專利名稱：生產(chǎn)流感疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及一種工業(yè)規(guī)模的方法，其用于生產(chǎn)預(yù)防、診斷、免疫治療或治療目的用的流感病毒或者抗原。特別地，本發(fā)明提供一種了用于流感疫苗生產(chǎn)和更特別用于含有流感類型A和B的人疫苗生產(chǎn)的衍生自馬-達(dá)氏犬腎(Madin-Darby Canine Kidney)(MDCK)的、基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，通過在含胚的雞蛋中生長疫苗病毒株來生產(chǎn)商用流感疫苗。從尿囊液中收集該病毒并進(jìn)行加工來制造疫苗。但是，該方法的缺點(diǎn)是勞動密集且每個雞蛋的產(chǎn)量低，這些因素在流行病發(fā)期間會存在嚴(yán)重的限制。因此需要克服含胚雞蛋法的費(fèi)用、時間和產(chǎn)量方面的缺點(diǎn)，大規(guī)模生產(chǎn)流感病毒疫苗。
一種上述方法的備選方法涉及使用細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)流感病毒顆?；蛘卟《镜鞍?。
據(jù)信用細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的流感疫苗比雞蛋中生產(chǎn)的那些要更安全，并且不會誘導(dǎo)兒童和成人受到的對雞蛋基疫苗的超敏性。由于據(jù)認(rèn)為在細(xì)胞培養(yǎng)中病毒復(fù)制的忠實(shí)性優(yōu)于在雞蛋中，因此這樣的疫苗賦予對更廣譜的野生株的更好的保護(hù)作用，尤其是在老齡群體中(Katz，J.M.，等，J.Infect Diseases 160191，1989)。此外，在流行病發(fā)或者全國流行病發(fā)的時候，可以提供比因目前可能的雞蛋供應(yīng)限制更多的流感疫苗供應(yīng)。
已經(jīng)在許多組織培養(yǎng)系統(tǒng)中證實(shí)了流感A和B病毒的繁殖，這些系統(tǒng)包括切碎的雞胚胎，人胚胎肺和腎，猴腎和牛胚胎腎。
特別地，盡管產(chǎn)量低，即不足以滿足疫苗生產(chǎn)目的，犬腎細(xì)胞被建議用于生產(chǎn)流感病毒。
犬腎細(xì)胞最初在1958年由S.H.Madin和N.B.Darby得自表面正常的成年雌性Cocker Spaniel的腎(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Catalogue of Cell Lines and Hybridomas，7th edition，p.21，1992)。MDCK細(xì)胞系于1964年保藏(No.CCL 34)在ATCC，并且被鑒定為容許包括水泡性口炎癥、牛痘、柯薩奇病毒、呼腸孤病毒和腺病毒在內(nèi)的幾種病毒的復(fù)制。
流感病毒類型B的系列繁殖在1962年首先在MDCK細(xì)胞系中由Green得到證實(shí)(Science 13842，1962)。繁殖的證據(jù)是細(xì)胞病變效應(yīng)和流感病毒的主要糖蛋白血凝素(HA)出現(xiàn)在6個連續(xù)組織培養(yǎng)途徑的每一個中，以及通過組織培養(yǎng)流體中的蛋-感染力滴度得以證實(shí)。然而，這些數(shù)據(jù)限制于小規(guī)模且不提供實(shí)現(xiàn)疫苗目的的病毒顆?；蛘叩鞍椎拇笠?guī)模生產(chǎn)。Gaush等在1966年證實(shí)MDCK細(xì)胞還對流感病毒A感染敏感。然而，該文章僅僅報道了感染性并且并沒有提到病毒在此培養(yǎng)基中的繁殖問題(Gaush等，Proc.Soc.Exp.Biol.and Med.，122931，1966)。
在1975年，Tobita等首先描述了在含胰蛋白酶的涂覆培養(yǎng)基中建立的MDCK細(xì)胞系中多種流感A病毒的生長。盡管存在以前的傳代，該病毒繁殖仍然形成了界限分明的菌斑，而且據(jù)建議，胰蛋白酶切割HA多肽并因此加速了流感病毒的成熟。但是盡管使用提供的胰蛋白酶有如此優(yōu)點(diǎn)，在瓊脂培養(yǎng)基中分離該病毒無法提供實(shí)現(xiàn)大規(guī)模病毒生長的手段。在相同的文獻(xiàn)中，還成功地使用MDCK細(xì)胞從患者咽喉洗出物中初級分離流感A病毒。
隨后，Reuveny等在批培養(yǎng)物中纖維素基微載體上的MDCK細(xì)胞上生長流感病毒類型A(Develop.Biol.Standard 50115，1982)。得到的流感病毒滴度類似于含胚卵中含胰蛋白酶培養(yǎng)基中的滴度。
U.S.專利4,500,513(Brown等)描述了一種通過在病毒培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)物中包含入一種例如胰蛋白酶的蛋白水解酶而在相同液體培養(yǎng)物的連續(xù)數(shù)量的細(xì)胞中復(fù)制流感病毒的方法。
需要蛋白水解酶造成HA有功能并且從而克服過去液體培養(yǎng)技術(shù)的一步生長循環(huán)。這是對從液體細(xì)胞培養(yǎng)中“工業(yè)”生產(chǎn)流感疫苗可能的首次描述。
然而，目前考慮溶液中存在胰蛋白酶具有引起一定比例MDCK細(xì)胞被從其固體支持物中“提起”的缺點(diǎn)。因此，盡管該被專利保護(hù)的方法的潛在有效性，對胰蛋白酶的要求對流感疫苗的工業(yè)生產(chǎn)是一個嚴(yán)重的限制。因此仍然需要用于流感疫苗生產(chǎn)的工業(yè)的基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法。這一需求可以被如下Kodihalli等在(J.Virol.69(8)4888，1995)″Embryonatedchicken eggs are currently the only host in which sufficientquantities of virus can be cultivated economically and within theshort time necessary to ensure a vaccine supply″中的陳述所支持。
同樣在1995年，世界衛(wèi)生組織(WHO)公布了對發(fā)生在1995年夏天的討論的總結(jié)備忘錄，該領(lǐng)域的專家聚在一起評價與基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)流感疫苗相關(guān)的新近進(jìn)展(Bull.W.H.O.73(4)431，1995)。該文獻(xiàn)倡議進(jìn)一步工作以在容許快速遞增的細(xì)胞培養(yǎng)體系中實(shí)現(xiàn)快速生產(chǎn)大規(guī)模流感疫苗。
對于研究目的的細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒生長，MDCK和Vero細(xì)胞最常被認(rèn)為是幾種病毒的良好生產(chǎn)者。但是，對于大規(guī)模生產(chǎn)目的，幾種因素影響著對特殊細(xì)胞系選擇，例如對一種或者多種病毒的敏感性，病毒滴度的產(chǎn)出，貼壁依賴，致瘤性等等。
盡管MDCK細(xì)胞對幾種病毒株敏感，但是得到的較差的滴度可能限制了該細(xì)胞系在大規(guī)模生產(chǎn)目的中的有用性。
已經(jīng)對MDCK系的特性進(jìn)行了一些研究。在1970年，Leighton等(Cancer 261022)報道MDCK細(xì)胞在膠原涂覆的纖維素海綿上的三維組織培養(yǎng)物的組織病理學(xué)制劑中呈現(xiàn)乳頭狀腺癌的形態(tài)學(xué)模式。當(dāng)發(fā)現(xiàn)被注射到11或者12天齡小雞胚胎的細(xì)胞懸液產(chǎn)生許多腦轉(zhuǎn)移病灶的時候，證實(shí)了細(xì)胞系的致瘤性質(zhì)。
為了評價其被用于生產(chǎn)生物產(chǎn)品的合理性，細(xì)胞系的致瘤性評價是重要的。美國食品和藥品管理局的生物學(xué)評價和研究中心(The Center forBiologics Evaluation and Research of the US Food and DrugAdministration)公布了考慮將細(xì)胞培養(yǎng)物作為基質(zhì)用于生物學(xué)生產(chǎn)的評分(見Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Usedto Produce Biologicals，Office of Biologics Research and Review，Center for Drugs and Biologics，F(xiàn)DA(USA)，1993)。一個這樣的分是所用細(xì)胞系的致瘤性，并且FDA已經(jīng)設(shè)計了用于體內(nèi)致瘤性測試的指南。包括其它事情在內(nèi)，該指南還要求在裸鼠(nu/nu)內(nèi)通過皮下或者肌肉內(nèi)途徑給予來測試細(xì)胞。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明涉及一種用于大規(guī)模生產(chǎn)流感病毒顆?；蛘叩鞍椎姆椒?，其包括下列步驟a.生長能夠復(fù)制所述流感病毒的MDCK細(xì)胞系；b.用流感病毒細(xì)胞株感染MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物并培育以容許該病毒復(fù)制；c.收獲所述復(fù)制的病毒并且從其中純化病毒顆?；蛘叩鞍?。
本發(fā)明還提供了一種衍生自MDCK細(xì)胞系的細(xì)胞系，其對病毒感染高度敏感并且以高于其親本細(xì)胞系的滴度生產(chǎn)流感病毒。


圖1是本發(fā)明灌流裝置(perfusing means)中使用的傾析器的正面剖視圖；圖2是該傾析器的頂部正視圖；和圖3是該傾析器的底部正視圖。
發(fā)明詳述在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的MDCK衍生的細(xì)胞系允許流感病毒的多步復(fù)制。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的MDCK細(xì)胞系是貼壁依賴和非致瘤性的。
本發(fā)明提供了對病毒感染超敏感的MDCK克隆的衍生物。“超敏感”的描述被用來表明對至少一種病毒高度敏感、因而產(chǎn)生比親本MDCK細(xì)胞系更高病毒顆粒滴度的MDCK衍生的細(xì)胞系。MDCK.5F1這一衍生的克隆于1996年2月8日被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號CRL-12042。在一個實(shí)施方案中，在依照FDA指南進(jìn)行的測試中，本發(fā)明的MDCK衍生的細(xì)胞系是非致瘤的，并且因此可適用于制備用于預(yù)防、診斷、免疫治療或者治療目的的病毒或者抗原。已經(jīng)對該細(xì)胞系進(jìn)行了是否存在污染微生物的測試并且結(jié)果沒發(fā)現(xiàn)任何污染存在。
本發(fā)明還提供了一種用于大規(guī)模生產(chǎn)流感病毒顆?；蛘叩鞍子糜谝呙缟a(chǎn)的方法。
本發(fā)明的一個方面提供了大規(guī)模、細(xì)胞培養(yǎng)的、基于微載體的工業(yè)方法，該方法用于生產(chǎn)用來生產(chǎn)流感疫苗的流感病毒顆?；蛘叩鞍住?br> 本發(fā)明的方法通過使用用于流感病毒多重復(fù)制的MDCK細(xì)胞系來進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中使用的MDCK細(xì)胞系具有與ATCC細(xì)胞系No.CRL-12042的那些相同的生物學(xué)活性。在一個實(shí)施方案中，本方法使用的細(xì)胞系是內(nèi)部命名為MDCK.5F1、以保藏號ATCC CRL-12042保藏的MDCK細(xì)胞系克隆。
本發(fā)明的MDCK衍生的細(xì)胞系對病毒感染高度敏感。在此上下文中，對病毒感染“高度敏感”指的是該細(xì)胞系能夠?qū)χ辽僖环N病毒株產(chǎn)生比親本細(xì)胞系更高的滴度。
在一個實(shí)施方案中，“高敏感性”被定義為這樣的細(xì)胞系，其能夠生產(chǎn)的病毒滴度是親本細(xì)胞系生產(chǎn)的病毒滴度的大約1.2倍。在一個實(shí)施方案中，較高敏感的細(xì)胞系是選自由下列組成的組的克隆3B5，5F1，1D11，5H12，9C2，9D9，P79，9E9，7C1，和P123。
在又一個實(shí)施方案中，較高的敏感性被定義為這樣的細(xì)胞系，對于這些相同的病毒，其能夠生產(chǎn)的多個病毒的滴度是親本細(xì)胞系生產(chǎn)這些病毒的滴度的至少2倍。在一個實(shí)施方案中，該克隆選自由下列組成的組3B5，5F1，5H12，9C2，7C1，和P123。
在一個實(shí)施方案中，較高的敏感性被定義為這樣的細(xì)胞系，其能夠生產(chǎn)的相同病毒的2個不同株的滴度是親本病毒滴度的至少大約2倍。在一個實(shí)施方案中，該克隆能夠生產(chǎn)2倍的呼吸道合胞病毒和流感類型A和B的親本病毒滴度。在一個實(shí)施方案中，該克隆選自由下列組成的組5F1和5H12。
在一個實(shí)施方案中，該細(xì)胞系能夠被選自由下列組成組的病毒感染流感，呼吸道合胞病毒，乳多空病毒，副流感病毒，水泡性口炎，牛痘，柯薩奇病毒(Coxsackie)，呼腸孤病毒，細(xì)小病毒，腺病毒，脊髓灰質(zhì)炎，麻疹，狂犬病，皰疹，和其它病毒。
在一個實(shí)施方案中，病毒選自由下列組成的組流感類型A，B，和C；呼吸道合胞病毒；乳多空病毒；水泡性口炎(印度株)；柯薩奇病毒B-5；呼腸孤病毒類型2，和3；和腺病毒類型4，和5。
在一個實(shí)施方案中，病毒選自由下列組成的組流感類型A，B，和C，和呼吸道合胞病毒。
在一個實(shí)施方案中，病毒選自人、馬、豬或者禽類流感株。
在一個實(shí)施方案中，病毒選自人流感類型A，B或者C。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞系能被人流感病毒類型A或者B感染。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞系能夠被人流感病毒類型A和B感染。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞系容許添加蛋白水解酶的流感病毒的多步復(fù)制，所述的蛋白水解酶例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶和羧肽酶。在一個實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞系容許添加胰蛋白酶的流感病毒的多步復(fù)制。
或者，本發(fā)明的細(xì)胞系容許不需要添加蛋白水解酶的流感病毒的多步復(fù)制，所述的蛋白水解酶例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶和羧肽酶。在一個實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞系容許不需要添加胰蛋白酶的流感病毒的多步復(fù)制。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯知曉哪種病毒或者病毒株可能需要使用蛋白水解酶。
盡管可能在懸液中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞系，優(yōu)選其以貼壁依賴的方式生長。在一個實(shí)施方案中，其也能夠生長在微載體珠上，從而容許在細(xì)胞培養(yǎng)中獲得高密度的細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的MDCK衍生的細(xì)胞系是非致瘤的。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞系在軟瓊脂中以最小的效率生長(即＜1％效率)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞系在裸鼠中至少3個月觀察不到結(jié)節(jié)產(chǎn)生。
本發(fā)明還考慮將本發(fā)明的細(xì)胞系用來大量生長病毒顆?；蛘卟《镜鞍?。
這樣的病毒顆?；蛘叩鞍卓梢员挥脕砩a(chǎn)用于在宿主中預(yù)防病毒感染的疫苗。在一個實(shí)施方案中，所述的宿主是哺乳動物。哺乳動物包括例如人、馬、豬種類。在另一個實(shí)施方案中，所述的宿主是人。在另一個實(shí)施方案中，所述的宿主是禽類(例如雞或者鴨)。
本發(fā)明的方法可以在有或者沒有胰蛋白酶的存在的情況下進(jìn)行，只要胰蛋白酶的存在不影響貼壁依賴MDCK在培養(yǎng)物中生長的能力。在一個實(shí)施方案中，本方法在大約或者小于4μg/ml胰蛋白酶濃度存在時進(jìn)行?；蛘撸景l(fā)明可以在沒有胰蛋白酶存在時進(jìn)行。
本發(fā)明描述的方法意欲用于生產(chǎn)呼吸道合胞病毒以及許多流感病毒例如流感病毒的人、馬、豬和禽株。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明描述的方法意欲用于人流感類型A，B，或者C的生產(chǎn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明描述的方法意欲用于人流感類型A或者B的生產(chǎn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明描述的方法意欲通過使用可能被其任一類型病毒感染的MDCK細(xì)胞系用于人流感類型A或者B的生產(chǎn)。
本發(fā)明方法提供的產(chǎn)量范圍為4μg HA/106MDCK細(xì)胞。如實(shí)施例9所描述，該方法產(chǎn)出的病毒蛋白量高于4μgHA/106MDCK細(xì)胞，更特別地，范圍為9μg HA/106MDCK細(xì)胞。
“大規(guī)模方法”指的是用于生長大量流感病毒的過程。這樣的過程通常在生物反應(yīng)器中進(jìn)行而不是在培養(yǎng)瓶中。這樣的生物反應(yīng)器的大小不同，取決于需要的最終產(chǎn)量/劑量。例如，這樣的生物反應(yīng)器可以是大約5升大小(工作體積為大約4升)，或者，其可以高達(dá)5000升。當(dāng)然，大規(guī)?；诩?xì)胞培養(yǎng)的疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然會根據(jù)生物反應(yīng)器的大小調(diào)節(jié)所有反應(yīng)物、培養(yǎng)基、養(yǎng)分、細(xì)胞濃度、微載體濃度、灌流率等等。
本發(fā)明的方法可以在懸液培養(yǎng)中執(zhí)行，但是優(yōu)選在微載體裝置上進(jìn)行以增加細(xì)胞濃度(并從而增加病毒輸出)。例如，可以選擇本領(lǐng)域通常知曉的微載體珠如葡聚糖聚合物(CytodexTM)?？梢砸源蠹s10-25g/L的濃度范圍使用這些微載體。在一個實(shí)施方案中，所述微載體的濃度范圍是大約15-20g/L。
將灌流裝置引入以最大化所述方法中的細(xì)胞生長和病毒復(fù)制。灌流容許在恒定供應(yīng)養(yǎng)分的同時提供裝置來避免培養(yǎng)基中潛在毒性副產(chǎn)品的累積。通過灌流，養(yǎng)分的類型和量在所述過程的各種階段可以是變化的。例如，可以將血清在生長期引入到細(xì)胞中，但是理想地，血清應(yīng)該在細(xì)胞連片生長時和病毒引入前被清除。在細(xì)胞生長過程中逐步增加灌流流動率以提供足夠的養(yǎng)分供應(yīng)。在病毒復(fù)制過程中連續(xù)灌流。
取決于所述過程的階段，灌流率被調(diào)節(jié)到大約0.5到4生物反應(yīng)器體積/天。
將灌流裝置加入到生物反應(yīng)器。其包括將培養(yǎng)基連續(xù)引入生物反應(yīng)器的入口裝置和兩個將用過的培養(yǎng)基連續(xù)從生物反應(yīng)器中移除的出口裝置(從而使培養(yǎng)基連續(xù)流過生物反應(yīng)器中的微載體懸液)，以及與出口裝置相連的傾析器。這里描述和本發(fā)明方法中使用的傾析器是被特別設(shè)計用于5L(3.7L工作體積)生物反應(yīng)器的，這是因為意識到當(dāng)使用上面建議的灌流裝置并使用超過10g/L的微載體濃度時，細(xì)胞生長被微載體向上移動并且或逃出或阻塞出口裝置的趨勢所限制。因此，為了實(shí)現(xiàn)更高的微載體濃度，建造具有下列特點(diǎn)的傾析器，其能夠?qū)⒃趦A析器內(nèi)的湍流最小化并實(shí)現(xiàn)了快于懸液向上流動速度的微載體沉降速度。
按照本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，傾析器10示于圖1中，其含有通過輻板3連接到較大上室2的下室1。兩個出口裝置4連接到傾析器頂部的上室2。下室1和上室2的形狀是半圓柱體形并且環(huán)繞一個軸向中心的圓腔5，該腔意欲容納生物反應(yīng)器的中心轉(zhuǎn)軸以及各種引入生物反應(yīng)器來監(jiān)測反應(yīng)過程的各種探試器。固體的金屬壁將該傾析器整體配齊。
圖2圖解了上述元件2，4，和5的頂部正視圖。
圖3顯示了傾析器下室1的底部正視圖。該下室1具有多個規(guī)則分布的縱向通道6，這些通道被輻向縱向隔板7分開，這些縱向通道通過傾析器的上室2和輻板3相互連接。在一個實(shí)施方案中，縱向通道6是相同的并且每個都具有圓的橫截面。此外，多個縱向通道6規(guī)則分布在軸向中心圓腔5周圍，周圍的縱向通道6被輻向縱向隔板7相互分開。
在感染時，將灌流裝置的出口裝置由廢物槽轉(zhuǎn)換為收集器。連續(xù)收集直到復(fù)制完成(大約4-5天)。
本發(fā)明的方法是通過將病毒以10∶1-1∶1010的多重感染(multiplicityof infection)(M.O.I.)種植于MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物而進(jìn)行的。在一個實(shí)施方案中，該方法以1∶10-1∶108的M.O.I.進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，該方法以約1∶104-1∶107的M.O.I.進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，該方法以約1∶105-1∶106的M.O.I.進(jìn)行。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中MDCK細(xì)胞的生長在大約33-40℃下進(jìn)行大約7-10天。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中MDCK細(xì)胞的生長在大約36-38℃下進(jìn)行大約7天。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中MDCK細(xì)胞的生長在大約37℃下進(jìn)行大約7天。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中病毒復(fù)制在大約30-37℃下進(jìn)行大約4-6天。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中病毒復(fù)制在大約32-34℃下進(jìn)行大約5天。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中病毒復(fù)制在大約33℃下進(jìn)行。
以如下方法純化病毒顆?；蛘叩鞍?。病毒收獲物濾過后用甲醛使濾過物失活。隨后將所得到的失活病毒懸液離心并選擇富集的病毒級分用于疫苗制備。
還提供了一種用于在哺乳動物中預(yù)防流感感染的方法，包含給予本發(fā)明的疫苗的步驟。
還提供了一種方法，其中使用純化的病毒顆?；蛘叩鞍讈砩a(chǎn)用于檢測流感病毒感染的診斷試劑盒。
還提供了分離的大量病毒顆?；蛘叩鞍自谏a(chǎn)用來在哺乳動物中檢測和診斷流感病毒感染的試劑盒的應(yīng)用。
以下討論本發(fā)明的方法以及選擇的人流感病毒類型A和B的株的繁殖的具體實(shí)例。很明顯在不離開本發(fā)明精髓和范圍或者以喪失本發(fā)明重要優(yōu)點(diǎn)為代價的情況下，可以改變本發(fā)明的組成和安排方式，下面的描述僅僅是優(yōu)選的或者例舉性的實(shí)施方案。
實(shí)施例實(shí)施例1描述了克隆MDCK.5F1的衍生。實(shí)施例2涉及MDCK.5F1細(xì)胞系的純度。實(shí)施例3描述了在有和沒有胰蛋白酶時流感病毒在MDCK.5F1細(xì)胞系上的生長。實(shí)施例4是對MDCK.5F1致瘤性研究的總結(jié)。實(shí)施例5討論在用MDCK.5F1細(xì)胞懸液接種無胸腺裸鼠后的結(jié)果。實(shí)施例6逐步描述了所述方法的具體實(shí)施方案。實(shí)施例7描述了使用親本MDCK細(xì)胞和流感株A/Shanghai/11/87和胰蛋白酶進(jìn)行測試的結(jié)果。實(shí)施例8描述了使用MDCK.5F1細(xì)胞和流感株A/Shanghai/11/87但是沒有胰蛋白酶時進(jìn)行測試的結(jié)果。實(shí)施例9描述了使用MDCK.5F1細(xì)胞和流感株B/Harbin/7/94但是沒有胰蛋白酶時進(jìn)行測試的結(jié)果。
實(shí)施例1克隆MDCK.5F1衍生MDCK細(xì)胞No.CCL 34獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville，Maryland。收到1ml含3.4×106細(xì)胞的安瓿中冷凍狀態(tài)的貯存液。該細(xì)胞系在其第54代。
傳代后，在64代收集MDCK細(xì)胞并在有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中稀釋，所述的培養(yǎng)基由1∶1比例的Dulbecco改良的Eagel培養(yǎng)基(DMEM)和培養(yǎng)基199組成(DMEM-199)，其含有10％(v/v)的胎牛血清(FBS)。隨后將稀釋的細(xì)胞懸液等分到96孔板中，從而使每個孔接受少于1個細(xì)胞，認(rèn)為細(xì)胞均勻地分布在溶液中。將板置于37℃的二氧化碳孵箱中并且為了評價這些孔的生長得分，在光學(xué)顯微鏡下以每周的間隔對其進(jìn)行檢查。
在克隆中尋求的特性選自如下1.對病毒感染具有比親本細(xì)胞系更高的敏感性(即克隆比親本細(xì)胞系產(chǎn)生更高的病毒滴度)；2.對超過一種病毒的更高的敏感性(在一個實(shí)施方案中，對流感病毒的幾種株敏感)；3.容許流感病毒多步復(fù)制而不需要加入蛋白水解酶如胰蛋白酶的能力；和，任選地，
4.貼壁依賴(即在培養(yǎng)物中獲得更高細(xì)胞濃度)。
表1描述了在沒有加胰蛋白酶的情況下，幾種克隆對流感病毒類型A和B病毒感染的敏感性。
表1對流感類型A和B病毒感染的克隆敏感性

“高敏感的”被定義為當(dāng)用TCID50評價時，至少為親本細(xì)胞系敏感性的約1.2倍。克隆3B5，5F1，1D11，5H12，9C2，9D9，P79，9E9，7C1，和P123被鑒定為高度敏感?？寺?B5，5F1，1D11，5H12，9C2，9D9，7C1，和P123被鑒定為至少為親本細(xì)胞系敏感性的兩倍。
克隆5F1和5H12被選為兩種最高敏感的，5F1被選擇來建立內(nèi)部命名為MDCK.5F1的細(xì)胞系。
在克隆時，細(xì)胞世代數(shù)被定義為零，并且在每個隨后的細(xì)胞培養(yǎng)中通過細(xì)胞計數(shù)來計算世代數(shù)。培養(yǎng)物最初在多孔培養(yǎng)板中傳代并最后轉(zhuǎn)移到塑料燒瓶中。
另外，用呼吸道合胞病毒的實(shí)驗來測定親本MDCK細(xì)胞系和MDCK.5F1克隆對這種病毒感染的敏感性。病毒滴度表明雖然MDCK細(xì)胞系對病毒的感染要比呼吸道合胞病毒宿主Hep2細(xì)胞系敏感得多，但是MDCK.5F1克隆對該病毒感染的敏感性要比親本MDCK細(xì)胞系高大約10倍。
實(shí)施例2MDCK.5F1克隆性(clonality)的確定確定任何挑選的特殊克隆的克隆性的參數(shù)，是挑選了所述克隆的多孔板上的百分比生長。從該百分比確定被選培養(yǎng)物實(shí)際為純系的概率(即，P(l))(見Coller和Coller，Methods in Enzymology，vol.121，pp.412-417(Academic Press，1986).)。
由于在該克隆中5％的孔顯示生長，細(xì)胞系MDCK.5F1衍生自單細(xì)胞的概率是≥97.5％。
從MDCK.5F1細(xì)胞系制備299安瓿Master細(xì)胞庫(MCB)和283安瓿生產(chǎn)商的Working細(xì)胞庫(WCB)。這些庫按照加拿大的對食品生產(chǎn)實(shí)踐原則指南來制備，并且評價是否污染了真菌、酵母、支原體、細(xì)菌和病毒制劑。沒有發(fā)現(xiàn)任何一種污染。
從制備的細(xì)胞庫和細(xì)胞系中獲得持續(xù)、可存活的培養(yǎng)物，其被測定了WCB外50個種群對的產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性、形態(tài)學(xué)、致瘤性、和同工酶特性。結(jié)果顯示，所述細(xì)胞系的這些特性是穩(wěn)定的。
實(shí)施例3闡述MDCK.5F1克隆中的流感病毒在有和沒有添加胰蛋白酶時的生長的實(shí)驗進(jìn)行實(shí)驗以確定在有或者沒有胰蛋白酶存在的時候，流感病毒在克隆MDCK.5F1培養(yǎng)物中繁殖的能力。三個使用流感病毒株A/Johannesburg，A/Texas和B/Harbin的結(jié)果見表2。
表2有和沒有胰蛋白酶的MDCK.5F1克隆培養(yǎng)物中不同流感株的生長

這些結(jié)果揭示，如血細(xì)胞凝集(HA)滴度值所示，當(dāng)使流感病毒在有與沒有胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制時，沒有實(shí)質(zhì)差別。
實(shí)施例4體外致瘤性研究總結(jié)按照Furesz等(Develop.Biol.Stand.vol.70，pp.233-243，S.Kargel ed.，Basel，1989)描述的方法，將4ml含10％(v/v)FBS，0.6％瓊脂的DMEM-199培養(yǎng)基置于包含6個35mm直徑孔的組織培養(yǎng)皿中。安置后，用3ml含有0.3％W/V的保持在42℃的未膠凝的瓊脂和60,000細(xì)胞/ml細(xì)胞濃度的培養(yǎng)基覆蓋這些孔。將板在37℃用5％的二氧化碳培育。在3，7，10和14天進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。集落由4個或者多個在軟瓊脂中形成球狀組細(xì)胞組成。百分比效率通過用計算的細(xì)胞克隆數(shù)除以接種的總細(xì)胞數(shù)得到的比率來確定。
表3軟瓊脂中的克隆形成

表3的結(jié)果顯示MDCK.5F1細(xì)胞系在軟瓊脂中以最小的效率生長，這表明其在動物中是非致瘤的。這一性質(zhì)保留到18代以后，表明其表型是穩(wěn)定的。
為了進(jìn)一步支持這一非致瘤性的結(jié)果，我們還測試了MDCK.5F1細(xì)胞系在無胸腺裸鼠中的腫瘤形成潛力。
實(shí)施例5在用MDCK.5F1克隆細(xì)胞懸液皮下接種無胸腺裸鼠(nu/nu)后腫瘤形成評價裸(nu/nu)無胸腺小鼠不能發(fā)動細(xì)胞介導(dǎo)的指向外來物質(zhì)的應(yīng)答，因此將支持同種異型或者不同種(heterogeneic)腫瘤細(xì)胞系的生長。這樣容許評價接種物在體內(nèi)形成瘤的能力。
將大約1×107細(xì)胞的試驗樣品MDCK.5F1皮下注射接種給6周齡的雌性裸鼠，臨床隨診84天并且進(jìn)行尸檢。類似處理用陽性對照細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞接種的裸鼠。對接種點(diǎn)(皮膚)、肺、肩胛淋巴結(jié)和總損害進(jìn)行處理、切片、染色和顯微檢查。實(shí)驗的進(jìn)一步細(xì)節(jié)如下所示。
接種測試和對照材料對每只籠子中的所有小鼠進(jìn)行相同處理。
如下所描述，對每只小鼠經(jīng)皮下在肩胛骨之間接種0.2ml適當(dāng)?shù)慕臃N物。將22口徑的針用于接種并且所有動物在同一天接種。
組1和2試驗樣品，MDCK.5F1(濃度5×107細(xì)胞/ml)。
組3和4陽性對照(18C1-10T細(xì)胞，濃度5×107細(xì)胞/ml)。
組5和6陰性對照(SHE細(xì)胞，濃度1×107細(xì)胞/ml)。
所有動物每隔一工作日進(jìn)行觀察并且每周兩次地對接種點(diǎn)進(jìn)行觸診達(dá)84天的階段。
結(jié)果臨床結(jié)果處死所有的陽性對照小鼠并且在接種后14天進(jìn)行尸檢，因為其都在接種位點(diǎn)具有至少一個尺度大于1cm的大胞塊。
將所有陰性對照小鼠處死并在接種后84天進(jìn)行尸檢。
將10只試驗樣品(5F1)小鼠中的9只處死并在接種后84天進(jìn)行尸檢。處死5F1接種小鼠中的一只并在接種后33天尸檢，因為在接種位點(diǎn)有損害，其進(jìn)展開始恢復(fù)。后來揭示該損害是囊腫。
觸診用陽性對照樣品接種的10只裸鼠有可觸知的損害，在接種后14天至少一個尺寸大于1cm。
小的不進(jìn)展的損害在10只陰性對照樣品接種的裸鼠的接種位點(diǎn)是可觸知的。這些損害首先在接種后4天被注意到，在觀察期的過程中，在10只陰性對照小鼠中的8只中，損害繼續(xù)存在。
觸診的結(jié)果總結(jié)在表4。
自接種后4天，所有10只5F1小鼠均有損害。在10只5F1小鼠中的9只中，損害小且不發(fā)展。接種后56天，試驗樣品小鼠中有8只沒有可觸知的損害。一只5F1接種小鼠在接種位點(diǎn)有損害，該損害在25-28天在尺寸上進(jìn)展顯著，并且在接種后32天大小顯著降低。該損害通過顯微檢查被鑒定為囊腫(見表6)。另一只出現(xiàn)損害的小鼠有局部發(fā)炎。
表4觸診結(jié)果

總尸檢結(jié)果在表5中總結(jié)了治療相關(guān)的總尸檢結(jié)果。
表5治療相關(guān)的總結(jié)果

在所有陽性對照動物中的接種位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了胞塊。在10只5F1小鼠中有3只、在10只陰性對照小鼠中有6只發(fā)現(xiàn)了胞塊或者結(jié)節(jié)。
顯微結(jié)果在表6中總結(jié)了有關(guān)的損害。
表6治療相關(guān)的顯微結(jié)果

在所有陽性對照小鼠的接種位點(diǎn)診斷出瘤形成(纖維肉瘤)。纖維肉瘤是由交織模式的可變密度的束排列的紡錘樣(spindoid)細(xì)胞組成的。膠原沉積是最小的。臨近的組織雖然受壓，但是很少被瘤侵襲。
在任何陰性對照小鼠中沒有診斷出瘤。但是，在兩個陰性對照樣品小鼠中的接種位點(diǎn)處注意到骨增殖病灶。這被認(rèn)為代表作為陰性對照接種的SHE細(xì)胞的選擇分化和生長。
在任何5F1小鼠中沒有診斷出瘤。但是，在一只小鼠中注意到囊腫并且在一只另外的5F1小鼠中注意到亞急性炎癥。
結(jié)論在所有10只陽性對照小鼠的接種位點(diǎn)診斷出纖維肉瘤。
在任何陰性對照或者試驗樣品小鼠中均不存在瘤。
在上述研究的條件下，試驗樣品MDCK.5F1不認(rèn)為是致瘤的。
實(shí)施例6總體步驟a.細(xì)胞繁殖在被植入生物反應(yīng)器前，將MDCK.5F1(ATCC No.CRL-12042)細(xì)胞傳代幾次用于細(xì)胞擴(kuò)增。將大約5-10×106細(xì)胞融化在37℃的水浴中，并將其轉(zhuǎn)移到具有營養(yǎng)培養(yǎng)基的聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并培育在37℃。3-4天后，分離該瓶中的細(xì)胞并用于植入5個其它燒瓶。隨后用這5個燒瓶去以相同方式種植20個燒瓶。用于細(xì)胞生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基是去離子水中制備的1∶1的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基和培養(yǎng)基199，其含有4.5g/L的葡萄糖，0.58g/L的谷氨酰胺和1g/L的碳酸氫鈉(DMEM-199)。該營養(yǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％γ照射的胎牛血清(I-FBS)。分離燒瓶中細(xì)胞以用于細(xì)胞傳代的溶液是在不含鎂和鈣的磷酸緩沖液(PBS)中制備的具有0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25％胰酶溶液。
使20個燒瓶中的細(xì)胞生長3-4天，胰蛋白酶消化，收集并用于種植含有3-5g/L微載體珠的1000ml spinner燒瓶中的3個微載體細(xì)胞培養(yǎng)物。將spinner燒瓶培育在37℃，保持大約50rpm的攪拌。連續(xù)生長細(xì)胞5-7天，而后將細(xì)胞從微載體上用胰蛋白酶消化下來用于種植5L生物反應(yīng)器(CelliGenTMby New Brunswick of Edison，N.J.)。
以如下方式將細(xì)胞從微載體上胰蛋白酶消化下來。用PBS和0.02％EDTA溶液清洗微載體細(xì)胞培養(yǎng)物兩遍。在第二次細(xì)胞清洗后，將大約200ml的胰蛋白酶溶液倒入燒瓶并在37℃下攪動保持大約20分鐘。用光學(xué)顯微鏡確定細(xì)胞分離完成后，使用含2％I-FBS的DMEM-199將細(xì)胞從自由的微載體上回收，隨后沉淀并重懸于含10％1-FBS的DMEM-199中。進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并且用適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞(大約1010)種植生物反應(yīng)器。
用于細(xì)胞培養(yǎng)的球形珠或者微載體由Pharmacia(Sweden)生產(chǎn)，并且以商品名Cytodexl銷售。Cytodexl微載體的密度是1.03(0.9％NaCl中g(shù)/ml)，其大小介于131-220μm，平均180μm。細(xì)胞生長的大約表面積是4,500cm2/g微載體(干重)，1g含有大約6.8×106個微載體。
b.生物反應(yīng)器中的細(xì)胞種植和生長將15-25g/L Cytodex 1濃度的微載體引入5L生物反應(yīng)器中(3.7L工作體積)。如下種植生物反應(yīng)器。將大約獲得自先前準(zhǔn)備的貯存液(參見上文)中的4×109-1×1010的細(xì)胞置于管形玻璃瓶中。從20g/L微載體的無菌溶液，用DMEM-199清洗55.5-92.5g(取決于培養(yǎng)物中需要的濃度)的微載體兩遍并且將細(xì)胞加入到玻璃瓶中。隨后用含有10％I-FBS的DMEM-199填充瓶得到3.7L的終體積。隨后將瓶中的物質(zhì)(DMEM-199中的細(xì)胞和微載體)倒入生物反應(yīng)器容器中，用中心桿以約20rpm攪動。當(dāng)容器被填滿時，將攪動增加到50rpm，將溫度調(diào)節(jié)到37℃并且將溶解的氧含量保持在5-50％空氣飽和度。培養(yǎng)物的pH也保持在6.8-7.4。在第一天，使用含2.5％I-FBS和0.5g/L硫酸鎂的DMEM-199以0.5體積/天開始灌流微載體細(xì)胞培養(yǎng)物。連續(xù)生長細(xì)胞大約7-10天并且將灌流流動率逐步增加到2體積/天。
c.病毒感染在病毒加入微載體細(xì)胞培養(yǎng)物之前，灌流在感染那天被增加到4無血清體積/天。溫度降低到33℃并且將氧分壓控制在15％空氣飽和度。細(xì)胞連片生長時和病毒感染前立刻(在同一天)，用相同的無血清培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基，并且將灌流率增加到4體積/天7小時。這可以保證培養(yǎng)物的血清物質(zhì)在感染前被降低到最小水平。在該階段后，停止灌流并且將人流感病毒類型A或者B引入到微載體細(xì)胞培養(yǎng)物中。在引入生物反應(yīng)器前，用營養(yǎng)培養(yǎng)基(含6.5g葡萄糖/L的DMEM-199)正常稀釋病毒以獲得范圍為1∶10-1∶108的M.O.I.。第二天，將灌流保持在2體積/天直到完成細(xì)胞病變效應(yīng)。通常在5天內(nèi)觀察到MDCK細(xì)胞整個破壞。隨后收集含有流感病毒懸液的流出物，并進(jìn)而進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，這在本領(lǐng)域是熟知的。
d.滅活和純化以如下方式進(jìn)行單效價流感病毒的純化。收集自通常為15-30L的生物反應(yīng)器的病毒收獲物首先通過1.2μm的濾器(Sartorius Sartopure GF，長10英寸，0.6m2)凈化以移除大的細(xì)胞碎片。隨后通過加入0.125％(V/V)甲醛(終濃度)16個小時使含有流感病毒的凈化的懸液失活。隨后將失活的病毒懸液通過離子交換、DNA酶處理和凝膠過濾純化。
選擇富集的病毒級分，其代表用于疫苗制備的優(yōu)質(zhì)材料。隨后將這些級分聚集在一起并進(jìn)行稀釋以得到作為目前國際權(quán)威推薦的15μg HA/株/劑量的終濃度。
e.疫苗制備病毒蛋白被稀釋到15μg/劑量疫苗。加入硫柳汞(0.01％)分別用于防腐和穩(wěn)定，從而完成疫苗制備。
對于標(biāo)準(zhǔn)的三效價疫苗，三個循環(huán)株中每個的單效價劑量將被混和并如上所述加入防腐劑和穩(wěn)定劑。
其它已知的防腐劑例如氨基甲基丙醇，山梨酸和聚氨基丙基雙胍，硝酸苯汞(phenymercuric nitrate)，硼酸苯汞，2-苯氧乙醇與甲醛，酚，苯索氯銨，和2苯氧乙醇可以用于疫苗制備。這些防腐劑的濃度需要符合工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例7使用株A/Shanghai/11/87并添加胰蛋白酶感染親本細(xì)胞系將來自親本系的MDCK細(xì)胞在CelliGenTM生物反應(yīng)器中生長。該生物反應(yīng)器的工作體積是3.7L，微載體濃度是25g/L，并在50rpm攪動。在第七天，用名為A/Shanghai/11/87的人流感株感染培養(yǎng)物。M.O.I.是1∶133,000并且將2.5μg/ml的胰蛋白酶加入以提高病毒復(fù)制。表7列出了測試的相關(guān)數(shù)據(jù)，表8概括了結(jié)果。疫苗產(chǎn)量是15μg HA的9,828單效價劑量，這基于18L總收獲體積和7.38μg HA/ml和9μg HA/ml的單輻射擴(kuò)散(SRD)測定值。(見表8.)表7使用親本細(xì)胞系和株A/Shanghai/11/87并添加胰蛋白酶進(jìn)行測試的數(shù)據(jù)

以如下方式計算感染時刻細(xì)胞的總數(shù)9.34×106MDCK細(xì)胞/ml×3700ml等于34,558×106細(xì)胞。
表8使用親本細(xì)胞系和株A/Shanghai/11/87并添加胰蛋白酶進(jìn)行測試的結(jié)果

以如下方式計算HA的總量9,828劑量×15μg/劑量＝總共147,420μg HA。再除以34558×106細(xì)胞＝4.26μgHA/106MDCK細(xì)胞。
實(shí)施例8使用株A/Shanghai/11/87并不添加胰蛋白酶感染MDCK.5F1克隆在微載體濃度為25g/L的CelliGenTM生物反應(yīng)器中生長衍生自克隆MDCK.5F1(ATCC保藏號CRL-12042)的細(xì)胞。該生物反應(yīng)器的工作體積是3.7L并且在50-55rpm攪動。在第七天，用名為A/Shanghai/11/87的人流感病毒株感染培養(yǎng)物。生物反應(yīng)器中不加入胰蛋白酶來提高病毒生長。M.O.I.是1∶133,000并且該測試生產(chǎn)出了32L，其SRD值為9.2μg HA/ml，得到19,626單效價劑量。表9總結(jié)了該測試的數(shù)據(jù)并且表10列出了結(jié)果。
表9使用MDCK.5F1克隆和株A/Shanghai/11/87在沒有胰蛋白酶時進(jìn)行測試的數(shù)據(jù)

以如下方式計算感染時刻細(xì)胞的總數(shù)16,8×106MDCK細(xì)胞/ml×3700ml等于62,160×106細(xì)胞。
表10使用MDCK.5F1克隆和株A/Shanghai/11/87在沒有胰蛋白酶時進(jìn)行測試的結(jié)果


以如下方式計算HA的總量19,626劑量×15μg/劑量＝總共294,390μg HA。再除以62,160×106細(xì)胞＝4.73μg HA/106MDCK細(xì)胞。
實(shí)施例9用株B/Harbin/7/94在沒有胰蛋白酶的情況下感染MDCK.5F1克隆衍生自克隆MDCK.5F1的細(xì)胞如實(shí)施例3所述的那樣生長，只是微載體的濃度是15g/L。在第八天，用名為B-Harbin/7/94的人流感病毒感染培養(yǎng)物。M.O.I.是1∶10,000。沒有加入胰酶以促進(jìn)病毒復(fù)制。來自該測試的數(shù)據(jù)和結(jié)果見表11和12。基于35L的收獲物和16.35μg HA/ml的SRD值，產(chǎn)量是38,150劑量。
表11.使用MDCK.5F1克隆和株B-Harbin/7/94在沒有胰蛋白酶時進(jìn)行測試的數(shù)據(jù)


以如下方式計算感染時刻細(xì)胞的總數(shù)16.7×106MDCK細(xì)胞/ml×3700m1等于61,790×106細(xì)胞。
表12.使用MDCK.5F1克隆和株B-Harbin/7/94在沒有胰蛋白酶時進(jìn)行測試的結(jié)果

以如下方式計算HA的總量38,150劑量×15μg/劑量＝總共572,250μgHA。再除以61,790×106細(xì)胞＝9.26μg HA/106MDCK細(xì)胞。
再一次，這里表明本發(fā)明方法得到的產(chǎn)量等于或者高于任何需要胰酶存在的現(xiàn)有技術(shù)方法所得到的產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.一種馬-達(dá)犬腎(MDCK)衍生的細(xì)胞系，特征在于其對病毒感染具有比其親本MDCK細(xì)胞系更高的敏感性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中所述的更高的敏感性被定義為至少是所述親本細(xì)胞系中生產(chǎn)病毒滴度的大約1.2倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)胞系，其中所述的病毒選擇由下列組成的組流感，呼吸道合胞病毒，乳多空病毒，副流感病毒，水泡性口炎，牛痘，柯薩奇病毒，呼腸孤病毒，細(xì)小病毒，腺病毒，脊髓灰質(zhì)炎，麻疹，狂犬病，和皰疹病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞系，其中所述的病毒是流感或者呼吸道合胞病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞系，其中所述的流感病毒包括人，馬，豬或者禽類株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的細(xì)胞系，其中所述的流感病毒選自人流感病毒類型A，B，或者C。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的細(xì)胞系，其中所述的流感病毒選自類型A或者B。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的細(xì)胞系，其中所述的細(xì)胞系對流感病毒類型A和B都高度敏感。
9.一種MDCK衍生的細(xì)胞系，特征在于其是非致瘤性的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項的細(xì)胞系，特征在于其是非致瘤性的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的細(xì)胞系，其中所述的非致瘤性被定義為在大約3個月的觀察后在裸鼠中沒有可觸知的結(jié)節(jié)。
12.一種細(xì)胞系，其具有ATCC CRL-12042的生物學(xué)特性。
13.一種細(xì)胞系，定義為ATCC CRL-12042。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任何一項的細(xì)胞系，特征還在于其是貼壁依賴的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任何一項的細(xì)胞系在生產(chǎn)用于預(yù)防、診斷、免疫治療或者治療目的的病毒顆?；蛘卟《镜鞍字械挠猛?。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述的病毒顆?；蛘叩鞍子糜谏a(chǎn)用來預(yù)防病毒感染的疫苗。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中所述的病毒感染是由流感病毒引起的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中所述的流感病毒包括人、馬、豬、或者禽類株。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述的流感病毒選自人流感病毒類型A、B或者C。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中所述的病毒是人流感病毒類型A或者B。
21.被定義為ATCC CRL-12042的細(xì)胞系在生產(chǎn)病毒顆粒或者病毒蛋白中的用途，所述的病毒顆?；蛘卟《镜鞍子糜陬A(yù)防流感病毒感染用的疫苗的制造。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中所述的病毒感染是由人流感病毒類型A或者B引起的。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中所述的病毒感染是由人流感病毒A和B引起的。
24.一種生產(chǎn)流感病毒顆?；蛘叩鞍椎姆椒?，其包括a.生長能夠復(fù)制所述流感病毒的馬-達(dá)犬腎(MDCK)細(xì)胞系；b.用流感病毒株感染所述細(xì)胞系；和c.培育以容許該病毒復(fù)制；和收獲所述復(fù)制的病毒。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，還包括從中純化病毒顆?；蛘叩鞍?。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的MDCK細(xì)胞系被定義為具有ATCC No.CRL-12042的生物學(xué)活性。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的MDCK細(xì)胞系被定義為ATCCNo.CRL-12042。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的流感病毒包括人、馬、豬、或者禽類株。
29.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的病毒選自由人流感病毒類型A、B和C組成的細(xì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的方法在生物反應(yīng)器中進(jìn)行。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的生物反應(yīng)器的大小為大約5升。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的生物反應(yīng)器的大小為大約5-5000升。
33.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在步驟a中，所述的細(xì)胞生長在含有微載體裝置的培養(yǎng)基內(nèi)；并且在步驟b中，所述的培育在灌流裝置中進(jìn)行。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述的灌流裝置含有傾析器以避免所述收獲物中微載體的泄露。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述的微載體裝置包含濃度為大約5-25g/L的微載體珠。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述的微載體珠的濃度范圍為大約10-25g/L。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述的微載體珠的濃度范圍為大約15-20g/L。
38.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的灌流是以大約0.5-4.0生物反應(yīng)器體積/天的速率進(jìn)行的。
39.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在步驟b中，以大約10∶1-1∶1010的多重感染種植所述的流感病毒。
40.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中以大約1∶10-1∶108的多重感染種植所述的流感病毒。
41.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中以大約1∶104-1∶107的多重感染種植所述的流感病毒。
42.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中以大約1∶105-1∶106的多重感染種植所述的流感病毒。
43.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在步驟a中，所述的MDCK細(xì)胞系生長了大約7天。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的MDCK細(xì)胞系在大約33-40℃的溫度范圍下生長。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的MDCK細(xì)胞系在大約36-38℃的溫度范圍下生長。
46.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在步驟b中，所述的流感病毒在大約30-37℃的溫度復(fù)制。
47.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的流感病毒在大約32-34℃的溫度復(fù)制。
48.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述的流感病毒在大約33℃的溫度復(fù)制。
49.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的純化的病毒顆?；蛘叩鞍妆挥糜谏a(chǎn)用來預(yù)防流感病毒感染的疫苗。
50.一種用來在哺乳動物中預(yù)防流感病毒感染的疫苗，其如權(quán)利要求49的方法制造。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的疫苗，其中所述的哺乳動物是人。
52.一種用來在哺乳動物中預(yù)防流感感染的方法，包括給予權(quán)利要求50或者51的疫苗的步驟。
53.一種用于在哺乳動物中預(yù)防流感病毒感染的疫苗，包含混合有防腐劑的根據(jù)權(quán)利要求24分離的病毒顆粒或者病毒蛋白。
54.根據(jù)權(quán)利要求24的方法的用途，其用于疫苗生產(chǎn)。
55.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的純化的病毒顆?；蛘叩鞍妆挥糜谏a(chǎn)檢測流感病毒感染的診斷試劑盒。
56.根據(jù)權(quán)利要求24分離的大量病毒顆?；蛘叩鞍椎挠猛?，其用于生產(chǎn)在哺乳動物中檢測和診斷流感病毒感染的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種工業(yè)規(guī)模的方法，其用于生產(chǎn)預(yù)防、診斷、免疫治療或治療目的用的流感病毒或者抗原。特別地，本發(fā)明提供了馬－達(dá)氏犬腎(MDCK)衍生的細(xì)胞系和用于流感疫苗生產(chǎn)和更特別用于含有流感類型A和B的人疫苗生產(chǎn)的基于細(xì)胞培養(yǎng)的方法。
文檔編號A61K39/12GK101094915SQ200580024752
公開日2007年12月26日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
發(fā)明者P·特勒帕尼爾, R·迪格雷, T·哈塞爾 申請人:益得生物醫(yī)學(xué)公司