泛素-綴合系統(tǒng)和26S蛋白酶體的協(xié)同活性。26S蛋白酶體是存在于真核生物的細胞核和細胞質(zhì)中大的(1,500-2,000kDa)多亞基復(fù)合物。此復(fù)合物的催化核心(稱為20S蛋白酶體)，是由含有α-和β-亞基的四個七聚環(huán)組成的圓柱形結(jié)構(gòu)。所述蛋白酶體是蘇氨酸蛋白酶體，提供親核體的β-亞基的N-末端的蘇氨酸攻擊靶蛋白肽鍵的羰基。至少三個不同的蛋白水解活性與蛋白酶體相關(guān)：糜蛋白酶、胰蛋白酶和肽谷氨酰。識別和結(jié)合聚泛素化底物的能力是通過結(jié)合到所述20S蛋白酶體的每個端部的19S(PA700)亞基所賦予的。這些輔助亞基展開底物并將其送入20S催化復(fù)合物中，同時去除附著的泛素分子。26S蛋白酶體的組裝和蛋白質(zhì)底物的降解都是是ATP依賴性的(Almond,Leukemia 16:433(2002))。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過蛋白質(zhì)的協(xié)同的和暫時的降解調(diào)節(jié)許多細胞過程。通過控制許多關(guān)鍵的細胞蛋白質(zhì)的水平，蛋白酶體作為細胞生長和凋亡以及破壞其活性的調(diào)節(jié)器對細胞周期有深刻的影響。例如，缺陷的細胞凋亡涉及若干疾病的發(fā)病機制，所述疾病包括某些癌癥諸如B細胞慢性淋巴細胞白血病，其中存在休眠腫瘤細胞的積累。

蛋白酶體抑制劑作為一類化合物一般通過抑制由蛋白酶體的蛋白降解起作用。此類化合物包括肽醛、肽乙烯砜，其通過結(jié)合并直接抑制蛋白酶體20S核心內(nèi)的活性位點起作用。然而，肽醛和肽乙烯砜以不可逆的方式與20S核心顆粒結(jié)合，使得在去除它們時蛋白水解活性也不能被恢復(fù)。相比之下，肽硼酸化合物諸如如本文所述的那些，賦予蛋白酶體穩(wěn)定的抑制作用，還可以從蛋白酶體緩慢地解離。所述肽硼酸化合物比它們的肽醛類似物更有效，更具體地在于，硼和硫之間的弱相互作用意味著肽硼酸鹽不抑制巰基蛋白酶(Richardson,P.G.,等,Cancer Control.10(5):361,(2003))。

多種來自腫瘤的細胞系暴露于蛋白酶抑制劑會引發(fā)細胞凋亡，可能是由于若干途徑(包括細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、p53和核因子κB(NF-κB))的影響(Grimm,L.M.和Osborne,B.A.,Results Probl.Cell.Differ.23:209-28(1999)；Orlowski,R.Z.,Cell Death Differ.6(4):303-13(1999))。很多記錄蛋白酶抑制劑介導(dǎo)的凋亡的最初的研究使用的是造血起源的細胞，包括原單核細胞(Imajoh-Ohmi,S.等,Biochem.Biophys.Res.Commun.217(3):1070-77(1995))、T細胞和淋巴細胞白血病細胞(Shinohara,K.等,Biochem.J.317(Pt 2):385-88,(1996))、淋巴瘤細胞(Tanimoto,Y.等,J.Biochem.(Tokyo)121(3):542-49(1997))和早幼粒細胞白血病細胞(Drexler,H.C.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(3):855-60(1997))。蛋白酶體抑制劑的體內(nèi)抗腫瘤活性的首次證明使用的是人淋巴瘤異種移植模型(Orlowski,R.Z.等,Cancer Res 58(19):4342-48(1998))。此外，蛋白酶體抑制劑據(jù)報道優(yōu)選誘導(dǎo)來自患者的淋巴瘤細胞(Orlowski,R.等Cancer.Res.,58:(19):4342(1998))和白血病細胞的凋亡(Masdehors,P.等,Br.J.Haematol.105(3):752-57(1999))，并且相對于備用的對照的非轉(zhuǎn)化細胞，優(yōu)選地抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖(Hideshima,T.等,Cancer Res.,61(7):3071-76(2001))。因此，蛋白酶體抑制劑作為治療劑在患有難醫(yī)治的血液惡性腫瘤的患者中特別有用。

在一個實施方案中，本文所述的化合物或制劑用于治療癌癥，并且更特別用于癌癥患者中的腫瘤治療。所述癌癥可以是腫瘤。所述癌癥也可以是胃癌、腎癌、骨癌、肝癌、腦癌、皮膚癌、口腔癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、腸癌、骨髓性白血病、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺濾泡癌、膀胱癌、骨髓增生異常綜合征、乳腺癌、低級星形細胞瘤、星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、髓母細胞瘤、腎癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌或成神經(jīng)母細胞瘤。

在某些實例中，所述癌癥可以是多發(fā)性骨髓瘤。多發(fā)性骨髓瘤是無法治愈的惡性腫瘤，其每年在美國約15,000人中診斷出(Richardson,P.G.等,Cancer Control.10(5):361(2003))。它是血液惡性腫瘤，其特征通常在于骨髓中多個位點的無性系漿細胞的積累。多數(shù)患者響應(yīng)于初始的化療和放療；然而，大多數(shù)由于抗性腫瘤細胞的增殖而最終復(fù)發(fā)。在一個實施方案中，提供了用于在受試者中治療多發(fā)性骨髓瘤的方法，其包括施用包含本文所述的化合物的脂質(zhì)體制劑。

在某些實例中，所述癌癥可以是乳腺癌。本文所述的化合物和制劑可以通過幫助克服一些癌細胞抵抗化療作用的主要途徑而在乳腺癌的治療中有效。例如，通過凋亡的調(diào)節(jié)子NF-kB和P44/42絲裂原活化蛋白激酶途徑的信號可以抗凋亡。由于蛋白酶體抑制劑可以阻斷這些途徑，所述化合物就能夠激活細胞凋亡。因此，在一個實施方案中，提供了用于在受試者中治療乳腺癌的方法，其包括施用包含本文所述的化合物的脂質(zhì)體制劑。此外，由于化療劑諸如紫杉烷類和蒽環(huán)類已經(jīng)顯示出激活這些途徑中的一個或兩個，那么蛋白酶體抑制劑結(jié)合常規(guī)化療劑的使用可以用來增強藥物(諸如紫杉醇和多柔比星)的抗腫瘤活性。因此，在另一實施方案中，提供的是治療癌癥的方法，其中以游離形式或以脂質(zhì)體包埋形式的化療劑與本文所述的化合物或制劑結(jié)合施用。

對于本文所述的化合物和制劑的劑量和給藥方案將取決于被治療的癌癥、癌癥的階段、患者的體重和健康以及其他對主治的醫(yī)學(xué)護理人員顯而易見的因素?？梢允褂玫鞍酌阁w抑制劑硼替佐米Pyz-Phe-boroLeu(PS-341)的臨床研究來為選擇合適的劑量和給藥方案提供指導(dǎo)。例如，靜脈內(nèi)給藥每周一次或兩次，實體瘤患者的最大耐受劑量為1.3mg/m²(Orlowski,R.Z.等,Breast Cancer Res.5:1-7(2003))。在另一研究中，硼替佐米在3周周期內(nèi)的1、4、8和11天以靜脈內(nèi)團注給藥，建議的最大耐受劑量為1.56mg/m²(Vorhees,P.M.等,Clinical Cancer Res.9:6316(2003))。然而，由于脂質(zhì)體BTZ比游離的BTZ毒性小，脂質(zhì)體藥物的最佳臨床劑量可以高出數(shù)倍。

施用

本文所述的化合物和制劑可以胃腸外施用(例如，通過靜脈內(nèi)施用或皮下施用)。應(yīng)當(dāng)理解，所述制劑可以包括任何必要的或所需的藥物賦形劑以促進遞送。本文所述的化合物和制劑也可以通過經(jīng)口途徑施用，通過腹膜內(nèi)注射(i.p.injection)、肌內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射以及作為微粉化的固體或液體氣霧劑通過氣道施用。

關(guān)于本文所述的化合物的術(shù)語“施用”及其變體(例如“施用”化合物)意指將化合物或其制劑引入到需要治療的受試者的系統(tǒng)中。當(dāng)將本文所述的化合物或其制劑與一種或多種其他活性劑(例如，細胞毒性劑)結(jié)合提供時，“施用”及其變體應(yīng)各自理解成包括所述化合物或其制劑與其他藥劑的同時和/或相繼引入。

公開的化合物和含有它們的制劑的體內(nèi)應(yīng)用可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員目前或預(yù)期已知的任何合適的方法和技術(shù)來完成。例如，所公開的化合物可以以生理上或藥學(xué)上可接受的形式配制，并且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的途徑施用，例如口腔、鼻腔、直腸、局部和腸胃外施用途徑。如本文所用，術(shù)語腸胃外包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)和胸骨內(nèi)施用，諸如通過注射。所公開的化合物或制劑的施用可以是單次施用，或者在可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定的連續(xù)的或不同的時間間隔施用。

本文所公開的化合物和包含它們的制劑，還可以利用脂質(zhì)體技術(shù)、緩釋膠囊、可植入泵和可生物降解的容器施用。這些遞送方法可以有利地在較長一段的時間內(nèi)提供一致的劑量。所述化合物也可以以它們的鹽衍生物形式或晶態(tài)形式施用。

本文公開的化合物可以根據(jù)已知的用于制備藥學(xué)上可接受的組合物的方法來配制。配方在領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且容易得到多個來源中詳細描述。例如，E.W.Martin(1995)的Remington’s Pharmaceutical Science描述了可以與所公開的方法結(jié)合使用的配方。一般來講，可以配制本文所公開的化合物，使得有效量的所述化合物為了促進化合物的有效施用而與合適的載體結(jié)合。所用的制劑也可以呈多種形式。其包括例如，固體、半固體和液體劑型，諸如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液或懸浮液、栓劑、可注射的和可輸注的溶液以及噴霧劑。優(yōu)選形式取決于意圖施用的模式和治療應(yīng)用。所述制劑也優(yōu)選包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑。與化合物一起使用的載體或稀釋劑的實例包括乙醇、二甲基亞砜、甘油、氧化鋁、淀粉、鹽水和等效的載體和稀釋劑。為了提供所需治療性處理的施用劑量，本文所公開的組合物可以有利地包括按重量計基于包括載體或稀釋劑的總制劑的重量的約0.1％和99％，并且尤其是1％和15％之間的一種或多種目標化合物的總量。

適用于施用的制劑包括例如，水性的無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和致使制劑與預(yù)定接受者的血液等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無菌混懸液，其可包括助懸劑和增稠劑。制劑可被呈現(xiàn)于單劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以儲存在冷凍干燥(凍干)的條件下，僅需使用前的無菌液體載體(例如注射用水)條件。臨時注射溶液和混懸液可由無菌粉末、顆粒和片劑等制備。應(yīng)理解，除以上特別提到的成分之外，本文所述的組合物可以包括與所討論制劑類型有關(guān)的本領(lǐng)域常見的其他藥劑。

對于腫瘤病癥的治療，本文所公開的化合物可以與其他抗腫瘤或抗癌物質(zhì)和/或放療和/或光動力療法和/或外科治療結(jié)合施用至需要治療的患者中以去除腫瘤。這些其他物質(zhì)或治療可以與本文所公開的化合物同時給予或在不同時間下給予。例如，本文所公開的化合物可以與有絲分裂抑制劑結(jié)合使用，諸如紫杉酚或長春堿，烷基化劑諸如環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺，抗代謝物諸如5-氟尿嘧啶或羥基脲，DNA嵌入劑諸如多柔比星或博來霉素，拓撲異構(gòu)酶抑制劑諸如依托泊苷或喜樹堿，抗血管生成劑諸如血管抑素，抗雌激素諸如他莫昔芬，和/或其他抗癌藥物或抗體諸如，分別例如GLEEVEC(Novartis Pharmaceuticals Corporation)和HERCEPTIN(Genentech,Inc.)。

許多腫瘤和癌癥具有病毒基因組，存在于腫瘤或癌細胞中。例如，Epstein-Barr病毒(EBV)與多個哺乳動物惡性腫瘤相關(guān)。本文所公開的化合物也可以單獨使用或與抗癌劑或抗病毒劑諸如更昔洛韋、齊多夫定(AZT)、拉米夫定(3TC)等結(jié)合使用以治療感染會導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化的病毒的患者，和/或治療具有與細胞中病毒基因組的存在相關(guān)的腫瘤或癌癥的患者。本文所公開的化合物也可以結(jié)合腫瘤學(xué)疾病基于病毒的治療使用。例如，所述化合物可以與突變型單純皰疹病毒在非小細胞肺癌的治療中使用(Toyoizumi,等,“Combined therapy with chemotherapeutic agents and herpes simplex virus type IICP34.5mutant(HSV-1716)in human non-small cell lung cancer,”Human Gene Therapy,1999,10(18):17)。

含有它們的化合物和制劑的治療性應(yīng)用可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員目前或預(yù)期已知的任何合適的方法和技術(shù)來完成。另外，本文所公開的化合物和組合物具有作為用于制備其他有用的化合物和組合物的起始原料或中間體的用途。

本文所公開的化合物和制劑可以在一個或多個解剖位點諸如不希望的細胞生長的位點局部施用(諸如腫瘤位點或良性皮膚生長，例如注射或局部施加至腫瘤或皮膚生長)，任選地與藥學(xué)上可接受的載體諸如惰性稀釋劑結(jié)合。本文所公開的化合物和制劑可以全身施用諸如靜脈內(nèi)或經(jīng)口，任選地與藥學(xué)上可接受的載體諸如惰性稀釋劑或用于經(jīng)口遞送的可同化可食用的載體結(jié)合。它們可封閉在硬殼或軟殼明膠膠囊中，可壓制成片劑，或可直接與患者膳食的食物合并。對于經(jīng)口的治療性施用，活性化合物可與一種或多種賦形劑結(jié)合并且以可攝取片劑、經(jīng)頰片劑、錠劑、膠囊、酏劑、混懸液、糖漿、粉片、噴霧劑等形式使用。

片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可含有以下：粘合劑，諸如黃蓍樹膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩解劑，諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；以及甜味劑，諸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜(aspartame)或可添加調(diào)味劑，諸如胡椒薄荷、冬青油或櫻桃香精。當(dāng)單位劑型是膠囊時，除以上類型的材料之外，它可以含有液體載體諸如植物油或聚乙二醇。各種其他材料可作為包衣呈現(xiàn)或以其他方式修改固體單位劑型的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可用明膠、蠟、蟲膠或糖等包覆。糖漿或酏劑可以含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或果糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料和調(diào)味劑諸如櫻桃或甜橙香精。當(dāng)然，用于制備任何單位劑型的任何材料都應(yīng)為藥學(xué)上可接受的并且在所用量下大致上無毒。另外，活性化合物可并入持續(xù)釋放制劑和裝置中。

本文所公開的化合物和制劑，包括藥學(xué)上可接受的其鹽、水合物或其類似物，可以通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)輸注或注射施用?；钚曰衔锘蚱潲}的溶液可以在水中制備，任選與無毒表面活性劑混合。還可以在甘油、液體聚乙二醇、三乙酸甘油酯和其混合物中以及油中制備分散液。在普通儲存和使用條件下，這些制備可以含有防腐劑以預(yù)防微生物生長。

適用于注射或輸注的藥物劑型可包括無菌水溶液或分散液或任選地包封于脂質(zhì)體中的包含活性成分的無菌粉末，所述活性成分適合于臨時制備無菌可注射或可輸注溶液或分散液。最終劑型在制造和存儲條件下應(yīng)該是無菌的、液體的和穩(wěn)定的。液體載體或媒介物可為溶劑或液體的分散介質(zhì)，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、植物油、無毒甘油酯及其適合的混合物?？衫缤ㄟ^形成脂質(zhì)體、在分散液的情況下維持所需粒度或使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｈ芜x地，可以通過各種其他抗菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)來實現(xiàn)對微生物活動的預(yù)防。在許多情況下，將優(yōu)選的是包括等滲劑，例如糖、緩沖劑或氯化鈉?？梢酝ㄟ^使用延緩吸收的藥劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)可注射的組合物的延長吸收。

通過將在適當(dāng)?shù)娜軇┲械乃枇康谋締査_的化合物和/或藥劑與如上列舉的各種其他成分(根據(jù)需要)合并，接著過濾滅菌來制備無菌注射液。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù)產(chǎn)生活性成分外加存在于先前無菌過濾溶液中的任何額外所需成分的粉末。

對于局部施用，本文所公開的化合物和藥劑可以以液體或固體施加。然而，通常將需要的是將它們與皮膚病學(xué)上可接受的載體(可為固體或液體)結(jié)合作為制劑局部施用至皮膚。本文所公開的化合物和藥劑和制劑可局部施加到受試者的皮膚以減少惡性或良性生長的大小(并且可以包括完全去除)，或治療感染部位。本文所公開的化合物和藥劑和制劑可直接施加到生長或感染部位。優(yōu)選地，所述化合物和藥劑以制劑形式(諸如軟膏、乳膏、洗劑、溶液、酊劑等)被施加到生長或感染部位。也可以使用用于遞送藥物物質(zhì)至真皮病變部位的藥物遞送系統(tǒng)，如在美國專利No.5,167,649中所述。

可用的固體載體包括精細分散的固體，諸如滑石、粘土、微晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁等?？捎玫囊后w載體包括水、醇或二醇或水-醇/二醇摻合物，其中所述化合物可任選地借助于無毒表面活性劑在有效水平下溶解或分散于所述載體中?？商砑又T如芳香劑和額外抗微生物劑的佐劑以最優(yōu)化給定用途的性質(zhì)。所得的液體組合物可通過用于浸漬繃帶和其他敷料的吸收墊施加，或使用例如泵型噴霧器或氣霧劑噴霧器噴射于受影響的區(qū)域上。

諸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯類、脂肪醇、改性纖維素或改性礦物質(zhì)的增稠劑也可與液態(tài)載體一起使用，以形成用于直接向使用者的皮膚應(yīng)用的可涂抹的糊劑、凝膠劑、軟膏劑、皂劑等?？捎糜谶f送化合物到皮膚的由于的皮膚病學(xué)組合物的實例在美國專利No.4,608,392、美國專利No.4,992,478、美國專利No.4,559,157和美國專利No.4,820,508中公開。

本文所公開的化合物和藥劑和藥物制劑的可用劑量可通過比較它們的體外活性和在動物模型中的體內(nèi)活性來確定。用于將小鼠和其他動物中的有效劑量外推至人的方法為本領(lǐng)域所已知；例如參見美國專利No.4,938,949。

還公開了包含本文所公開的化合物與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的藥物組合物。適合于經(jīng)口、局部或腸胃外施用，包含一定量的化合物的藥物組合物構(gòu)成了優(yōu)選的方面。施用給患者特別是人的劑量，應(yīng)該足以實現(xiàn)在合理的時間框架內(nèi)在患者中有治療反應(yīng)，無致死毒性，并且優(yōu)選僅引起可接受水平的副作用或發(fā)病率。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，劑量將取決于多種因素，包括受試者的狀況(健康)、受試者的體重、并行治療的種類(如果有的話)、治療的頻率、治療比以及病理病狀的嚴重程度和階段。

對于腫瘤病癥的治療，本文所公開的化合物和藥劑和組合物可以在其他抗腫瘤劑或抗癌劑或物質(zhì)(例如，化療劑、免疫治療劑、放療劑、細胞毒性劑等)和/或與放射治療和/或外科手術(shù)治療之前、之后、或相結(jié)合施用至需要治療的患者以去除腫瘤。例如，本文所公開的化合物和藥劑和組合物可以在治療癌癥的方法中使用，其中患者需要、正在或已經(jīng)使用有絲分裂抑制劑治療，所述有絲分裂抑制劑諸如紫杉酚或長春堿，烷基化劑諸如環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺，抗代謝物諸如5-氟尿嘧啶或羥基脲，DNA嵌入劑諸如多柔比星或博來霉素，拓撲異構(gòu)酶抑制劑諸如依托泊苷或喜樹堿，抗血管生成劑諸如血管抑素，抗雌激素諸如他莫昔芬，和/或其他抗癌藥物或抗體諸如，分別例如GLEEVEC(Novartis Pharmaceuticals Corporation；East Hanover,NJ)和HERCEPTIN(Genentech,Inc.；South San Francisco,CA)。這些其他物質(zhì)或放射治療可以與本文所公開的化合物同時給予或在不同時間下給予。其他合適的化療劑的實例包括但不限于，六甲蜜胺、博來霉素、硼替佐米(VELCADE)、白消安、亞葉酸鈣、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、克立他酶(crisantaspase)、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、更生霉素、柔紅霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表多柔比星、依托泊苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉非替尼(IRESSA)、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼(GLEEVEC)、伊立替康、脂質(zhì)體多柔比星、洛莫司汀、美法侖、巰嘌呤、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇，噴司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、鏈佐星、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、噻替派、硫鳥嘌呤(tioguanine/thioguanine)、拓撲替康、蘇消安、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱。在例證的實施方案中，化療劑為美法侖。合適的免疫治療劑的實例包括但不限于，阿來組單抗、西妥昔單抗(ERBITUX)、吉妥珠單抗、碘131托西莫單抗、利妥昔單抗、曲妥珠單抗(HERCEPTIN)。細胞毒性劑包括例如，放射性同位素(例如，I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、P³²等)和細菌、真菌、植物或動物來源的毒素(例如，蓖麻毒素、肉毒桿菌毒素、炭疽毒素、黃曲霉毒素、水母毒液(例如，箱水母等)也公開了用于治療腫瘤病癥的方法，其包括在施用化療劑、免疫治療劑、放療劑或放療之前、之后、或相結(jié)合施用有效量的本文所公開的化合物和/或試劑。

試劑盒

所公開的主題還涉及封裝的劑量制劑，其在一個或多個容器中包含至少一種抑制劑化合物或本文所公開的組合物，例如，式I中的任何化合物。封裝的劑量制劑可任選地在一個或多個容器中包含藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。

取決于待治療的病癥或疾病情況的合適的劑量可以是將會減少靶細胞的增殖或生長的量。在癌癥的情形下，合適的劑量是將會在癌組織諸如惡性腫瘤中導(dǎo)致活性劑的濃縮的量，已知所述癌組織可以實現(xiàn)所需的響應(yīng)。優(yōu)選的劑量是導(dǎo)致癌細胞生長的最大抑制且沒有難以處理的副作用的量。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定的，化合物和/或藥劑的施用可以是連續(xù)的或在不同的時間間隔施用。

為了提供所需治療性處理的施用劑量，在一些實施方案中，本文所公開的藥物組合物可以包括按重量計基于包括載體或稀釋劑的總組合物的重量的約0.1％和45％，并且尤其是1％和15％之間的一種或多種所述化合物的總量。舉例來說，所施用的活性成分的劑量水平可以是：靜脈內(nèi)，0.01至約20mg/kg；腹膜內(nèi)，0.01至約100mg/kg；皮下，0.01至約100mg/kg；肌內(nèi)，0.01至約100mg/kg；經(jīng)口，0.01至約100mg/kg；動物(身體)的重量。在一些實施方案中，所施用的活性成分的劑量水平可以是：靜脈內(nèi)，0.01至約2.5mg/kg；腹膜內(nèi)，0.01至約5mg/kg；皮下，0.01至約5mg/kg；肌內(nèi)，0.01至約5mg/kg；經(jīng)口，0.01至約5mg/kg；動物(身體)的重量。在一些實施方案中，所施用的活性成分的劑量水平可以是：靜脈內(nèi)，0.01至約1mg/kg；腹膜內(nèi)，0.01至約5mg/kg；皮下，0.01至約5mg/kg；肌內(nèi)，0.01至約5mg/kg；經(jīng)口，0.01至約5mg/kg；動物(身體)的重量。在某些實施方案中，所施用的活性成分的劑量水平可以是：靜脈內(nèi)，0.01至約0.5mg/kg；腹膜內(nèi)，0.01至約1mg/kg；皮下，0.01至約1mg/kg；肌內(nèi)，0.01至約1mg/kg；經(jīng)口，0.01至約1mg/kg；動物(身體)的重量。

也公開了包含在一個或多個容器包含本文所公開的化合物的組合物的試劑盒。所公開的試劑盒可任選地包括藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。在一個實施方案中，試劑盒包括如本文所述的一種或多種其他組分、助劑或佐劑。在其他實施方案中，試劑盒包括一種或多種抗癌劑，諸如本文所述的那些藥劑。在一個實施方案中，試劑盒包括描述如何施用試劑盒的化合物或組合物的說明書或包裝材料。試劑盒的容器可以是任何合適的材料，例如玻璃、塑料、金屬等，并且可以是任何合適的尺寸、形狀或構(gòu)造。在一個實施方案中，本文所公開的化合物和/或藥劑以固體諸如片劑、丸劑或粉末形式被提供在試劑盒中。在其他實施方案中，本文所公開的化合物和/或藥劑以液體或溶液被提供在試劑盒中。在一個實施方案中，試劑盒包括含有本文所公開的以液體或溶液形式的化合物和/或藥劑的安瓿或注射器。

通過非限制性說明的方式，本公開的某些實例的實例在下面給出。

實施例

以下實施例列出在下文中，以示出根據(jù)所公開主題的方法、組合物和結(jié)果。這些實施例并不意圖包括本文所公開主題的所有方面，而是示出代表性方法、組合物和結(jié)果。這些實施例并不意圖排除本發(fā)明的等效物和變體，這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見。

已經(jīng)努力確保關(guān)于數(shù)值(例如量、溫度等)的準確性，但對一些誤差和偏差應(yīng)予以說明。除非另外指出，否則份數(shù)是重量份，溫度是以℃為單位或環(huán)境溫度，并且壓力等于或接近大氣壓。反應(yīng)條件有多個變化和組合，例如，組分濃度、溫度、壓力和可用于優(yōu)化由所述的工藝獲得的產(chǎn)物純度和產(chǎn)率的其他反應(yīng)范圍和條件。優(yōu)化這些處理條件僅僅需要合理和常規(guī)的實驗。

實施例1.BTZ-OMG的制備、配方和評估

BTZ-油酰葡甲胺(BTZ-OMG)的親脂性酯的合成

葡甲胺與油酰氯以1:1的摩爾比進行反應(yīng)，產(chǎn)生N-甲基-N((4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥己基)油酰胺(OMG)(方案1)。然后將OMG偶聯(lián)至BTZ以產(chǎn)生BTZ-OMG(方案1)。

BTZ-OMG脂質(zhì)體制劑的制備

L-α-磷脂酰膽堿(卵PC)、膽固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)綴合的聚乙二醇(PEG)(mPEG-DSPE)和BTZ-OMG以40:38:2:20的摩爾比溶解在氯仿中。施加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以形成干燥的脂質(zhì)膜，然后用乙酸鈣緩沖液在pH為8下水合。使用擠壓以減少脂質(zhì)體的尺寸至150nm或更小。然后通過在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色譜法去除任何剩余的未包封藥物。最終，無菌過濾并凍干所述脂質(zhì)體。

在一些實例中，脂質(zhì)體在pH 8下制得，在10％蔗糖作為凍干保護劑的存在下凍干，并且在使用前不久復(fù)溶。

方案1.BTZ-OMG的結(jié)構(gòu)和合成。

BTZ-OMG脂質(zhì)體制劑的表征

通過動態(tài)光散射在NICOMP亞微米粒徑儀模型370上確定脂質(zhì)體的粒徑分布。用1:9甲醇萃取Sepharose CL-4B柱的級分后，包封效率通過UV-可見分光光度計檢測為在270nm處的OD(圖1)。取450nm處未經(jīng)甲醇萃取的OD為參考測量值(圖1)。然后，計算在脂質(zhì)體級分中藥物含量的總量與總藥物級分的比。在本實施例中，獲得了41％的藥物包埋。

另外，凍干一批未去除游離藥物的所述脂質(zhì)體。再水合后取裝載效率，并且凍干和未凍干的裝載結(jié)果似乎相同。這表明，BTZ-OMG的脂質(zhì)體制劑在凍干過程中保持穩(wěn)定。

實施例2.BTZ-OGA的制備

制備BTZ-OGA所使用的合成方法學(xué)在方案2中描述。簡單來說，油葡糖胺(OGA)由葡萄糖、油胺和氰基硼氫化鈉使用Borch型還原性胺化合成。然后將OGA偶聯(lián)至BTZ，得到BTZ-OGA(方案2)。D-葡萄糖和油胺以1:1的摩爾比在叔丁醇中共溶解并攪拌24小時。接著，在冰浴中將混合物冷卻到0℃，并且加入等摩爾的NaCNBH₄并連續(xù)攪拌直到氫氣逸出消失。通過滴加濃HCl將混合物酸化至pH為2-3。通過離心分離以HCl鹽形式沉淀的產(chǎn)物，并且用冰水洗滌。

BTZ-OGA脂質(zhì)體制劑的制備

卵L-α-磷脂酰膽堿(卵PC)、膽固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)綴合的聚乙二醇(PEG)(mPEG-DSPE)和BTZ-OGA以40:36:4:20的摩爾比溶解在氯仿中。施加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以形成干燥的脂質(zhì)膜，然后用50mM的乙酸鈣緩沖液和10％的乳糖在pH為8.5下水合。使用擠壓以減少脂質(zhì)體的尺寸至150nm或更小。然后通過在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色譜法去除任何剩余的未包封藥物。最終，無菌過濾并凍干所述脂質(zhì)體。

BTZ-OGA脂質(zhì)體制劑的表征

通過動態(tài)光散射在NICOMP亞微米粒徑儀模型370上確定脂質(zhì)體的粒徑分布。用1:9甲醇溶解從Sepharose CL-4B柱收集的級分后，包封效率通過UV-vis分光光度計檢測為在270nm處的OD值。也取在450nm處未經(jīng)甲醇溶解的OD為參考測量。然后，計算在脂質(zhì)體級分中藥物含量的總量與總藥物級分的比。在本實施例中，獲得了131.5nm的脂質(zhì)體粒徑和61％的藥物包埋。

方案2.BTZ-OGA的結(jié)構(gòu)和合成。

實施例3.BTZ-MEGA-12的制備、配方和評估

也研究了基于MEGA-12的脂質(zhì)體制劑。MEGA-12和BTZ-MEGA-12的結(jié)構(gòu)，以及制備BTZ-MEGA-12的策略示于方案3中。

BTZ-MEGA-12的合成

MEGA-12和BTZ以2:1的摩爾比在叔丁醇中共溶解。通過在室溫下連續(xù)攪拌過夜實現(xiàn)反應(yīng)。

BTZ-MEGA-12脂質(zhì)體制劑的制備

卵L-α-磷脂酰膽堿(卵PC)、膽固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)綴合的聚乙二醇(PEG)(mPEG-DSPE)和BTZ-MEGA-12以40:38:2:20的摩爾比溶解在氯仿中。施加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以形成干燥的脂質(zhì)膜，然后用50mM的乙酸鈣緩沖液和具有10％乳糖的5mM的磷酸鈉緩沖液在pH為8下水合。使用擠壓以減少脂質(zhì)體的尺寸至150nm或更小。然后通過在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色譜法去除任何剩余的未包封藥物。最終，無菌過濾并凍干所述脂質(zhì)體。

脂質(zhì)體裝載的優(yōu)化

使用50mM乙酸鈉和5mM磷酸鈉作為水合緩沖液從pH 6至pH 10檢測水合pH對MEGA-12脂質(zhì)體制劑裝載效率的影響。結(jié)果在圖2中繪出。本研究證明藥物裝載在pH 8時最大。然而，pH的依賴性有限，其中在所有測試的pH下裝載效率始終在78％-82％的范圍內(nèi)，在pH 8下81.6％是最高裝載。

根據(jù)上述的方法，通過UV-vis研究脂質(zhì)體制劑中的BTZ-MEGA-12的包封效率。結(jié)果表明，獲得了～81.6％的藥物包埋。

方案3.BTZ-MEGA-12的結(jié)構(gòu)和合成。

脂質(zhì)體裝載的優(yōu)化

使用50mM乙酸鈉和5mM磷酸鈉作為水合緩沖液從pH 6至pH 10檢測水合pH對MEGA-12脂質(zhì)體制劑裝載效率的影響。結(jié)果在圖2中繪出。本研究證明藥物裝載在pH 8下最大。然而，pH的依賴性有限，其中在所有測試的pH下裝載效率始終在78％-82％的范圍內(nèi)，伴隨在pH 8下的81.6％是最高裝載。

根據(jù)上述的方法，通過UV-vis研究脂質(zhì)體制劑中的BTZ-MEGA-12的包封效率。結(jié)果表明，獲得了高達81.6％的藥物包埋(圖3)。

實施例4.BTZ-葡糖醇-DPPE的制備

葡糖醇-DPPE和BTZ-葡糖醇-DPPE的結(jié)構(gòu)，以及制備BTZ-葡糖醇-DPPE的策略示于方案4中。

BTZ-葡糖醇-DPPE的合成

葡糖醇-DPPE和BTZ以2:1的摩爾比在氯仿/叔丁醇/H₂O(5:4:1)中攪拌。通過在室溫下連續(xù)攪拌過夜實現(xiàn)反應(yīng)。

BTZ-葡糖醇-DPPE脂質(zhì)體制劑的制備

卵PC、膽固醇、mPEG-DSPE和BTZ-葡糖醇-DPPE以40:38:2:20的摩爾比溶解在氯仿中。施加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以形成干燥的脂質(zhì)膜，然后用50mM的乙酸鈉緩沖液和具有10％乳糖的10mM甘氨酸在pH為8.5下水合。使用擠壓以減少脂質(zhì)體的尺寸至150nm或更小。然后通過在Sepharose CL-4B柱上的尺寸排阻色譜法去除任何剩余的未包封藥物。最終，無菌過濾并凍干所述脂質(zhì)體。

脂質(zhì)體制劑的表征

通過動態(tài)光散射在NICOMP亞微米粒徑儀模型370上測定脂質(zhì)體粒徑分布。用1:9甲醇溶解Sepharose CL-4B柱的級分后，包封效率通過UV-vis分光光度計檢測為在270nm下的OD。取在450nm處未經(jīng)甲醇萃取的OD為參考測量值。然后，計算在脂質(zhì)體級分中藥物含量的總量與總藥物級分的比。在本實施例中，獲得了97.3nm的脂質(zhì)體粒徑。

方案4.BTZ-葡糖醇-DPPE的結(jié)構(gòu)和合成。

實施例5.BTZ-MEGA-CHOL的制備、配方和評估

3β-[N-(甲葡糖胺)氨基甲酰]膽固醇(MEGA-CHOL)和BTZ-MEGA-CHOL的結(jié)構(gòu)，以及制備BTZ-MEGA-CHOL的策略示于方案5中。

MEGA-CHOL的制備

將氯甲酸膽固醇酯(Cholesteryl chloroformate)(2.70g)和9mL CHCl₃加入到25mL圓底燒瓶中。接著，加入于8mL DMSO中的葡甲胺(1.74g)和三乙胺(240μm)。將混合物在室溫下攪拌12小時。通過TLC和HPLC監(jiān)測反應(yīng)。然后將混合物倒入水中。將沉淀物過濾并用水洗滌以得到呈無色固體的粗MEGA-CHOL。通過在硅膠上的柱色譜法使用甲醇和氯仿(1:2v/v)純化粗產(chǎn)物。產(chǎn)物通過薄層色譜法分析并且具有0.50的R_f(甲醇:氯仿，1:2，v/v)。另外，通過¹H NMR(CDCl₃)表征所述產(chǎn)物，并且顯示出下列峰：0.68(s,2H,HC)；0.88-1.12(m,12H,-CH₃)；1.27(s,1H,HC(環(huán)))；1.63(m,12H,-CH₂(側(cè)鏈))；1.88-2.01(m,3H,HC(環(huán)))；2.35(m,2H,HC(環(huán)))；2.62(s,7H,葡甲胺H)；2.97(s,2H,CH₂),3.82(m,6H,葡甲胺H)；4.48(s,1H,H-C-C-O)；5.39(s,1H,,H-C＝C)。最終，也通過HPLC(使用Thermo Finnigan Surveyor HPLC系統(tǒng))分析所述產(chǎn)物。

方案5.BTZ-MEGA-CHOL的結(jié)構(gòu)和合成。

BTZ-MEGA-CHOL的制備

通過將BTZ與MEGA-CHOL在叔丁醇中在室溫下合并，并凍干混合物制備BTZ-MEGA-CHOL。¹H NMR(CDCl₃)：0.68(s,6H,HC)；0.88-1.12(m,30H,-CH₃)；1.26-1.48(s,14H(烷基BTZ))；1.61(m,10H,-CH₂(側(cè)鏈))；1.84-2.43(m,10H,HC(環(huán)))；2.62(s,7H,葡甲胺H)；2.97(s,4H,CH2)，3.20(s,2H,BTZ苯環(huán)綴合的CH₂)，3.80-3.96(m,10H,葡甲胺H)；4.45(s,1H,H-C-C-O)；5.37(s,1H,,H-C＝C)，7.20(m,5H,苯環(huán)，被CHCl₃溶劑峰重疊)；8.54-9.35(s,3H,BTZ吡嗪環(huán))。

另選地，BTZ-MEGA-CHOL在氯仿中使用2x過量的MEGA-CHOL在室溫下合成，并且以連續(xù)工藝摻入脂質(zhì)體中。對于所述連續(xù)工藝，BTZ和MEGA-CHOL以1:2的摩爾比溶解在氯仿中并在室溫下孵育過夜。所得復(fù)合物BTZ-MEGA-CHOL以50mg/ml溶解在氯仿中，所述氯仿具有氫化L-α-磷脂酰膽堿(大豆PC；HSPC)、膽固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)綴合的聚乙二醇(PEG₂₀₀₀)(PEG₂₀₀₀-DSPE)(摩爾比20:40:36:4)。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)在圓底燒瓶中形成干燥的脂質(zhì)膜，然后另外通過真空干燥2小時。使用含有50mM乙酸鈉和10mM甘氨酸的緩沖液在pH 8下以50mg/ml的脂質(zhì)濃度水合所述膜。然后施加超聲處理以減少粒徑至200nm或更小。接著，將樣品裝載到Sepharose CL-4B柱上以去除游離BTZ。收集含有L-BTZ的級分，并加入10％蔗糖。隨后將所述產(chǎn)物通過0.22μm膜過濾器過濾并凍干。

如上所述，通過UV-vis研究藥物的包封效率。具體地，將凍干的前藥BTZ-MEGA-CHOL在ddH₂O中復(fù)溶并裝載到Sepharose CL-4B柱上，并且以每級分1mL收集洗脫液。通過UV-vis分光光度法分析每種級分。圖4顯示了BTZ-MEGA-CHOL的歸一化結(jié)果(例如，Y軸是減去對照的吸光度值后每個級分的吸光度)。獲得了80.11％的藥物包埋效率。

凍干的BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑的評估

評估凍干的BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑的膠體穩(wěn)定性。將凍干的BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑儲存在室溫下并且隨時間監(jiān)測。在28周期間以不同的時間間隔，將凍干的BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑重新水合，并且如上所述測量粒徑。結(jié)果在圖5中繪出。所示的結(jié)果為3個獨立實驗的平均值，并且誤差條代表標準偏差。

也通過低溫透射電子顯微術(shù)(Cryo-TEM)評價凍干的BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑。將含有凍干的包括BTZ-MEGA-CHOL的脂質(zhì)體的一滴樣品在恒定的濕度和25℃的溫度下加入到受控環(huán)境玻璃化系統(tǒng)中的每個輝光放電多孔碳/弗姆瓦膜包覆的網(wǎng)格中。將樣品吸干后，并且通過立即浸入到液體乙烷漿浴中將樣品玻璃化。制備的網(wǎng)格儲存在液氮溫度下直到轉(zhuǎn)移至在-172℃下操作的Gatan低溫支架(cryo-holder)，并且以低劑量模式使用配備有bioTWIN光學(xué)器件的FEI Tecnai G2Spirit TEM在120kV下操作成像。使用配備有后置的柱狀Gatan能量濾鏡(GIF)的Gatan CeD相機以(0)角度記錄圖像。凍干的包括BTZ-MEGA-CHOL的脂質(zhì)體的低溫TEM顯微照片示于圖6。如可看到的，所述脂質(zhì)體具有球形結(jié)構(gòu)并且大多數(shù)是單層的。另外，所述脂質(zhì)體的粒徑大多小于100nm。

BTZ-MEGA-CHOL的細胞毒性

細胞存活力研究在SUB6細胞(圖7)和K562細胞(圖8)上使用BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑執(zhí)行。白血病SUB6和K562細胞使用稀濃度的BTZ(VELCADE)或BTZ-MEGA-CHOL脂質(zhì)體制劑在0.05-5000nM范圍下處理48小時。使用MTS測定測量細胞毒性。圖7和8所示的結(jié)果為4個重復(fù)的平均值，并且誤差條代表標準偏差。結(jié)果表明，脂質(zhì)體BTZ針對白血病細胞有活性，但是比BTZ游離藥物的細胞毒性更小。這正是預(yù)期的，因為BTZ由于細胞吸收需要從脂質(zhì)體中釋放出來。由于它們長得多的循環(huán)半衰期，脂質(zhì)體在體內(nèi)預(yù)期會比游離藥物更有活性。

BTZ-MEGA-CHOL的活性的體內(nèi)研究

也使用動物研究研究BTZ-MEGA-CHOL的治療活性。使用5x 10⁵MV4-11AML細胞注射NSG小鼠。將小鼠分成兩組，每組10只(試驗I)，并且用空脂質(zhì)體或BTZ-MEGA-CHOL的脂質(zhì)體制劑以1mg/kg通過尾靜脈注射處理小鼠，每周兩次。以每組5只小鼠重復(fù)一次研究(試驗II)。試驗I中處理4周后處死每組的三只小鼠用于進一步分析。

兩個試驗均顯示小鼠存活顯著增加。對于試驗I，p值為0.0007(圖9)。對于試驗II，p值為0.0019(圖10)。當(dāng)數(shù)據(jù)集被視為組合時，p值<0.0001并且對于空脂質(zhì)體處理組(對照)的小鼠的中位存活期為28天，并且對于BTZ-MEGA-CHOL處理組的小鼠的中位存活期為39天(圖11)。這些數(shù)據(jù)共同指示BTZ-MEGA-CHOL的強效治療活性。

向6-8周齡的NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ,The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)中通過尾靜脈靜脈內(nèi)(i.v.)注射0.3X 106適應(yīng)的MV4-11細胞。給予4周的空脂質(zhì)體和L-BTZ，然后處死。在本研究中，分析每組3只小鼠。通過組織染色分析兩組小鼠的外周血中的白血病母細胞。另外，評估小鼠的脾尺寸和重量。使用Wright-Giemsa染色兩組的血液涂片，并且在顯微鏡下可以觀察到白血病母細胞。L-BTZ處理組的脾尺寸有顯著的不同(圖12)。與空脂質(zhì)體處理組相比，有極少的母細胞并且脾較小(圖13)。

藥物釋放研究

通過在37℃下在pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中監(jiān)測脂質(zhì)體中藥物含量隨時間的變化來確定BTZ從BTZ前藥中釋放的速率。由18mL的PBS在37℃下連續(xù)攪拌稀釋L-BTZ(2ml)。以不同的時間間隔，取出1mL樣品用于分析。通過將1mL L-BTZ混合物裝載穿過10mLSepharose CL-4B柱(以每級分1mL用水平衡)，來完成L-BTZ從游離BTZ中的分離。然后用9x甲醇萃取每種級分。適當(dāng)?shù)幕旌虾?，在UV分光光度計下在OD 270nm下測量每種級分的BTZ的濃度。在實驗開始時L-BTZ已經(jīng)釋放了20％的BTZ。數(shù)據(jù)(圖14)表明，在pH 7.4和37℃下，BTZ緩慢從脂質(zhì)體中釋放，并且在測試條件下在40％的游離BTZ下達到新的平衡。因此可以得出結(jié)論，L-BTZ應(yīng)該在pH 8下在水中復(fù)溶用于注射，并且在復(fù)溶8小時內(nèi)使用并儲存在環(huán)境溫度或4℃下。

藥代動力學(xué)研究

L-BTZ的藥代動力學(xué)在ICR小鼠中進行了研究(Charles River Lab,Wilmington,MA)。也確定了游離BTZ的PK特征。經(jīng)由尾靜脈給予小鼠1.0mg/kg體重的游離BTZ或L-BTZ的靜脈內(nèi)注射液。以選定的時間間隔，使用含肝素的管從每只小鼠中收集最少100μL血漿。然后通過以3000x g離心5分鐘分離血漿。通過使用電感耦合等離子體-發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測量硼濃度來確定血漿中的藥物濃度。硼萃取和樣品制備先前已經(jīng)描述。血漿濃度相對于時間的曲線圖示于圖15中。使用WinNonlin軟件和二室模型計算游離BTZ和L-BTZ的藥代動力學(xué)參數(shù)，并示于表1中。

表1.i.v.施用后血漿中游離BTZ和L-BTZ的藥代動力學(xué)參數(shù)。數(shù)值呈現(xiàn)為平均值±SD(n＝3)。

^a相對于游離BTZ有統(tǒng)計顯著性(p<0.05)。

鱟變形細胞裂解物(LAL)測定

使用標準LAL測定評估L-BTZ。LAL測定的結(jié)果包括在下表2中。

表2.LAL測定的結(jié)果。

由瓊脂平板測試未檢測到微生物污染。測量的內(nèi)毒素水平超出合適的內(nèi)毒素極限30-60倍。

流體動力學(xué)尺寸和ζ電位

在使用兩種不同的分散介質(zhì)(10mM NaCl和PBS緩沖液)100和1000倍稀釋后使用動態(tài)光散射(低體積石英比色皿，b＝10mm，25℃，633nm激光，173°散射角)測量L-BTZ制劑中的脂質(zhì)體的流體動力學(xué)尺寸。結(jié)果在以下表3中示出。

表3.在使用兩種不同的分散介質(zhì)(10mM NaCl和PBS緩沖液)100和1000倍稀釋后動態(tài)光散射分析L-BTZ制劑。結(jié)果基于12次測量的平均值。

這些發(fā)現(xiàn)表明，脂質(zhì)體的粒徑基于稀釋或分散介質(zhì)沒有顯著變化。

也測量了L-BTZ制劑中的脂質(zhì)體的ζ電位。將L-BTZ的樣品用10mMNaCl稀釋100倍。然后在25℃和pH 7.5下測量表觀ζ電位。脂質(zhì)體具有-16.1±0.3mV的負ζ電位值。

實施例6.BTZ-MEGA-CHOL(50mg API BTZ)的中等規(guī)模制備方案

開發(fā)了簡單的方案以在更大規(guī)模上(例如，在50mg API BTZ規(guī)模上)制備BTZ-MEGA-CHOL。

膽固醇-葡甲胺綴合物(MEGA-CHOL)的合成

在25mL圓底燒瓶中，將氯甲酸膽固醇酯(351mg)溶解在9mL CHCl₃中。接著，加入8mL DMSO中的葡甲胺(102mg)和三乙胺(73μl)。將混合物在室溫下攪拌12小時。通過TLC和HPLC監(jiān)測反應(yīng)。將混合物倒入純水中。通過0.1N HCl洗滌沉淀物以得到白色粗產(chǎn)物。通過在硅膠上的柱色譜法使用甲醇和氯仿(1:2v/v)純化該粗產(chǎn)物。R_f0.50(甲醇/氯仿，1:2，v/v)。

脂質(zhì)-藥物異丙醇溶液的制備

將BTZ和MEGA-CHOL(摩爾比1:2)溶解在異丙醇中并反應(yīng)兩小時。然后向溶液中加入DSPC、膽固醇和PEG-DSPE直到它們完全溶解。然后將該溶液稀釋進10體積的20mM磷酸鹽緩沖液(pH＝8)中以形成L-BTZ脂質(zhì)體。

均質(zhì)化工藝

將上述的L-BTZ懸浮液在高壓均質(zhì)器(Avestin Emulsiflex C5)上在10,000psi下連續(xù)工藝處理，以將平均粒徑降至低于100nm。然后將L-BTZ通過0.45μm過濾器過濾以在切向流滲濾(TFF)之前去除任何不溶性的微粒。

TFF工藝

將過濾的L-BTZ加入到TFF系統(tǒng)(具有Midikros中空纖維濾筒的Millipore Labscale TFF泵系統(tǒng))，并且使用5mM磷酸鹽緩沖液(pH＝8)以5體積置換洗滌L-BTZ，以去除異丙醇和游離BTZ藥物并濃縮L-BTZ產(chǎn)物。

最終脂質(zhì)體制劑的制備

TFF后向脂質(zhì)體中加入10％的蔗糖(冷凍保護劑)。在生物安全柜中將L-BTZ終產(chǎn)物通過0.22μm PES膜過濾，并轉(zhuǎn)移至高壓消毒的玻璃小瓶和蓋子中。隨后將所述產(chǎn)物儲存于-70℃下直至使用。

隨附權(quán)利要求書的材料和方法的范圍不受限于本文中描述的特定材料和方法，所述材料和方法意圖作為權(quán)利要求書的幾個方面的說明，并且功能等效的任何材料和方法都在本公開的范圍內(nèi)。除了本文中示出和描述的材料和方法之外，材料和方法的各種修改意在落入隨附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。此外，雖然僅特定描述了某些代表性材料、方法以及這些材料和方法的方面，但是其他材料和方法以及材料和方法的各種特征的組合意在落入隨附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，即使不特定地敘述也是如此。因此，本文中可以明確地提到步驟、要素、組分或成分的組合；然而，即使不明確說明，也包括步驟、要素、組分和成分的所有其他組合。