專利名稱：單克隆抗體Fab'－平陽霉素偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及以一種單克隆抗體作為載體，偶聯(lián)攜帶抗腫瘤藥物進行抗腫瘤治的方法。
單克隆抗體(單抗)3A5是以人肝癌BEL-7402細胞免疫LOU/C大鼠后取其脾細胞與大鼠骨髓瘤IR983F細胞融合，經篩選，克隆后所得雜交瘤細胞株分泌的抗體。
據報道，小鼠單克隆抗體Fab’片段有較完整抗體更強的組織穿透力，易于到達腫瘤組織深部(Cancer Research 1991，516363)，有利于腫瘤診療。但大鼠單抗未見相似報道。以胃蛋白酶消化大鼠不同類型單抗，可獲得單抗F(ab)’2片段，但其免疫學活性和Fab’片段的制備方法及其與藥物偶聯(lián)物的研究(Journal of Immunologic methods 1983，64141)均未見報道。有報道認為，單抗3A5與多種腫瘤細胞有強免疫反應性，其與平陽霉素偶聯(lián)物體外對肝癌BEL-7402細胞具有選擇性殺傷作用(中華微生物與免疫學雜志1991；11230)。動物實驗表明該偶聯(lián)物腔內給藥可明顯延長動物生存時間(藥學學報1997；32669)，但未見3A5活性片段與平陽霉素偶聯(lián)物的報道。抗人肺癌單抗3D3與平陽霉素以分子比1∶68相偶聯(lián)后在體外對人肺腺癌細胞的殺傷作用比游離平陽霉素強5倍，但未見動物實驗的報道(中國腫瘤臨床1996；23437)。3A5以木瓜蛋白酶降解可獲得Fab片段(藥學學報1993；28260)其與平陽霉素偶聯(lián)物及Fab’的制備則未見報道。綜上所述，迄今為止，大鼠單抗Fab’片段的制備及其與平陽霉素偶聯(lián)物的研究國內外均無報道。本項發(fā)明的研究表明，以適當的方法可以獲得有活性的單抗Fab’片斷，其與平陽霉素偶聯(lián)物對實驗動物腫瘤有顯著療效，有可能成為一種新的腫瘤治療藥物。
本發(fā)明的目的是以合適的方法制備單抗3A5Fab’片段，并將此片斷與平陽霉素相偶聯(lián)，用于臨床治療腫瘤。本項發(fā)明的內容與要點是1.單抗3A5Fab’的制備 單抗3A5用0.2mol/L的檸檬酸緩沖液調整為1-2mg/ml，pH3.7.加入適量胃蛋白酶，37℃反應6小時，產物經SephadexG-150層析純化獲得F(ab)’2。6-10mg/ml在pH7.5時可經5mmol/L二巰基蘇糖醇(DTT)還原，產物經DE-52陰離子交換層析得Fab’，其分子量約55Kd，其結構包含Fab與部分鉸鏈區(qū)。經酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，保持了對人肝癌BEL-7402細胞的免疫反應性(圖1)。小鼠抗IV型膠原酶單抗3D6，以無花果蛋白酶消化產生F(ab)’2，經β-巰基乙醇還原獲得Fab’，也保持了對IV膠原酶的免疫反應性(圖2)。
2.Fab’與平陽霉素偶聯(lián)物制備 將葡聚糖T-40(Dextran T-40)以高碘酸鈉氧化，透析，冷凍干燥，得多醛基葡聚糖(PAD)。按重量比1∶2取PAD與平陽霉素共溶于適量磷酸鹽緩沖液(PBS)中，4℃避光反應12小時后，加入與PAD等摩爾數的Fab’，繼續(xù)反應12小時。以適量硼氫化鈉還原2小時。產物經Sephadex G-100層析純化，收集既有抗體活性又有抑菌活性部分，即為偶聯(lián)物。
3.偶聯(lián)物對細胞的殺傷作用 體外培的人體肝癌細胞BEL-7402和口腔鱗癌KB細胞，用克隆形成法測定，藥物作用1小時。結果平陽霉素對兩種細胞均有殺傷作用，抑制50％克隆形成的濃度(IC50)分別為0.51μmol/L和0.47μmol/L；偶聯(lián)物對兩種細胞IC50分別為0.02μmol/L和0.50μmol/L。表明偶聯(lián)物對BEL-7402細胞具有一定選擇性殺傷作用(圖3，圖4)。
4.偶聯(lián)物腹腔注射對小鼠結腸癌的療效 取結腸癌26瘤組織，按1∶3加入生理鹽水研磨成勻漿，按0.2ml/只接種子BALB/c小鼠腋窩皮下；接種24小時后經腹腔內注射(ip)給藥，對照組給予生理鹽水，14天后處死動物，取腫瘤稱重，計算抑瘤率。結果表明，平陽霉素和偶聯(lián)物對結腸癌26均有療效，抑瘤率分別為56％和77％，二者有顯著差異(表1)。
表1偶聯(lián)物腹腔內注射對小鼠結腸癌26的抑制作用劑量 動物數 體重(g) 瘤重(g)抑瘤率(mg/kg×次數) 開始/結束開始/結束 x±SD (％)對照 10/10 18.8/21.71.59±0.35平陽霉素5×6 10/10 18.8/20.30.71±0.4l 56*偶聯(lián)物 5×6 10/10 18.9/20.20.37±0.07 77*△皮下接種腫瘤，腹腔給藥，兩天一次；* P＜0.01與對照比較△△P＜0.01與平陽霉素組比較5.偶聯(lián)物靜脈注射給藥(iv)對小鼠結腸癌26的療效 接種方法同前所述，給藥方式為靜脈注射。動物不處死，每3天記錄體重和測瘤體積，按瘤重(mg)＝l/2長徑×短徑2計算瘤重，繪制腫瘤生長曲線并觀察動物生存時間。研究結果表明，偶聯(lián)物靜脈注射給藥對腸癌26有顯著療效，其抑瘤率分別為89％(5mg/Kg)和91％(10mg/Kg)；而游離平陽霉素在相同劑量時抑瘤率分別為70％和79％。偶聯(lián)物也可顯著延長動物存活時間(表2，表3)。
表2 偶聯(lián)物靜脈注射對小鼠結腸癌26的抑制作用劑量動物數體重(g)瘤重(g)抑瘤率(mg/kg×次數) 開始/結束 開始/結束x±SD (％)對照 10/1021.6/22.8 0.77±0.22平陽霉素 5×710/1020.9/20.4 0.23±0.09 70*10×710/1021.1/19.3 0.16±0.34 79*偶聯(lián)物 5×710/1020.9/20.3 0.09±0.02 89*△10×710/1021.4/20.4 0.07±0.02 91*△△皮下接種腫瘤，靜脈給藥，兩天一次；* P＜0.01與對照比較△ P＜0.01與平陽霉素5mg/kg組比較△△P＜0.01與平陽霉素10mg/kg組比較表3 靜脈注射給藥動物生存情況劑量 動物數 生存期中位數 生存期中位數(mg/kg×次數) (只) (天) 增加百分數(％)對照 1017平陽霉素 5×710297110×7103394偶聯(lián)物 5×710307610×71038 1246.偶聯(lián)物毒性 偶聯(lián)物與平陽霉素腹腔注射給藥(5mg/kg×6)對小鼠結腸癌抑瘤率分別為56％和77％，經病理組織學檢查，心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸及股骨均未見毒性病變。
本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果是確定了大鼠單抗Fab’制備方法并為單抗與平陽霉素偶聯(lián)物用于治療腫瘤提供了必要的依據。平陽霉素已在臨床應用多年，有較好療效，而其與單抗Fab’偶聯(lián)物對實驗動物腫瘤具有明顯優(yōu)于等劑量游離平陽霉素的療效，預計將可能用于臨床腫瘤治療，并取得良好的效果。


圖1單抗3A5Fab’對BEL-7402細胞免疫反應性其中橫坐標為抗體濃度縱坐標為490吸光值1為3A52為3A5Fab’圖2單抗3D6Fab’對IV膠原酶的免疫反應性其中橫坐標為抗體濃度縱坐標為490吸光值1為3D62為3D6Fab’圖3平陽霉素及偶聯(lián)物對BEL-7402細胞的殺傷作用其中橫坐標為藥物濃度(umol/l)縱坐標為克隆形成率(％)1為平陽霉素2為偶聯(lián)物圖4平陽霉素及偶聯(lián)物對KB細胞的殺傷作用其中橫坐標為藥物濃度(umol/l)縱坐標為克隆形成率(％)1為平陽霉素2為偶聯(lián)物
權利要求
1.單克隆抗體Fab′-平陽霉素偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是所說的抗腫瘤作用的實施包括以下步驟A.單克隆抗體3A5 Fab′活性片段的制備；B.3A5Fab′-平陽霉素偶聯(lián)物的制備C.3A5Fab′-平陽霉素偶聯(lián)物的抗腫瘤作用的檢測
2.按照權利要求1所述的偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是所說的3A5Fab′是以胃蛋白酶消化單抗3A5產生F(ab)′2，再以二巰基蘇糖醇(DTT)還原，產生Fab′，其結構包含Fab與部分絞鏈區(qū)；單抗3D6以無花果蛋白酶消化產生F(ab)′2，經β-巰基乙醇還原獲得Fab′。
3.按照權利要求1所述的偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是Fab′-平陽霉素偶聯(lián)物的制備是將葡聚糖T-40氧化成多醛基葡聚糖(PAD)，先加入平陽霉素，再加入Fab′繼續(xù)反應，經硼氫化鈉還原，純化得到產物。
4.按照權利要求1所述的偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是體外培養(yǎng)人體肝癌細胞BEL-7402和口腔鱗璃KB細胞，用克隆形成法檢測游離平陽霉素及其偶聯(lián)物的細胞殺傷作用。
5.按照權利要求1所述的偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是動物體內試驗，在BALB/c小鼠皮下接種結腸癌26，通過腹腔內和靜脈注射給藥判斷游離平陽霉素及其偶聯(lián)物的抑瘤率。
全文摘要
抗人肝癌BEL－7402細胞單克隆抗體3A5,以適當方法獲得其活性Fab'片段;以葡聚糖T－40作中介體,將Fab'與平陽霉素相偶聯(lián),體外實驗用培養(yǎng)的人體肝癌BEL－7402細胞和口腔鱗癌KB細胞,克隆形成法檢測,偶聯(lián)物對二者有殺傷作用,抑制50%克隆形成的濃度分別為0.02μmol/L和0.5μmol/L,體內實驗用結腸癌26,取結腸癌26瘤組織加生理鹽水勻漿接種于Balb/C小鼠腋窩皮下,24小時后給藥,抑瘤率分別為77%(ip 5mg/kg×6,兩天一次)和89%(iv 5mg/kg×7,兩天一次)或91%(iv 10mg/kg×7,兩天一次),同時動物存活時間明顯延長,其效果優(yōu)于等劑量游離平陽霉素,為單克隆抗體Fab'與平陽霉素偶聯(lián)物用于治療腫瘤提供了依據。
文檔編號C07K16/00GK1255378SQ9911080
公開日2000年6月7日 申請日期1999年7月21日 優(yōu)先權日1999年7月21日
發(fā)明者甄永蘇, 劉小云, 王維剛, 劉秀均 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所