專利名稱：：標(biāo)記的和非標(biāo)記的單克隆抗體的組合物的制作方法標(biāo)記的和非標(biāo)記的單克隆抗體的組合物本發(fā)明涉及針對(duì)人跨膜蛋白的標(biāo)記的和非標(biāo)記的單克隆抗體的組合物，其用于同時(shí)治療和診斷與所述蛋白過表達(dá)有關(guān)的疾病，特別是癌癥。本發(fā)明還涉及這樣的方法，所述方法是首先施用所述組合物，確定標(biāo)記的抗體濃度的變化和然后僅施用非標(biāo)記的單克隆抗體以使得在治療中獲得并維持所述非標(biāo)記抗體獲得有利治療功效的最小需要濃度，同時(shí)由于較低的全身抗體濃度而最小化不利的副作用。
背景技術(shù)：
：治療中的單克隆抗體在正在進(jìn)行的尋求改進(jìn)針對(duì)癌癥的治療武器庫中，除手術(shù)、化學(xué)療法和放射性療法以外的第四種武器出現(xiàn)了，即靶定療法。靶定療法包括，酪氨酸激酶受體抑制劑(小分子抑制劑，如伊馬替尼、gefitinib,erlotinib)、蛋白酶體抑制劑(bortezomib)、生物應(yīng)答改良劑(denileukindiftitox)和單克隆抗體(MAbs)。Mab作為靶定療法的顯著特異性使它們成為有前景的用于人類治療的試劑。Mab不僅可以在治療學(xué)上用于防止患病，而且它們還可以用于診斷多種疾病，測(cè)量血清蛋白和藥物水平，測(cè)定組織和血液類型和識(shí)別參與免疫應(yīng)答的傳染性試劑和特異性細(xì)胞。開發(fā)的生物技術(shù)藥物中的大約l/4是Mab，且約30種產(chǎn)物正處于使用或研究中。大部分Mab用于治療癌癥。(Gupta,N.,等，IndianJournalofPharmacology(印度藥理學(xué)雜志)38(2006)390-396;Funaro，A.，等，BiotechnologyAdvances(生物技術(shù)進(jìn)展)18(2000)385-401;Suemitsu,N;等，ImmunologyFrontier(免疫學(xué)新領(lǐng)域)9(1999)231-236)。標(biāo)記的單克隆抗體和體內(nèi)成像若干體內(nèi)成像方法可用于量化腫瘤組織中的治療抗體，其通?；谒隹贵w的標(biāo)記衍生物。所述標(biāo)記的抗體通常包括用放射性標(biāo)記來標(biāo)記的抗體，所述放射性標(biāo)記諸如，例如1241、mIn、64Cu、或其他標(biāo)記，以用于正電子成像術(shù)(PET)(參見例如，Robinson,M.K.,等，CancerRes(癌癥研究)65(2005)1471-1478;Lawrentschuk,N"等，BJUInternational(國際BJU)97(2006)916-922;Olafsen,T.，等,CancerResearch(癌癥研究)65(2005)5907-5916;和Trotter,D.E.,等，JournalofNuclearMedicine(核醫(yī)學(xué)雜志)45(2004)1237-1244)，123I、125I、和""^Tc和其他，以用于單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)化斷層顯像(SPECT)(參見例如，Orlova,A.,等，JournalofNuclearMedicine(核醫(yī)學(xué)雜志)47(2006)512-519;Dietlein,M.,等，EuropeanJournalofHaematology(歐洲血液學(xué)雜志)74(2005)348-352)。此外，已知用于體內(nèi)成像技術(shù)的非放射性標(biāo)記，例如近紅外(NIR)熒光標(biāo)記、活性染料(activatabledyes)、和engodogenous報(bào)告基團(tuán)(熒光蛋白樣GFP-樣蛋白、和生物發(fā)光成像)(Licha,K.，等，AdvDrugDelivRev(現(xiàn)代藥物遞送綜述)，57(2005)1087-1108)。特別地，NIR熒光成像可以用于量化腫瘤組織中的治療性抗體。近紅外成像超越其他目前使用的臨床成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)包括以下同時(shí)使用多種可區(qū)分的探針的潛力(在分子成像中很重要)；高瞬時(shí)分辨率(在功能性成像中很重要)；高空間分辨率(在體內(nèi)顯微鏡法中很重要);和安全(無致電離輻射)。在NIR熒光成像中，使用過濾具有確定帶寬的光或激光作為激發(fā)光的光源。激發(fā)光經(jīng)過體組織傳輸。當(dāng)它遇到近紅外熒光分子("造影劑")時(shí)，激發(fā)光被吸收。熒光分子再發(fā)射在光譜上可與激發(fā)光區(qū)分開的(稍長的波長)光(熒光)。盡管近紅外光良好地穿透生物組織，但是常規(guī)近紅外熒光探針遭遇許多其他造影劑遇到的相同局限性，包括低靶標(biāo)/背景比。近紅外波長(約640-1300nm)已被用于內(nèi)部組織的光學(xué)成像，因?yàn)榻t外輻射表現(xiàn)出至多6-8厘米的組織穿透。參見，例如，Wyatt,J.S.,Phil.Trans.R.Soc.B(皇家學(xué)會(huì)哲學(xué)學(xué)報(bào)，系列B)352(1997)697-700;Tromberg:B丄,等，Phil.Trans.R.Soc.London:B(倫敦皇家學(xué)會(huì)哲學(xué)學(xué)報(bào)，系列B)352(1997)661-667。用于體內(nèi)成像的抗體-標(biāo)記綴合物的準(zhǔn)確量取決于所用標(biāo)記的不同特征和方面，例如，對(duì)于NIR熒光標(biāo)記，該標(biāo)記的量子產(chǎn)額是關(guān)于所用標(biāo)記或標(biāo)記的抗體的量的標(biāo)準(zhǔn)之一(參見例如WO2006/072580)。在治療中施用和監(jiān)控非標(biāo)記單克隆抗體影響惡性疾病的成功療法的因素包括使用的抗體劑量和施藥時(shí)間表，抗體的半衰期和快速血液清除，循環(huán)抗原的存在，高/mol.-wt的單克隆抗體(mAb)的不良腫瘤滲透和這些分子分解代謝的方式。目前，缺少關(guān)于抗體生理學(xué)功能和代謝的許多方面的知識(shí)(Iznaga-Escobar，N.,等，Meth.Find.Exp.Clin.Pharm.(實(shí)驗(yàn)和臨床藥理學(xué)方法和發(fā)現(xiàn))(2004)26(2)123-127)?？贵w在惡性疾病療法中的給藥和施用模式通常基于所述抗體的血清藥物動(dòng)力學(xué)特性，如血清半衰期、不同劑量的AUC、血液清除和其他(Iznaga-Escobar,N.,等，Meth.Find.Exp.Clin.Pharm.(實(shí)驗(yàn)和臨床藥理學(xué)方法和發(fā)現(xiàn))(2004)26(2)123-127;Lobo,E.D.，等，J.PharmSci.(藥物科學(xué)雜志)93(2004)2645-2668;Tabrizi，M.A.,等，DrugDiscoveryToday(今日藥物發(fā)現(xiàn))11(2006)81-88)。例如，在腫瘤治療中，靶向?qū)嶓w瘤的抗體的高血清水平實(shí)際上被認(rèn)為是隨后的治療評(píng)估的基本需要。該評(píng)估通常很困難，因?yàn)檠逅皆诨颊咧g經(jīng)常非常不同。然而，以最佳方式與其相關(guān)靶標(biāo)結(jié)合的治療性單克隆抗體與對(duì)所述相關(guān)靶標(biāo)具有較低親和力的抗體相比，具有較快的血清清除(耙標(biāo)相關(guān)的/介導(dǎo)的清除)。這可能是治療性抗體的血漿水平為什么不總是與腫瘤組織中的抗體濃度相關(guān)聯(lián)的一個(gè)原因(Clarke,K.，等，CancerRes.(癌癥研究)60(2000)4804-4811;Chrastina,A.,等，IntJCancer(國際癌癥雜志)105(2003)873-881;Lub-deHooge,M.N.,等，BritJPharmacol.(英國藥理學(xué)雜志)143(2004)99-106;Robinson,M.K.,等，CancerRes(癌癥研究)65(2005)1471-1478;Kenanova，V.,等，CancerRes.(癌癥研究)65(2005)622-631;在Batra,S.K.,等，CurrOpinBiotechnol.(當(dāng)前生物技術(shù)觀點(diǎn))6(2002)603-608中綜述。因此，治療性抗體(特別是針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的抗體)的高血清水平可以指示與靶標(biāo)減少的結(jié)合。此外，在過量給藥治療性抗體(高于腫瘤飽和劑量)的'詹形中，自由的抗體可以結(jié)合于較低親和力的表位(或免疫效應(yīng)子細(xì)胞上的Fc受體)，且這可以導(dǎo)致有害的副作用，如，例如，由于HER2對(duì)心肌細(xì)胞的抑制而引起的抗-HER2-抗體治療中的心力衰竭(Grazette,L.P;等，；JAmCollCard(美國心臟病學(xué)學(xué)院雜志)(2004),44(11),2231-8;Negro,A.,RecentProgressinHormoneResearch(激素研究的近期進(jìn)展)59(2004)1-12;Negro,A.，等，PNAS103(2006)15889-15893)。因此，當(dāng)尚未定義最適合的施藥模式時(shí)，測(cè)量單獨(dú)的血清水平和相關(guān)的血清半衰期可以令人誤解。因此，關(guān)于腫瘤飽和劑量的定量信息是重要的問題。標(biāo)記的抗體的副作用用放射性標(biāo)記標(biāo)記的單克隆抗體具有一個(gè)大缺陷，這歸因于所述標(biāo)記可以在健康的細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。具體地，當(dāng)這些放射性標(biāo)記的抗體用于診斷時(shí)，這些副作用是有害的。實(shí)際上，存在與非放射性標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的不同單克隆抗體(BalIou，B.,等，ProceedingsofSPIE-TheInternationalSocietyforOpticalEngineering(SP正一國際光學(xué)工程協(xié)會(huì)學(xué)報(bào))2680(1996)124-131;Ballou,B.,等，Cancerdetectionandprevention(癌癥的檢測(cè)和預(yù)防)(1998)22251-257;Becker,A.,等，NatureBiotechnology(自然生物技術(shù))19(2001)327-331;Montet,X.,等,CancerResearch(癌癥研究)65(2005)6330-6336;Rosenthal,E,L.,等，TheLaryngoscope(喉鏡)116(2006)1636-1641;Hilger,I.,等，EuropeanRadiology(歐洲放射線學(xué))14(2004)1124-1129;EP1619501,WO2006/072580,WO2004/065491禾口WO2001/023005)。這些綴合物用于體內(nèi)成像技術(shù)，從而檢測(cè)疾病的位點(diǎn)和尺寸(例如，腫瘤或炎癥的)。該診斷應(yīng)用都意欲在通過手術(shù)或化療試劑包括單克隆抗體治療之前或之后的診斷。通常，這些標(biāo)記的單克隆抗體用于診斷劑量，其中所用的非放射性標(biāo)記的副作用起微小作用(與使用放射性標(biāo)記相比)。然而，如果這些標(biāo)記的單克隆抗體將用于治療，則非放射性標(biāo)記的量很關(guān)鍵，這歸因于這些標(biāo)記有時(shí)嚴(yán)重的毒性(特別是花菁和羰花菁染料；參見例如，Kues,H.A.;Lutty，G.A;"Dyescanbedeadly"("染料可以是致命的)；LaserFocus(激光焦點(diǎn))(1975)11(5)59-61。)因此，這些標(biāo)記的單克隆抗體可以在不引起有害副作用的條件下直接用作治療劑或以治療劑量使用(參見例如Hilger,I.,等，EuropeanRadiology(歐洲放射線學(xué))14(2004)81124-1129)是令人質(zhì)疑的。治療性抗體的副作用因?yàn)閱慰寺】贵w治療的有害副作用在該治療過程中和在所述治療的最大持續(xù)時(shí)間中起重要作用，所以收集關(guān)于在使用所述抗體的第一治療過程中患病區(qū)域(目的區(qū)域，例如，在腫瘤或炎癥位點(diǎn)處)抗體濃度對(duì)時(shí)間的依從關(guān)系的足夠信息是重要的問題。這將容許以這樣的方式采用連續(xù)治療/施藥的給藥時(shí)間表，所述方式是最小化有害的過量給藥并使用所需抗體濃度的最小量。同樣地，患者之間抗體濃度對(duì)時(shí)間的依從關(guān)系的差別可以用于針對(duì)最小副作用最優(yōu)化個(gè)體給藥時(shí)間表。發(fā)明概述本發(fā)明包括藥物組合物，其包括a)與人跨膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體和b)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體，其中非標(biāo)記抗體與標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少1:9。優(yōu)選地，單克隆抗體是治療性單克隆抗體。非標(biāo)記抗體與標(biāo)記抗體的典型比例是至少l:9。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該比例是至少2:1，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該比例是至少9:1，在再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該比例是至少19:1。最大比例典型地受到標(biāo)記檢測(cè)極限的限制。因此，理想的比例應(yīng)該是具有最低的標(biāo)記抗體部分但仍在檢測(cè)過程中提供有效NIR熒光信號(hào)或成像的比例。這樣，非標(biāo)記的治療性單克隆抗體應(yīng)該在其起治療作用的模式中受到最少的影響，而同時(shí)，可以搜集關(guān)于例如實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)標(biāo)記的抗體的動(dòng)力學(xué)的重要信息，其可以用作最優(yōu)化給藥間隔或方案的基礎(chǔ)。非標(biāo)記的抗體與標(biāo)記的抗體的比例可以通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員以常規(guī)實(shí)驗(yàn)評(píng)估。就此而論，所述組合物典型地包括至少0.001mg/kg體重，優(yōu)選0.01mg/kg體重，更優(yōu)選O.lmg/kg體重的標(biāo)記的抗體。準(zhǔn)確的量可以變化，且取決于例如所述標(biāo)記及其量子產(chǎn)額。所述量可以由技術(shù)人員通過簡(jiǎn)單的常規(guī)實(shí)驗(yàn)定義。因此，該比例的上限也根據(jù)典型的治療劑量和該標(biāo)記的檢測(cè)極限變化。基于用于治療性處理的單克隆抗體的典型劑量(例如，曲妥單抗劑量設(shè)置為約2-8mg/kg體重)，一種優(yōu)選的最大比例是例如500:1,另一種是100:1,再一種是50:1，又一種是20:1。優(yōu)選地，所述人蛋白是過表達(dá)的人蛋白，更優(yōu)選的，過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白。因此，本發(fā)明包括藥物組合物，其包括a)與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的治療性單克隆抗體，其中所述過表達(dá)與腫瘤疾病相關(guān)，和b)所述與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的治療性單克隆抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少9:1且最大100:1。該組合物可以用于治療患有與所述人蛋白過表達(dá)有關(guān)的疾病(例如具有相關(guān)蛋白過表達(dá)的癌癥，諸如HER-陽性乳腺癌)并同樣用于確定最優(yōu)化給藥間隔(關(guān)于依賴其藥物代謝的個(gè)體患者)。給藥間隔的長度主要基于兩方面確定。一方面，它必須足夠短以至于患病位點(diǎn)的單克隆抗體的量足以發(fā)揮治療作用，另一方面，它必須足夠長從而最小化過量給藥和藥物相關(guān)的副作用。通常，給藥間隔通過分別測(cè)量1)例如單克隆抗體血清水平和2)治療功效來確定，它們隨后相互聯(lián)系。'然而，利用該方法，不同患者的不同代謝由于形成較大患者組的平均值而被忽視或失去。因此，新組合物包括非標(biāo)記的和標(biāo)記的治療性單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是所述與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記治療性單克隆抗體在制備用于第一次腫瘤治療的藥物組合物中的用途，其中所述過表達(dá)與腫瘤疾病有關(guān)，所述藥物組合物包括a)與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的治療性單克隆抗體，其中所述過表達(dá)與腫瘤疾病有關(guān)，和b)所述與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的治療性單克隆抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少9:1且最大100:1，其特征在于，當(dāng)腫瘤位點(diǎn)處與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體的信號(hào)強(qiáng)度是第一次治10療后測(cè)量的腫瘤位點(diǎn)處的最大信號(hào)強(qiáng)度的80%時(shí)，進(jìn)行使用第二藥物組合物的第二次腫瘤治療，所述第二藥物組合物包括非標(biāo)記單克隆抗體而不包括標(biāo)記的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在信號(hào)強(qiáng)度是70。/。，在再一個(gè)實(shí)施方案中，在信號(hào)強(qiáng)度是60%時(shí)，提供所述第二次治療。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是所述用于第一次腫瘤治療的組合物，其包括a)與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的治療性單克隆抗體，其中所述過表達(dá)與腫瘤疾病有關(guān)，和b)所述與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的治療性單克隆抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少9:1且最大100:1，其特征在于，當(dāng)實(shí)體瘤區(qū)域中與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體的信號(hào)強(qiáng)度是第一次治療后測(cè)量的實(shí)體瘤區(qū)域中的最大信號(hào)強(qiáng)度的80%時(shí)，進(jìn)行使用第二藥物組合物的第二次腫瘤治療，所述第二藥物組合物包括非標(biāo)記單克隆抗體而不包括標(biāo)記的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在信號(hào)強(qiáng)度是70%，在再一個(gè)實(shí)施方案中，在信號(hào)強(qiáng)度是60%時(shí)，提供所述第二次治療。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于第一次腫瘤治療的藥物組合物和用于第二次腫瘤治療的藥物組合物，所述用于第一次腫瘤治療的藥物組合物包括a)與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的治療性單克隆抗體，其中所述過表達(dá)與腫瘤疾病有關(guān)，和b)與MR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述治療性單克隆抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少9:1且最大100:1，所述用于第二次腫瘤治療的藥物組合物包括非標(biāo)記的單克隆抗體而不包括標(biāo)記的單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于第一次腫瘤治療的容器，其包括a)藥物組合物，其包括b)與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的治療性單克隆抗體，其中所述過表達(dá)與腫瘤疾病有關(guān)，和C)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述治療性單克隆抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少9:1且最大100:1，和a)用于第二次腫瘤治療的藥物組合物，其包括與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記治療性單克隆抗體，而不包括所述標(biāo)記的治療性單克隆抗體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是所述單克隆抗體在制備所述用于治療癌癥，優(yōu)選實(shí)體瘤的藥物組合物中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記治療性單克隆抗體在制備用于治療癌癥，優(yōu)選實(shí)體瘤的藥物組合物中的用途，其特征在于所述非標(biāo)記的單克隆抗體同與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體以非標(biāo)記標(biāo)記抗體為至少9:1且最大100:1的預(yù)定比例共同施用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記治療性單克隆抗體在制備用于治療患有過表達(dá)所述腫瘤相關(guān)蛋白的實(shí)體瘤的患者的藥物中的用途，其中所述非標(biāo)記抗體與與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體共同施用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，獲得了所述患有過表達(dá)所述腫瘤相關(guān)蛋白的實(shí)體瘤的患者的NIR熒光圖像。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體的NIR熒光信％。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記治療性單克隆抗體，其用于治療患有過表達(dá)所述腫瘤相關(guān)蛋白的實(shí)體瘤的患者，其中所述非標(biāo)記抗體與與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體共同施用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于獲得患有過表達(dá)腫瘤相關(guān)蛋白的實(shí)體瘤的患者的NIR熒光圖像的方法，所述患者已經(jīng)接受了藥物組合物的給藥，所述藥物組合物包括a)與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的治療性單克隆抗體，其中所述過表達(dá)與腫瘤疾病有關(guān)，和b)所述與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的治療性單克隆抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少9:1且最大100:1，其中，測(cè)量實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的標(biāo)記的治療性單克隆抗體的NIR熒光信號(hào)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于確定患者實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的治療性單克隆抗體的NIR熒光信號(hào)的方法，所述患者已經(jīng)接受了包括以下各項(xiàng)的藥物組合物的治療a)與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的治療性單克隆抗體，其中所述過表達(dá)與腫瘤疾病有關(guān)，和'b)所述與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的治療性單克隆抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少9:1且最大100:1。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是與人跨膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體在制備用于治療癌癥的藥物組合物中的用途，其特征在于，所述單克隆抗體同與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體以非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體至少1:9的預(yù)定比例共同施用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于確定在使用藥物組合物的治療過程中與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的單克隆抗體量的變化的方法，所述藥物組合物包括a)與人跨膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體，和o)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少9:1。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于確定在與所述非標(biāo)記單克隆抗體共同施用過程中與MR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的單克隆抗體量的變化的方法。發(fā)明詳述1.定義，術(shù)語"抗體"包括多種抗體形式，包括但不僅限于完全抗體、人抗體、人源化抗體和遺傳改造抗體，如單克隆抗體、嵌合抗體或重組抗體以及所述抗體的片段，其條件是其保持按照本發(fā)明的性能。術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"用于本文中時(shí)，指單氨13基酸組合物的抗體分子制劑。因此，術(shù)語"人單克隆抗體"指顯示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤制備，所述雜交瘤包括由具有包含與無限增殖化細(xì)胞融合的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的B細(xì)胞。術(shù)語"治療性單克隆抗體"用于本文中時(shí)指如上定義的單克隆抗體，其在施用于患者時(shí)，特異性結(jié)合于人跨膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，且對(duì)與所述人跨膜蛋白表達(dá)有關(guān)的疾病具有治療作用。優(yōu)選地，所述治療性單克隆抗體對(duì)腫瘤或癌癥疾病具有治療作用，.其與所述腫瘤或癌癥疾病的表達(dá)，優(yōu)選過表達(dá)有關(guān)。典型地，這樣的抗腫瘤治療性單克隆抗體可以選自例如由下列各項(xiàng)組成的非限制性組阿兮單抗，apolizumab,西妥昔單抗，依帕珠單抗,galiximab,吉姆單抗,ipilimumab，labetuzumab,panitumumab,禾U妥昔單抗,曲妥單抗,nimotuzumab,mapatumumab,matuzumab禾口pertuzumab,優(yōu)選地，曲妥單抗，西妥昔單抗，和pertuzumab。術(shù)語"嵌合抗體"指單克隆抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)，和源自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，其通常通過重組DNA技術(shù)制備。包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體是特別優(yōu)選的。所述鼠/人嵌合抗體是表達(dá)的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，所述免疫球蛋白基因包括編碼鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA片段和編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA片段。本發(fā)明包括的"嵌合抗體"的其他形式是其中的類別或亞類由原始抗體的類或亞類改進(jìn)或改變而來的那些。所述"嵌合"抗體也指"類別-轉(zhuǎn)換的抗體"。制備嵌合抗體的方法涉及當(dāng)前本領(lǐng)域中公知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見，例如，Morrison,S丄.,等，Proc.Natl.AcadSci.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))81(1984)6851-6855;US5,202,238和US5,204,244。術(shù)語"人源化抗體"指這樣的抗體，其中構(gòu)架區(qū)或"互補(bǔ)決定區(qū)"(CDR)已被改進(jìn)為包括與親本免疫球蛋白相比不同特異性的免疫球蛋白的CDR。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將鼠CDR移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)，從而制備"人源化抗體"。參見，例如，Riechmann,L.,等，Nature(自然)332(1988)323-327;和Neuberger，M.S.,等，Nature(自然)314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDR對(duì)應(yīng)于代表識(shí)別以上關(guān)于嵌合和雙功能抗體注意到的抗原的序列的那些。術(shù)語"人抗體"，用于本文中時(shí)，意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(vanDijk,M.A.，和vandeWinkel，J.G"Curr.Opin.inChemicalBiology(現(xiàn)代化學(xué)生物學(xué)觀點(diǎn))5(2001)368-374)。基于所述技術(shù)，可以制備針對(duì)大量多種靶標(biāo)的人抗體。人抗體的實(shí)例例如記述在Kellermann，S.A.,等，CurrOpinBiotechnol.(現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn))13(2002)593-597中。術(shù)語"重組人抗體"，用于本文中時(shí)，意欲包括通過重組方式制備、表達(dá)、構(gòu)建或分離的所有人抗體，諸如由宿主細(xì)胞諸如NSO或CHO細(xì)胞或由對(duì)人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)分離的抗體或利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。所述重組人抗體具有源自處于重排形式的人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。按照本發(fā)明的重組人抗體經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，即當(dāng)源自且與人種系VH和VL序列相關(guān)時(shí)，可能不天然存在于人抗體種系體內(nèi)所有組成部分中。用于本文中時(shí)，"結(jié)合"或"特異性結(jié)合"指與人跨膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體，所述人跨膜蛋白是所述抗體特異性針對(duì)的。優(yōu)選地，結(jié)合親和力是約1(T"-l(y8M(KD),優(yōu)選約10_11-l(r9M。術(shù)語"核酸分子"，用于本文中時(shí)，意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，單優(yōu)選是雙鏈DNA。"恒定結(jié)構(gòu)域"不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是參與效應(yīng)子功能(ADCC，補(bǔ)體結(jié)合，和CDC)。"可變區(qū)"(輕鏈可變區(qū)(VL)、重鏈可變區(qū)(VH))用于本文中時(shí)指示直接涉及抗體與抗原結(jié)合的每対輕鏈和重鏈對(duì)?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)，且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括四個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，其序列普遍是保守的，其通過三個(gè)"高變區(qū)"(或互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)相連。所述構(gòu)架區(qū)采用P-折疊構(gòu)象，且CDR可以形成連接所述P-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每個(gè)鏈中的CDR通過構(gòu)架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)，且與來自其它鏈的CDR—起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中起特別重要的作用，且因此提供本發(fā)明的另一個(gè)目的。術(shù)語"高變區(qū)"或"抗體的抗原結(jié)合部分"在用于本文中時(shí)，指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基。"構(gòu)架"或"FR"區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)。因此，抗體的輕鏈和重鏈包括從N到C-末端的結(jié)構(gòu)域FRl,CDR1,FR2，CDR2,FR3,CDR3，和FR4。特別地，重鏈的CDR3是主要對(duì)抗原結(jié)合作出貢獻(xiàn)的區(qū)域。CDR和FR區(qū)根據(jù)Kabat，E.A.,等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫學(xué)目的蛋白序歹U)，第5版.PublicHealthService(公共衛(wèi)生局)，NationalInstitutesofHealth(國家衛(wèi)生學(xué)會(huì))，Bethesda,MD.(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義和/或來自"高變環(huán)"的那些殘基確定。術(shù)語"人跨膜蛋白"在用于本文中時(shí)，指在細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子層中被錨定的細(xì)胞膜蛋白。人跨膜蛋白應(yīng)該通常包括如本文中所用的"胞外結(jié)構(gòu)域"，其可以結(jié)合配體；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域，保守的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，和具有若干可以被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。人跨膜蛋白包括分子，諸如EGFR,HER2/neu,HER3，HER4,Ep-CAM,CEA,TRAIL,TRAIL-受體1,TRAIL-受體2,淋巴毒素-(3受體，CCR4,CD19,CD20,CD22，CD28，CD33，CD40，CD80,CSF-IR，CTLA-4,成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP),hepsin,黑素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP),前列腺特異性膜抗原(PSMA),VEGF受體1，VEGF受體2,IGFl-R，TSLP-R,TIE-1,TIE-2,TNTF-a，TNF樣弱凋亡誘導(dǎo)劑(TWEAK),IL-1R，優(yōu)選EGFR,HER2/neu,CEA,CD20,或IGFl-R。術(shù)語"癌癥"和"腫瘤"用于本文中時(shí)意指或描述哺乳動(dòng)物中的生理學(xué)病癥，其典型特征在于失控的細(xì)胞生長。癌癥或腫瘤的實(shí)例包括，但不僅限于，癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤(包括成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜細(xì)胞肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(包括良性腫瘤、促胃液素瘤、和島細(xì)胞癌)、間皮瘤、神經(jīng)鞘瘤(包括聽神經(jīng)瘤)、腦膜瘤、腺瘤、黑素瘤、和白血病或淋巴惡性腫瘤。所述癌癥的更具體實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌包括小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，肺腺瘤和肺鱗狀癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃(gastric)或胃(stomach)癌包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎(kidney)或腎(renal)癌，前列腺癌，陰道癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，睪丸癌，食管癌，膽管腫瘤，以及頭頸癌。優(yōu)選地，所述癌癥是實(shí)體瘤。術(shù)語"實(shí)體瘤"在用于本文中時(shí)指選自胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎(kidney)或腎(renal)癌，前列腺癌，陰道癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，睪丸癌，食管癌，膽管腫瘤，以及頭頸癌的組的腫瘤。術(shù)語"過表達(dá)的"人跨膜蛋白或"過表達(dá)"人跨膜蛋白意欲表示來自患者特定組織或器官的患病區(qū)域如腫瘤或關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的細(xì)胞中人跨膜蛋白表達(dá)與來自該組織或器官的正常細(xì)胞中的表達(dá)水平相比的異常水平?；加屑膊?，如例如特征為過表達(dá)人跨膜蛋白的患者可以通過本領(lǐng)域中己知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定來確定。術(shù)語"共同施用"或"共同施用的"意指與非標(biāo)記的抗體同時(shí)施用標(biāo)記的抗體。不言而喻地，抗體以治療有效量施用于患者，所述治療有效量是會(huì)引起研究者、獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)醫(yī)生(medicaldoctor)或其他臨床醫(yī)生(clinician)所探索的組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答的主題化合物或組合用于本文中時(shí)，術(shù)語"患者"優(yōu)選指需要處理以治療癌癥、或癌前病癥或病灶的人。然而，術(shù)語"患者"還可以指需要治療的非人動(dòng)物，其中優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物諸如狗、貓、馬、牛、豬、羊或非人靈長類動(dòng)物。術(shù)語"與標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體"或"標(biāo)記的抗體"用于本文中時(shí)，指與標(biāo)記綴合的抗體。綴合技術(shù)在過去幾年中顯著成熟，且在Aslam,M.,和Dent,A.，Bioconjugation(生物綴合物)，倫敦(1998)216-363，和在Tijssen,P.,"Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays(酶免疫觀U定的實(shí)踐禾口理論)"中的章節(jié)"Macromoleculeconjugation(高分子綴合物)"中，(1990)Elsevier,Amsterdam(阿姆斯特丹)中提供了優(yōu)秀的綜述。術(shù)語"非標(biāo)記的抗體"用于本文中時(shí)，指沒標(biāo)記的抗體。術(shù)語"MR"用于本文中時(shí)，意指近紅外。術(shù)語"實(shí)體瘤區(qū)域"用于本文中時(shí)，指包括實(shí)體瘤的區(qū)域。實(shí)體瘤區(qū)域可以包括完整的實(shí)體瘤或僅其局部。測(cè)量所述實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)的NIR熒光信號(hào)，且例如與作為參照的不同時(shí)間點(diǎn)的周圍非腫瘤性組織相比或與NIR熒光信號(hào)或圖像相比，獲得相應(yīng)的NIR熒光圖像的二維或三維形式。術(shù)語"預(yù)定比例"指非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的比，其是在制備所述組合物之前確定的。結(jié)合所述組合物的用于例如成像實(shí)體瘤或惡性血細(xì)胞的預(yù)期用途，成像設(shè)備(例如外部或內(nèi)窺鏡，等)選擇該比例，且特別取決于所用標(biāo)記和抗體上的量子產(chǎn)額。非標(biāo)記的抗體與標(biāo)記的抗體的典型比例是至少1:9,優(yōu)選至少2:1,和更優(yōu)選至少9:1。最大比例典型地受限于標(biāo)記的檢測(cè)界限。就此而論，所述組合物典型地包括至少0.001mg/kg體重，優(yōu)選O.Olmg/kg體重，更優(yōu)選O.lmg/kg體重的標(biāo)記的抗體。準(zhǔn)確的量可以變化，且取決于例如標(biāo)記及其量子產(chǎn)額。所述量可以由技術(shù)人員通過簡(jiǎn)單的常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。2.詳細(xì)說明本發(fā)明包括藥物組合物，所述藥物組合物包括a)與人跨膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體和b)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少1:9。優(yōu)選地，所述人蛋白是過表達(dá)的人蛋白；且進(jìn)一步地，所述過表達(dá)與疾病有關(guān)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體針對(duì)腫瘤性靶標(biāo)。諸如實(shí)體瘤或循環(huán)惡性細(xì)胞中的跨膜蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體針對(duì)EGFR,HER2/neu,HER3，HER4,Ep-CAM,CEA，TRAIL，TRAIL-受體1，TRAIL-受體2，淋巴毒素-卩受體，CCR4,CD19,CD20,CD22，CD28,CD33,CD40,CD80,CSF-1R,CTLA畫4，成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP),hepsin，黑素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP),前列腺特異性膜抗原(PSMA)，VEGF受體181,VEGF受體2,IGF1-R,TSLP-R,TIE-l,TIE-2，TNF-a，TNF樣弱凋亡誘導(dǎo)劑(TWEAK),IL-1R,優(yōu)選EGFR,HER2/neu，CEA,CD20,或IGF1-R。優(yōu)選地，所述抗體是抗-HER2抗體，優(yōu)選曲妥單抗或pertuzumab。優(yōu)選地，所述抗體是抗-EGFR抗體，優(yōu)選西妥昔單抗，nimotuzumab，或matuzumab。優(yōu)選地，所述抗體是抗-IGFlR抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，'所述藥物組合物的特征在于所述抗體選自由下列各項(xiàng)組成的組阿侖單抗，apolizumab,西妥昔單抗，依帕珠單抗，galiximab吉姆單抗:ipilimumab,labetuzumab,panitumumab,禾廿發(fā)昔單抗,曲發(fā)單抗，nimotuzumab,mapatumumab,matuzumab禾口pertuzumab,優(yōu)選曲妥單抗,西妥昔單抗,禾口pertuzumab。所述組合物典型地包括至少0.001mg/kg體重，優(yōu)選0.01mg/kg體重,更優(yōu)選O.lmg/kg體重的與標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體。準(zhǔn)確的量可以變化，且取決于例如標(biāo)記及其量子產(chǎn)額。所述量可以由技術(shù)人員通過簡(jiǎn)單的常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。所述抗體用近紅外(NIR)熒光標(biāo)記來標(biāo)記，所述近紅外(NIR)熒光標(biāo)記適合用于利用NIR熒光成像測(cè)量腫瘤濃度。"測(cè)量"或"確定"實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)的NIR熒光信號(hào)在將標(biāo)記的抗體施用于患者后執(zhí)行?；蛘?，如果使用按照本發(fā)明的組合物，則在將非標(biāo)記抗體和標(biāo)記的抗體的組合物施用于患者后。測(cè)量在施藥后的確定時(shí)間點(diǎn)，例如1天、2天或3天或甚至更多天或任何其他適合于在實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)獲得可比較的NIR熒光信號(hào)或圖像時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。測(cè)量的持續(xù)時(shí)間或施藥后的時(shí)間點(diǎn)可以通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員通過獲得合適的NIR熒光信號(hào)或圖像調(diào)節(jié)。為了MR熒光測(cè)量，可以使用不同的裝置和技術(shù)，例如關(guān)于外部實(shí)體瘤如乳腺腫瘤，來自ARTAdvancedResearchTechnologiesInc.的SoftScan儀(http:〃www.art.ca/en/products/softscan.html)是適合的(IntesX,Acad.Radiol.12(2005)934-947)。關(guān)于內(nèi)部患病區(qū)域，如結(jié)腸直腸或肺癌，可以使用內(nèi)窺鏡技術(shù)或顯微外科-內(nèi)窺鏡檢査法的組合。使用具有處于近紅外光譜中的激發(fā)和發(fā)射波長的NIR熒光標(biāo)記，即640-1300nm，優(yōu)選640-1200nm,和更優(yōu)選640-卯0nm。使用這部分電磁波頻譜最大化組織滲透且最小化被生理上富含的吸收劑，諸如血紅蛋白(<650nm)和水(>1200nm)的吸收。理想用于體內(nèi)的近紅外熒光染料表現(xiàn)出(1)窄光譜特征，(2)高靈敏性(量子產(chǎn)額)(3)生物適應(yīng)性，和(4)去偶吸收(dddecouplesabsorption)和激發(fā)光譜。多種近紅外(NIR)熒光標(biāo)記可商購，且可以用于制備按照本發(fā)明的探針。示范性NIRF標(biāo)記包括下列Cy5.5，Cy5和Cy7(Amersham,ArlingtonHts"IL;IRD41和IRD700(LI畫COR,Lincoln,NE);MR-1,(Dejindo,Kumamoto,日本)；LaJolla藍(lán)(Diatron,Miami，F(xiàn)L);H引哚菁綠(ICG)及其類似物(Licha,K.,等，SPIE-TheInternationalSocietyforOpticalEngineering(國際光學(xué)工程協(xié)會(huì))2927(1996)192-198;Ito,S.,等，US5,968,479);吲哚三碳菁(ITC;WO98/47538);和螯合的鑭系化合物。熒光鑭系金屬包括銪和鋱。鑭系元素的熒光特性記述在Lackowicz,J.R.,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy(熒光光譜學(xué)原理)，第2版，KluwaAcademic,紐約，(1999)中。因此，所述抗體優(yōu)選由N1R熒光標(biāo)記來標(biāo)記，所述NIR熒光標(biāo)記選自Cy5.5,Cy5,Cy7,IRD41,IRD700，NIR-l,LaJolla藍(lán)，吲哚菁綠(ICG),吲哚三碳菁(ITC)和SF64，5-29,5-36和5-41(來自WO2006/072580)的組，更優(yōu)選地，所述抗體用選自Cy5.5，Cy5和Cy7的組的NIRF標(biāo)記來標(biāo)記。用于偶聯(lián)NIR熒光標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域中公知的。NIR熒光標(biāo)記與抗體的綴合技術(shù)在過去的幾年中顯著成熟，且在Aslam,M.,和Dent,A.,Bioconjugation(生物綴合物)(1998)216-363,倫敦，和在Tijssen,P""Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays(酶免疫測(cè)定的實(shí)踐和理論)"中的章節(jié)"Macromoleculeconjugation(高分子綴合物)"中，(1990)Elsevier,Amsterdam(阿姆斯特丹)中提供了優(yōu)秀的綜述。由以上引用的文獻(xiàn)已知合適的偶聯(lián)化學(xué)(Aslam，見上)。NIR熒光標(biāo)記，根據(jù)存在哪種偶聯(lián)部分，可以與水性或有機(jī)培養(yǎng)基中的抗體直接反應(yīng)。偶聯(lián)部分是用于化學(xué)偶聯(lián)熒光染料標(biāo)記和抗體的反應(yīng)基或有活性的基團(tuán)。熒20光染料標(biāo)記可以直接附著于抗體或通過間隔區(qū)與抗體連接，從而形成包括抗體和NIR熒光標(biāo)記的NIR熒光標(biāo)記綴合物。所用的間隔區(qū)可以選擇或設(shè)計(jì)為固有適當(dāng)長的體內(nèi)持久性(半衰期)。"測(cè)量"或"確定"實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)的NIR熒光信號(hào)在將標(biāo)記的抗體施用于患者后執(zhí)行?；蛘撸绻褂冒凑毡景l(fā)明的組合物，則在將非標(biāo)記抗體和標(biāo)記的抗體的組合物施用于患者后。測(cè)量在施藥后的確定時(shí)間點(diǎn)，例如1天、2天或3天或甚至更多天或任何其他適合于在實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)獲得可比較的NIR熒光信號(hào)或圖像時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。測(cè)量的持續(xù)時(shí)間或施藥后的時(shí)間點(diǎn)可以通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員通過獲得合適的MR熒光信號(hào)或圖像調(diào)節(jié)。例如，在施藥后的第一周，可以每日或每2-3日進(jìn)行測(cè)量，這取決于腫瘤濃度的增加。在第二和隨后的數(shù)周內(nèi)，可以每2-5日進(jìn)行測(cè)量，這取決于抗體的腫瘤濃度的增加和減小。由于腫瘤濃度的增加和減小取決于抗體的類型，所以甚至其他測(cè)量時(shí)期可能合適，例如，一周或更長。測(cè)量應(yīng)該通過檢測(cè)標(biāo)記的抗體量的變化調(diào)節(jié)。為了NIR熒光測(cè)量，可以使用不同的裝置和技術(shù)，例如關(guān)于外部實(shí)體瘤如乳腺腫瘤，來自ARTAdvancedResearchTechnologiesInc.的SoftScan4義(http:〃www.art.ca/en/products/softscan.html)是適合的(IntesX，Acad.Radiol.12(2005)934-947)。關(guān)于內(nèi)部患病區(qū)域，如結(jié)腸直腸或肺癌，可以使用內(nèi)窺鏡技術(shù)或顯微外科-內(nèi)窺鏡檢査法的組合。為了檢測(cè)例如惡性血細(xì)胞(白血病中)中標(biāo)記的抗體的量，可以使用與血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀結(jié)合的shant檢測(cè)信號(hào)量/血細(xì)胞。有效用于實(shí)踐本發(fā)明的關(guān)于MR熒光測(cè)量的成像系統(tǒng)典型地包括三個(gè)基本元件(l)近紅外光源，(2)用于分開或區(qū)分熒光發(fā)射和用于熒光染料激發(fā)的光的裝置，和(3)檢測(cè)系統(tǒng)。光源提供單色(或基本單色)近紅外光。光源可以是適當(dāng)過濾的白光，即，來自寬帶源的帶通光(bandpasslight)。例如，來自150-瓦特鹵素?zé)舻墓饪梢酝ㄟ^商購自O(shè)megaOptical(歐米茄光學(xué))(Brattleboro，VT)的合適帶通濾光器。在一些實(shí)施方案中，光源是激光。參見，例如，Boas,D.A.，等，1994，Pro"Natl.Acad,Sci.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))914887-4891;Ntziachristos,V.,等，2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))972767-2772;Alexander,W.,1991,J.Clin.LaserMed.Surg.(臨床激光醫(yī)學(xué)手術(shù)雜志)9416-418。高通濾光器(700nm)可以用于分開熒光發(fā)射和激發(fā)光。合適的高通濾光器商購自O(shè)megaOptical(歐米茄光學(xué))。通常，可以認(rèn)為光檢測(cè)系統(tǒng)包括光收集/圖像形成元件和光檢測(cè)/圖像記錄元件。盡管光檢測(cè)系統(tǒng)可以是合并這兩種元件的單個(gè)綜合裝置，但是光收集/圖像形成元件和光檢測(cè)/圖像記錄元件應(yīng)該分開討論。特別有效的光收集/圖像形成元件是內(nèi)窺鏡。已經(jīng)用于在體內(nèi)光學(xué)成像許多組織和器官，包括腹膜(GaMen，J.,等，J.Photochem.Photobiol.B(光化學(xué)和光生物學(xué)雜志B)52(1999)131-135),卵巢癌(Major,A.L.,等，Gynecol.Oncol.(婦科腫瘤學(xué))66(1997)122132),結(jié)腸(Mycek，M.A.,等，Gastrointest.Endoscopy.(胃腸內(nèi)窺鏡檢查法)48(1998)390-394;Stepp,H.,等，Endoscopy(內(nèi)窺鏡檢查法)30(1998)379-386)膽管(Izuishi,K.,等，Hepatogastroenterology(肝腸胃病學(xué))46(1999)804807),胃(Abe,S.,等,Endoscopy(內(nèi)窺鏡檢查法)32(2000)281-286)，膀胱(Kriegmair，M.,等，Urol.Int.(國際泌尿?qū)W)63(1999)27-31;Riedl,C.R.,等，J.Endourol.13755-759),和腦(Ward,J.,LaserAppl.(激光應(yīng)用)10(1998)224-228)的內(nèi)窺鏡裝置和技術(shù)可以用在本發(fā)明的實(shí)踐中。有效用于本發(fā)明的其他光收集元件類型是基于導(dǎo)管的裝置，包括纖維光學(xué)裝置。所述裝置特別有效用于血管內(nèi)成像。參見，例如，Teamey，G丄，等，Science(科學(xué))276(1997)2037-2039;Boppart,S.A.,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))94,4256-4261。其他成像技術(shù)，包括相控陣技術(shù)(Boas，D.A.,等，Proc.Natl.Acad.Sci.(國家科學(xué)院學(xué)報(bào))19USA91(1994)4887-4891;Chance,B.，JournalAnn.NYAcad.Sci.(NY科學(xué)院年刊)838(1998)29-45),擴(kuò)散光學(xué)X射線斷層術(shù)(Cheng，X.,等，OpticsExpress(光學(xué)快遞)3(1998)118-123;Siegel,A.,等,OpticsExpress(光學(xué)快遞)4(1999)287-298),活體顯微鏡法(Dellian,M.，等，JournalBr.JCancer(英國癌癥雜志)82(2000)1513-1518;Monsky，W丄.,等，CancerRes.(癌癥研究)59(1999)4129-4135;Fukumura,等，Cell(細(xì)胞)94(1998)715-725),和共聚焦成像(Korlach,J.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))96(1999)8461-8466;Rajadhyaksha,M.,等，丄Invest.Dermatol.(皮膚病學(xué)研究雜志)104(1995)946-952;Gonzalez,S.,等,JournalMed.(醫(yī)學(xué)雜志)30(1999)337-356)，可以用在本發(fā)明的實(shí)踐中。任何合適的光檢測(cè)/圖像記錄元件，例如，電荷偶聯(lián)裝置(CCD)系統(tǒng)或膠片，可以用于本發(fā)明中。光檢測(cè)/圖像記錄的選擇應(yīng)該取決于一些因素，包括所用光收集/圖像形成元件的類型。選擇合適的元件，將它們裝配為近紅外成像系統(tǒng)，和操作該系統(tǒng)屬于本領(lǐng)域中的一般技術(shù)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是所述單克隆抗體在制備所述用于治療癌癥，諸如實(shí)體瘤或循環(huán)惡性細(xì)胞(例如，在白血病中)的藥物組合物中的用途，其特征在于，所述藥物組合物包括處于非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體至少1:9的預(yù)定比例的與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是所述單克隆抗體在制備用于治療實(shí)體瘤的藥物組合物中的用途，其特征在于所述藥物組合物包括處于非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體至少1:9的預(yù)定比例的與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是與人跨膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體在制備用于治療癌癥的藥物組合物中的用途，其特征在于所述單克隆抗體跟與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體以非標(biāo)記抗體和標(biāo)記抗體至少1:9的預(yù)定比例共同施用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是藥物組合物用于第一次治療的用途，和非標(biāo)記的抗體僅用于第二次治療的用途，其中所述藥物組合物包括a)與人跨膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體和b)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶裙的所述抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少1:9。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是所述藥物組合物用于治療癌癥，優(yōu)選實(shí)體瘤的用途。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是與人跨膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體用于治療癌癥，優(yōu)選實(shí)體瘤的用途，其特征在于，所述單克隆抗體跟與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體以非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體至少1:9的預(yù)定比例共同施用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是藥物組合物用于第一次治療的用途，和非標(biāo)記的單克隆抗體僅用于第二次治療的用途，其中所述藥物組合物包括a)與人跨膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體和b)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體，其中非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少1:9。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于確定在使用藥物組合物治療的過程中與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的單克隆抗體量的變化的方法，所述藥物組合物包括a)與人跨膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體和b)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體，其中非標(biāo)記抗體:標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少1:9。所述方法包括例如下列步驟a)在由使用非標(biāo)記的組合物治療后開始的不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量目的區(qū)域(ROI)，例如實(shí)體瘤，諸如實(shí)體瘤或/血細(xì)胞中的NIR熒光強(qiáng)度和b)確定這些NIR熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，禾口c)使這些強(qiáng)度與ROI，例如實(shí)體瘤中標(biāo)記抗體的量相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于確定在使用所述藥物組合物治療的過程中在目的區(qū)域內(nèi)與MR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的單克隆抗體量的變化的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于確定在使用所述藥物組合物治療的過程中在實(shí)體瘤中與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的單克隆抗體量的變化的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于確定在與所述非標(biāo)記單克隆抗體共同施用的過程中與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的單克隆抗體量的變化的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包括所述用于癌癥，優(yōu)選實(shí)體瘤的第一次治療的藥物組合物和用于第二次'治療的僅包括非標(biāo)記單克隆抗體的組合物的容器，所述藥物組合物包括a)與人跨膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體和b)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體，其中非標(biāo)記標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少1:9。圖l.用于體內(nèi)靶標(biāo)表達(dá)分析的光學(xué)成像在H322Ms.c模型中，被Cy5.5標(biāo)記的針對(duì)IGFlR的mab以100微克/小鼠的單次劑量i.v.注射，并在其后2(圖la)和5天(圖lb)測(cè)量NIRF信號(hào)。收集時(shí)間是3秒。這些圖像顯示i)腫瘤細(xì)胞表達(dá)有關(guān)的表面分子，ii)mab定位于腫瘤組織和iii)mab在靶組織中隨時(shí)間累積。，圖2.用于體內(nèi)抗體藥物動(dòng)力學(xué)研究的光學(xué)成像針對(duì)IGF1R的抗體以50微克/小鼠注射(單次劑量)給具有s.c.H322M腫瘤(圖2a)和無該腫瘤(圖2b)的小鼠。在應(yīng)用抗體后4天，以4秒的收集時(shí)間測(cè)量NIRF。圖2a表示在腫瘤攜帶小鼠中，Cy5.5-標(biāo)記的mab耙向腫瘤組織，而在無腫瘤的小鼠中，mab"照亮"整個(gè)小鼠顯示mab局限于血漿室內(nèi)(圖2b)。因此，無腫瘤小鼠中的mab血清水平(由Elisa測(cè)量的)與腫瘤攜帶小鼠相比更高(圖2c)。圖3.抗體腫瘤濃度與血清濃度的相關(guān)性對(duì)攜帶H460M2腫瘤s.c.的小鼠i.v.注射單次劑量(50嗎)的用Cy5.5標(biāo)記的針對(duì)IGF1R的抗體。在其后不同的時(shí)間點(diǎn)(方塊)，以4秒的收集時(shí)間測(cè)量NIR熒光強(qiáng)度(中值NIR熒光(NIRF)信號(hào)強(qiáng)度[任意單位])。NIR熒光強(qiáng)度通過計(jì)算目的區(qū)域(ROI)內(nèi)像素的數(shù)量和信號(hào)強(qiáng)度的總和量化(方塊和實(shí)線)。平行地，所述用Cy5.5標(biāo)記(ng/ml)的針對(duì)IGF1R的抗體的血清水平(三角形和虛線)通過ELISA測(cè)量。數(shù)據(jù)顯示，NIR熒光強(qiáng)度對(duì)比血清水平的比隨時(shí)間增加，這說明mab在腫瘤組織累積(圖3)且腫瘤組織中的抗體濃度或抗體濃度的半衰期顯著長于血清中的。圖4.利用標(biāo)記的抗體和非標(biāo)記抗體的組合物檢測(cè)有關(guān)腫瘤相關(guān)抗原結(jié)果顯示最強(qiáng)的NIR熒光信號(hào)在單次注射50)igCy5-標(biāo)記的抗-HER2-抗體/小鼠后產(chǎn)生(圖4a)。單次丄v.注射比例為1:2(17)ig和33pg)的Cy5-標(biāo)記的抗-HER2-抗體和非標(biāo)記的抗-HER2-抗體的混合物后，表達(dá)Her的腫瘤的檢測(cè)是明顯可檢測(cè)的(圖4b)。圖4c表明注射比例為l:9(5pg和45|ag)的Cy5-標(biāo)記的抗-HER2-抗體和非標(biāo)記的抗-HER2-抗體的混合物產(chǎn)生顯著的NIR熒光信號(hào)。這說明比例為l:9的標(biāo)記的和非標(biāo)記的治療性抗體的組合可用于應(yīng)用在臨床情形中。提供以下實(shí)施例和附圖幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍如所附權(quán)利要求所示。應(yīng)該理解在不偏離本發(fā)明精神的條件下可以對(duì)上述程序進(jìn)行改進(jìn)。實(shí)施例介紹目前的研究檢査與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體以及與NIRF-標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體和所述無標(biāo)記的抗體的混合物在人異種移植模型中的體內(nèi)成像。研究的其他目的是確定體內(nèi)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體量的變化，和與相應(yīng)血清水平變化比較。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件已由患有炎性皮膚轉(zhuǎn)移和過表達(dá)ErbB家族受體的乳腺癌患者的惡性胸膜滲出液構(gòu)建人乳腺癌細(xì)胞系KPL-4。(Kurebayashi，J.,等，Br.J.Cancer(英國癌癥雜志)79(1999)707-17)在增補(bǔ)了10%胎牛血清(PAA)和2mML-谷氨酰胺(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(PAA實(shí)驗(yàn)室，奧地利)中，在37°C，在5%C02的水飽和空氣中常規(guī)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞。培養(yǎng)傳代用胰蛋白酶/EDTAlx(PAA)分裂2次/周進(jìn)行。細(xì)胞傳代P6用于體內(nèi)研究。動(dòng)物按照國際指導(dǎo)(GV-Solas;Felasa;TierschG)，將SCID米色(C.B,17)小鼠；年齡10-12周；體重18-20g(CharlesRiver,Sulzfeld,德國)維持在無特異性病原體條件下，每日12h白天/12h黑夜循環(huán)。到達(dá)后，將動(dòng)物飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的隔離區(qū)域一周，以使其習(xí)慣于新環(huán)境和用于觀察。有規(guī)律地進(jìn)行持續(xù)的健康監(jiān)測(cè)。隨意提供飲食食物(Alltromin)和水(酸化的pH2.5-3)。體內(nèi)腫瘤生長抑制研究由培養(yǎng)瓶(GrdnerTriFlask)中收獲腫瘤細(xì)胞(胰蛋白酶-EDTA)并轉(zhuǎn)移到50ml培養(yǎng)基中，清洗一次并重新混懸在PBS中。在另外用PBS清洗步驟和過濾(細(xì)胞濾網(wǎng)；Falcon100jim)后，將最終細(xì)胞滴定調(diào)節(jié)到0.75x108/ml。小心地用吸移管混合腫瘤細(xì)胞混懸液，以避免細(xì)胞聚集。在封閉循環(huán)系統(tǒng)中，利用用于小動(dòng)物的具有預(yù)溫育室(樹脂玻璃)，單個(gè)小鼠鼻照(硅)禾口Isoflurane(Pharmacia-Upjohn，德國)的Stephens吸入部件進(jìn)行麻醉。注射前2天，剃去動(dòng)物皮毛。關(guān)于乳房脂肪墊內(nèi)(i.m.f.p.)注射，以20的體積將細(xì)胞同位注射到每只麻醉的小鼠的右側(cè)倒數(shù)第二個(gè)腹股溝乳房脂肪墊中。為了同位移植，將細(xì)胞混懸液通過乳頭下的皮膚注射。腫瘤細(xì)胞注射對(duì)應(yīng)于實(shí)驗(yàn)的第一天。每日控制動(dòng)物，以檢測(cè)副作用臨床癥狀。為了在實(shí)驗(yàn)中始終進(jìn)行監(jiān)測(cè)，每周兩次記錄動(dòng)物的體重。確定腫瘤組織中標(biāo)記抗體的量和所述量在腫瘤組織中的半衰期近紅外信號(hào)的非入侵式測(cè)量可以通過用合適的染料標(biāo)記蛋白完成。例如，用Cy5或Cy5.5或Cy7染料標(biāo)記不同的單克隆抗體，從而監(jiān)測(cè)這些抗體在i.v.注射到攜帶腫瘤的小鼠后的腫瘤組織飽和狀態(tài)。NIR熒光測(cè)量在應(yīng)用抗體后立即和在其后不同時(shí)間點(diǎn)利用來自SiemensMedizintechnik，德國的BonSAI成像系統(tǒng)進(jìn)行。收集時(shí)間在整個(gè)觀察期內(nèi)保持恒定。通過計(jì)算目的區(qū)域內(nèi)像素平均強(qiáng)度的總和，繪制曲線下面積(AUC)。確定血清中標(biāo)記抗體的量和所述量在血清中的半衰期進(jìn)行通過確定的ELISA量化抗體血清水平，從而使這些結(jié)果與NIR熒光信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)聯(lián)。結(jié)果實(shí)施例l:用于體內(nèi)耙標(biāo)表達(dá)分析的光學(xué)成像在H322Ms.c(皮下)模型中，被Cy5.5標(biāo)記的針對(duì)IGFlR的mab以100微克/小鼠的單次劑量靜脈內(nèi)(i.v.)注射，并在其后2(圖la)和5天(圖lb)測(cè)量NIR熒光信號(hào)。收集時(shí)間是3秒。這些圖像顯示i)腫瘤細(xì)胞表達(dá)有關(guān)的表面分子，ii)mab定位于腫瘤組織和iii)mab在靶組織中隨時(shí)間累積。實(shí)施例2:用于體內(nèi)抗體藥物動(dòng)力學(xué)研究的光學(xué)成像針對(duì)IGF1R的抗體以50微克/小鼠(單次劑量)注射給攜帶s.c.H322M腫瘤的小鼠。在應(yīng)用抗體后4天，以4秒的收集時(shí)間測(cè)量NIR熒光。圖2a表示在腫瘤攜帶小鼠中，Cy5.5-標(biāo)記的mab靶向腫瘤組織，而在無腫瘤的小鼠中，mab"照亮"整個(gè)小鼠顯示mab局限于血漿室內(nèi)(圖2b)。因此，無腫瘤小鼠中的mab血清水平(由Elisa測(cè)量的)與腫瘤攜帶小鼠相比更高(圖2c)。實(shí)施例3:NIRF信號(hào)強(qiáng)度與血清水平的相關(guān)性對(duì)攜帶H460M2腫瘤s.c.的小鼠i.v.注射單次劑量的用Cy5.5標(biāo)記的針對(duì)IGF1R的抗體。在其后不同的時(shí)間點(diǎn)，以4秒的收集時(shí)間測(cè)量NIR熒光。MR熒光強(qiáng)度通過計(jì)算目的區(qū)域(ROI)內(nèi)像素的數(shù)量和信號(hào)強(qiáng)度的總和來量化。抗體的血清水平(ng/ml)通過ELISA測(cè)量。數(shù)據(jù)顯示，NIR熒光.與血清水平(富集因子)的比隨時(shí)間從31增加到79，這說明mab在腫瘤組織中累積(圖3)且腫瘤組織中的抗體濃度顯著長于血清中的。實(shí)施例4:利用標(biāo)記的抗體和非標(biāo)記抗體的組合物檢測(cè)有關(guān)腫瘤相關(guān)抗原用單次劑量Cy5-標(biāo)記的抗-HER2-抗體，以50pg/小鼠的劑量i.v.注射攜帶KPL-4腫瘤s.c.的SCID米色小鼠。另外，不同的小鼠組用50)ig/小鼠的以不同的比例的標(biāo)記的抗-Her2抗體和非標(biāo)記的抗體的混合物注射，所述不同比例為i)標(biāo)記的與非標(biāo)記的1:2的比例和ii)標(biāo)記的與非標(biāo)記的1:9的比例。其后2天，目的區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度以5秒的收集時(shí)間結(jié)果顯示最強(qiáng)的N1R熒光信號(hào)在單次注射50pg€乂5-標(biāo)記的抗-亞112-抗體/小鼠后產(chǎn)生(圖4a)。單次i.v.注射比例為1:2(17ng和33pg)的Cy5-標(biāo)記的抗-HER2-抗體和非標(biāo)記的抗-HER2-抗體的混合物后，表達(dá)Her的腫瘤的檢測(cè)是明顯可檢測(cè)的(圖4b)。圖4c表明注射比例為l:9(5嗎和45pg)的Cy5-標(biāo)記的抗-HER2-抗體和非標(biāo)記的抗-HER2-抗體的混合物產(chǎn)生顯著的NIR熒光信號(hào)。這說明比例為l:9的標(biāo)記和非標(biāo)記的治療性抗體的組合可用于應(yīng)用在臨床情形中。實(shí)施例5:NIRF信號(hào)強(qiáng)度與血清水平的相關(guān)性用單次劑量Cy5-標(biāo)記的抗Her2-抗體，以50)ig/小鼠的劑量i.v.注射攜帶KPL-4腫瘤s.c.的SCID米色小鼠。另外，不同的小鼠組用50pg/小鼠的以不同的比例的Cy5標(biāo)記的抗-HER2抗體和非標(biāo)記的抗-HER2抗體的混合物注射，所述不同比例為i)標(biāo)記的與非標(biāo)記的1:2的比例和ii)標(biāo)記的與非標(biāo)記的1:9的比例。在其后不同時(shí)間點(diǎn)，以5秒的收集時(shí)間測(cè)量NIR熒光信號(hào)。NIR熒光強(qiáng)度通過計(jì)算目的區(qū)域(ROI)內(nèi)像素的數(shù)量和信號(hào)強(qiáng)度的總和來量化?？贵w的血清水平(ng/ml)通過ELISA測(cè)量。實(shí)施例6:基于實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)標(biāo)記抗體的抗體濃度或NIRJF強(qiáng)度通過延長給藥間隔減少劑量(和藥物相關(guān)的副作用)測(cè)試試劑以處于組氨酸-HCl，a-a海藻糖(60mM),0.0l%Polysorb,pH6.0中的25mg/ml的儲(chǔ)液形式提供純曲妥單抗和用Cy-5標(biāo)記的曲妥單抗。為了注射，在PBS中適當(dāng)稀釋這兩種溶液。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件已由患有炎性皮膚轉(zhuǎn)移和過表達(dá)ErbB家族受體的乳腺癌患者的惡性胸膜滲出液構(gòu)建人乳腺癌細(xì)胞系KPL-4。(Kurebayashi，等，Br.J.Cancer(英國癌癥雜志)79(1999)707-17)在增補(bǔ)了10%胎牛血清(PAA)和2mML-谷氨酰胺(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(PAA實(shí)驗(yàn)室，奧地利)中，在37°C,在5%C02的水飽和空氣中常規(guī)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞。培養(yǎng)傳代用胰蛋白酶/EDTAlx(PAA)分裂2次/周進(jìn)行。細(xì)胞傳代P6用于體內(nèi)研究。動(dòng)物按照國際指導(dǎo)(GV-Solas;Felasa;TierschG)，將SCID米色(C.B,17)小鼠；年齡10-12周;體重18-20g(CharlesRiver,Sulzfeld，德國)維持在無特異性病原體條件下，每日12h白天/12h黑夜循環(huán)。到達(dá)后，將動(dòng)物飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的隔離區(qū)域一周，以使其習(xí)慣于新環(huán)境和用于觀察。有規(guī)律地進(jìn)行持續(xù)的健康監(jiān)測(cè)。隨意提供飲食食物(Alltromin)和水(酸化的pH2.5-3)。體內(nèi)腫瘤生長抑制研究由培養(yǎng)瓶(GreinerTriFlask)中收獲腫瘤細(xì)胞(胰蛋白酶-EDTA)并轉(zhuǎn)移到50ml培養(yǎng)基中，清洗一次并重新混懸在PBS中。在另外用PBS清洗步驟和過濾(細(xì)胞濾網(wǎng)；Falcon100ium)后，將最終細(xì)胞滴定調(diào)節(jié)到0.75x108/ml。小心地用吸移管混合腫瘤細(xì)胞混懸液，以避免細(xì)胞聚集。在封閉循環(huán)系統(tǒng)中，利用關(guān)于小動(dòng)物的Stephen's吸入部件，用預(yù)溫育室(樹脂玻璃)，單個(gè)小鼠鼻照(硅)禾nIsoflurane(Pharmacia-Upjohn，德國)進(jìn)行麻醉。注射前2天，剃去動(dòng)物皮毛。關(guān)于乳房脂肪墊內(nèi)(i.m.f.p.)注射，以20^tl的體積將細(xì)胞同位注射到每只麻醉的小鼠的右側(cè)倒數(shù)第二個(gè)腹股溝乳房脂肪墊中。為了同位移植，將細(xì)血混懸液通過乳頭下的皮膚注射。腫瘤細(xì)胞注射對(duì)應(yīng)于實(shí)驗(yàn)的第一天。每日控制動(dòng)物，以檢測(cè)副作用臨床癥狀。為了在實(shí)驗(yàn)始終進(jìn)行監(jiān)測(cè)，每周兩次記錄動(dòng)物的體重，且每周兩次通過測(cè)徑器測(cè)量腫瘤體積。按照NCI方案計(jì)算原發(fā)腫瘤體積(TV-1/2ab2,其中a和b是腫瘤尺寸的長和短直徑，以mm為單位,TeicherB.Anticancerdrugdevelopmentguide(抗癌藥物發(fā)展指導(dǎo))，HumanaPress,1997,第5章，第92頁)。計(jì)算值記錄為平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。動(dòng)物的處理當(dāng)腫瘤體積大約100mmS時(shí)，權(quán)機(jī)化攜帶腫瘤的小鼠(對(duì)于每組n-10)。每組在處理前接近匹配，其在腫瘤細(xì)胞注射后20天開始。組A:賦形劑組-每周腹膜內(nèi)(i.p.)接受10ml/kgPBS緩沖液一次。組B:曲妥單抗以30mg/kg加載劑量i.p.施用，隨后進(jìn)行每周一次給藥15mg/kg(維持劑量)。組C:處于預(yù)定比例9:1的曲妥單抗和Cy-5標(biāo)記的曲妥單抗的組合物，以30mg/kg加載劑量i.p.施用。在其后不同的時(shí)間點(diǎn)(通常每日一次)，以收集時(shí)間IO秒測(cè)量MR熒光信號(hào)。NIR熒光強(qiáng)度通過計(jì)算實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)像素?cái)?shù)量和信號(hào)強(qiáng)度的總和首先依從時(shí)間確定NIR熒光強(qiáng)度的最大值。然后，將關(guān)于第一次維持給藥15mg/kg單獨(dú)的非標(biāo)記曲妥單抗的時(shí)間點(diǎn)確定為當(dāng)NIR熒光強(qiáng)度與所述最大值相比減少10%時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。然后，加載給藥和第一次維持給藥之間的時(shí)間間隔用作連續(xù)維持給藥之間的一般給藥間隔。然后，以這樣的一般劑量進(jìn)行連續(xù)維持給藥15mg/kg單獨(dú)的非標(biāo)記曲妥單抗。組D:處于預(yù)定比例9:1的曲妥單抗和Cy-5標(biāo)記的曲妥單抗的組合物，以30mg/kg加載劑量i.p.施用。在其后不同的時(shí)間點(diǎn)(通常每日一次)，以收集時(shí)間IO秒測(cè)量NIR熒光信號(hào)。NIR熒光強(qiáng)度通過計(jì)算實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)像素?cái)?shù)量和信號(hào)強(qiáng)度的總和首先依從時(shí)間確定NIR熒光強(qiáng)度的最大值。然后，將關(guān)于第一次維持給藥15mg/kg單獨(dú)的非標(biāo)記曲妥單抗的時(shí)間點(diǎn)確定為當(dāng)NIR熒光強(qiáng)度與所述最大值相比減少20%時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。然后，加載給藥和第一次維持給藥之間的時(shí)間間隔用作連續(xù)維持給藥之間的一般給藥間隔。然后，以這樣的一般劑量進(jìn)行連續(xù)維持給藥15mg/kg單獨(dú)的非標(biāo)記曲妥單抗。組E:處于預(yù)定比例9:1的曲妥單抗和Cy-5標(biāo)記的曲妥單抗的組合物，以30mg/kg加載劑量i.p.施用。在其后不同的時(shí)間點(diǎn)(通常每日一次)，以收集時(shí)間IO秒測(cè)量NIR熒光信號(hào)。NIR熒光強(qiáng)度通過計(jì)算實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)像素?cái)?shù)量和信號(hào)強(qiáng)度的總和首先依從時(shí)間確定NIR熒光強(qiáng)度的最大值。然后，將關(guān)于第一次維持給藥15mg/kg單獨(dú)的非標(biāo)記曲妥單抗的時(shí)間點(diǎn)確定為當(dāng)NIR熒光強(qiáng)度與所述最大值相比減少30%時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。然后，加載給藥和第一次維持給藥之間的時(shí)間間隔用作連續(xù)維持給藥之間的一般給藥間隔。然后，以這樣的一般劑量進(jìn)行連續(xù)維持給藥15mg/kg單獨(dú)的非標(biāo)記曲妥單抗。然后，比較組B和組C的治療應(yīng)答，從而選擇最優(yōu)化的、延長的給藥間隔，其中治療應(yīng)答與組B的相當(dāng)(不管較低劑量，其大概導(dǎo)致較少的藥物相關(guān)副作用)。權(quán)利要求1.藥物組合物，包括a)與人跨膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記單克隆抗體和b)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體，其中非標(biāo)記抗體和標(biāo)記抗體的預(yù)定比例為至少1∶9。2.按照權(quán)利要求1的藥物組合物其中所述非標(biāo)記抗體和標(biāo)記的抗體是與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的治療性單克隆抗體，且其中所述過表達(dá)與腫瘤疾病有關(guān)；和且其中所述非標(biāo)記抗體:標(biāo)記抗體的預(yù)定比例是至少9:1和最多100:1。3.按照權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于所述腫瘤相關(guān)蛋白選自由下列各項(xiàng)組成的組:EGFR,HER2/neu,HER3，HER4,Ep-CAM,CEA，TRAIL,TRAIL-受體1,TRAIL-受體2，淋巴毒素-卩受體，CCR4,CD19，CD20,CD22,CD28,CD33，CD40,CD80,CSF-1R,CTLA-4,成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)，hepsin,黑素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP),前列腺特異性膜抗原(PSMA),VEGF受體1,VEGF受體2，IGF1-R,TSLP-R,TIE-l,TIE-2，TNF-a，TNF樣弱凋亡誘導(dǎo)劑(TWEAK),IL-1R,優(yōu)選EGFR,HER2/neu,CEA，CD20,或IGF1陽R。4.權(quán)利要求2的非標(biāo)記單克隆抗體在制備用于治療癌癥的權(quán)利要求2的藥物組合物中的用途。5.按照權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述癌癥是實(shí)體瘤。6.權(quán)利要求2的非標(biāo)記單克隆抗體在制備用于第一次腫瘤治療的權(quán)利要求2的藥物組合物中的用途，其特征在于當(dāng)實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體信號(hào)強(qiáng)度是第一次治療后測(cè)量的實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)最大信號(hào)強(qiáng)度的80%時(shí)，進(jìn)行使用第二藥物組合物的第二次腫瘤治療，所述第二藥物組合物包括非標(biāo)記單克隆抗體而不包括標(biāo)記的單克隆抗體。7.用于第一次腫瘤治療的權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于當(dāng)實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的抗體信號(hào)強(qiáng)度是第一次治療后測(cè)量的實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)最大信號(hào)強(qiáng)度的80%時(shí)，進(jìn)行使用第二藥物組合物的第二次腫瘤治療，所述第二藥物組合物包括非標(biāo)記單克隆抗體而不包括標(biāo)記的單克隆抗體。8.用于第一次腫瘤治療的按照權(quán)利要求2的藥物組合物和包括非標(biāo)記單克隆抗體而不包括標(biāo)記單克隆抗體的用于第二次腫瘤治療的藥物組合物。9.容器，包括a)用于第一次腫瘤治療的按照權(quán)利要求2的藥物組合物；和b)用于第二次腫瘤治療的藥物組合物，其包括與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記的治療性單克隆抗體，而不包括標(biāo)記的所述治療性單克隆抗體。10.與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記治療性單克隆抗體在制備用于治療癌癥，優(yōu)選實(shí)體瘤的藥物組合物中的用途，其特征在于以非標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體至少9:1和最大100:1的預(yù)定比例將所述非標(biāo)記的單克隆抗體和與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體共同施用。11.與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記治療性單克隆抗體在制備用于治療患有過表達(dá)所述腫瘤相關(guān)蛋白的實(shí)體瘤的患者的藥物中的用途，其中所述非標(biāo)記的抗體和與MR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體被共同施用。12.按照權(quán)利要求7的用途，其特征在于獲得所述患者的NIR熒光圖像。13.按照權(quán)利要求7的用途，其特征在于測(cè)量實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體的NIR熒光信號(hào)。14.與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的非標(biāo)記治療性單克隆抗體，其用于治療患有過表達(dá)所述腫瘤相關(guān)蛋白的實(shí)體瘤的患者其中所述非標(biāo)記的抗體和與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的所述抗體共同施用。15.獲得患者的NIR熒光圖像的方法，所述患者患有過表達(dá)腫瘤相關(guān)蛋白的實(shí)體瘤并接受了按照權(quán)利要求2的藥物組合物的給藥，其中測(cè)量實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)與過表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的標(biāo)記的治療性單克隆抗體的NIR熒光信號(hào)。16.用于確定治療性單克隆抗體的MR熒光信號(hào)的方法，所述治療性單克隆抗體為在接受了按照權(quán)利要求2的藥物組合物治療的患者的實(shí)體瘤區(qū)域內(nèi)與NIR熒光標(biāo)記共價(jià)偶聯(lián)的治療性單克隆抗體。全文摘要本發(fā)明涉及針對(duì)人跨膜蛋白的標(biāo)記的和非標(biāo)記的單克隆抗體的組合物，其用于同時(shí)治療和診斷與過表達(dá)所述蛋白有關(guān)的疾病，特別是癌癥。本發(fā)明還涉及這樣的方法，所述方法是首先施用所述組合物，確定標(biāo)記的抗體濃度的變化和然后僅施用非標(biāo)記的單克隆抗體以使得在治療中獲得并維持所述非標(biāo)記抗體獲得有利治療功效的最小需要濃度，同時(shí)由于較低的全身抗體濃度而最小化不利的副作用。文檔編號(hào)C07K16/00GK101636412SQ200880008973公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2008年3月27日優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日發(fā)明者維爾納·朔伊爾,赫爾穆特·楞次申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司