包含作為活性成分的藍靛果忍冬的果實提取物用于預防或改善缺血性腦血管病的藥物組 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含作為活性成分的藍靛果忍冬果實提取物，所述藥物組合物用于預防或治療缺血性腦血管病。根據(jù)本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物具有保護神經細胞的作用，從而顯著地減少缺血性腦血管病所致的神經行為損傷和梗死體積。因此，根據(jù)本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物可以提供作為用于預防或治療缺血性腦血管病的藥物組合物，以及可以提供作為用于預防或治療缺血性腦血管病的保健食品。
【專利說明】包含作為活性成分的藍靛果忍冬的果實提取物用于預防或 改善缺血性腦血管病的藥物組合物或保健食品

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物組合物或保健食品，其包含作為活性成分藍靛果忍冬（S3 0I)的果實提取物，該藥物組合物或保健食品用于預防和治療缺血性腦血管病。

【背景技術】
[0002] 據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，每年1700萬人死于血管疾病，并且血管疾病是死亡的第一 大原因，占總死亡人數(shù)的三分之一。在美國，65歲或更大的成人中血管疾病位列死亡的第一 大原因，且在45歲到64歲的成人中是緊隨癌癥之后的死亡的第二大原因。隨著老齡化人 口的不斷增長，因血管疾病的死亡的人數(shù)預計將增加。在韓國，癌癥是死亡的第一大原因， 隨后依次為腦血管病和心臟疾病。近期被列為死亡的第二個和第三個原因的血液循環(huán)系統(tǒng) 疾病的患者人數(shù)，相對于20世紀80年代初，迅速增長到7倍。
[0003] 中風通常被稱為"腦血管意外"，且指的是局灶性神經功能缺損，如意識喪失，偏 癱，構音障礙，其是因腦血管阻塞或破裂的影響，任何腦部供血突然中斷。中風大致分為缺 血性中風和出血性中風。缺血性中風是由于腦組織供血的減少或中斷導致腦組織缺血引起 的，而出血性中風是由于血管破裂導致在腦組織中出血引起的。換言之，根據(jù)原因，中風被 分成腦血管阻塞引起的腦梗死和腦血管破裂引起的腦出血，并且腦出血進一步分為腦內出 血和由于腦血管的氣球狀變形所致的腦動脈瘤破裂引起的蛛網膜下腔出血（SAH)。進一步 地，腦梗死分為腦血栓（由于腦血管內血塊的形成所致的血管的梗阻）和腦栓塞（由于心 臟疾病所致血栓或血塊的移動到腦，引起的腦動脈的阻塞）。因為中風可以發(fā)生在腦的任何 部位，它可能引起全部身體功能損害。進一步地，產生的腦損傷是由嚴重程度和損傷自身的 位置所決定的，而由于中風所致的嚴重的腦損傷引起的運動和感覺障礙，并能抑制較高級 的功能，例如記憶，學習，計算和推理等，并且還造成如中風，弱智，學習障礙，癲癇等的嚴重 后果。甚至在中風恢復后，在大部分情況下相關的后遺癥仍然存在，從而造成每年多達70 億美元的社會和經濟損失（Davenport等人，JournalofNeurology, 2000,第68卷，第277 頁）。
[0004] 缺血性腦損傷取決于血液循環(huán)。當腦部供血血管中的一些病理情況引起正常的腦 血流障礙（50毫升/克/分鐘）時，短暫性腦缺血迅速發(fā)展成完全性中風，導致死亡。因為 缺血性中風發(fā)生突然，伴隨有神經障礙，并在短時間內進一步發(fā)展，即使有緊急溶栓治療， 也不可能完全治療。即使其可能不會導致立即死亡，其副作用和后遺癥依然嚴重，直接或間 接地造成社會和經濟損失。因此，其預防是非常重要的。
[0005] 缺血性中風的預防分為的初級預防和次級預防，初級預防用于去除引起血流變化 的危險因素，如血清膽固醇水平上升、高血壓、心臟疾病等；而次級預防用于預防缺血性中 風發(fā)作后進一步惡化。以往關于食品能夠預防缺血性中風的研究，集中于降低因特定危險 因素所致的傷害。特別地，當腦供血減少引起的大腦缺血發(fā)生時，谷氨酸介導的鈣離子通道 的開放導致Ca離子過量內流從而引起興奮性中毒，或通過再灌注產生的氧自由基在神經 細胞中破壞酶組（芟仝λ有關的神經元損傷機制的特定目標的研究依然不盡如人意，需要 在相關研究中取得進一步進展（HagbergH等人，NeurosciLett. 78 :311-317,1987)。
[0006] 近年來，國際研究報道食品成分，如肌肽、鞣花酸衍生物、胡蘿卜素衍生物、S-半胱 氨酰衍生物影響缺血性腦損傷的初級和次級預防。作為用于中風的治療劑，已研制了用于 預防初級（急性）腦損傷的谷氨酸受體阻斷劑，以及使用抗氧化劑的治療劑。然而，由于在 臨床試驗中觀察到的缺少療效或毒性問題，這些研究還未成功。因為嚴重的毒性反應，NMDA 受體拮抗劑還未被使用，且其中大部分未能通過臨床試驗。
[0007] 在國內外還沒有足夠的特定目標的研究以闡明食物成分和神經元損傷的機制之 間的關系。此外，也有少數(shù)成功案例已在動物的大腦內證實食品成分的作用，并由此成功地 開發(fā)成產品。事實上，在韓國大多數(shù)研究已在進行了實驗性水平的試驗，而還未很好的進行 更復雜的研究，例如功能性材料、基于體內的生理活動的機理、用于材料改性的平臺技術。
[0008] 目前在韓國可用的大部分功能材料是簡單的復合型，而一些功能性食品由于暴露 于氧氣中所致的氧化和褐變而具有低的有效性，并且作為食品原料它們還具有低品級的外 觀。因此，需要發(fā)展能夠通過涂布形成阻隔膜，以確保貯存穩(wěn)定性并保持活性成分活性的基 礎技術，以及能夠應用活性材料于合適的食物載體以增加可用性的加工工藝。但是，所作的 努力尚未成功。
[0009] 迄今為止，大多數(shù)已開發(fā)的這樣的藥物是谷氨酸受體拮抗劑，抗氧化劑，鈣或鈉離 子通道阻斷劑等，而有效的藥物尚未研制出來。因此，有必要采用突破性的理念和新的概念 以完成特異性目標藥物的發(fā)現(xiàn)。
[0010] 同時，據(jù)報道，炎癥反應發(fā)生在中樞神經系統(tǒng)中，由此成為神經元變性的主要原因 之一。因此，在腦缺血性中風發(fā)生之后出現(xiàn)炎癥反應將成為用于中風的新治療劑的發(fā)展目 標。此類治療劑，預期包含的藥物抑制參與分離細胞毒性物質的酶活性，或抑制嗜中性粒細 胞的沉積（Dirnagl,U.等人；TINS.，22,pp391-397, 1999)。
[0011] Hewett等人發(fā)現(xiàn)，激活的神經膠質細胞可能影響神經細胞死亡（Hewett,S.J.等 人：Neuron, 13 :487-494，1994，Hewett，S.J.等人，Stroke, 27:1586-15911996)。激活的神 經膠質細胞增加炎性因子、可引起細胞毒性的細胞因子（如腫瘤壞死因子-α，白細胞介 素）的產生，從而增加對神經細胞和神經膠質細胞的細胞毒性。
[0012] 巨噬細胞和小神經膠質細胞分泌的炎癥分子，以及神經細胞的死亡是重要的，并 且特別地，神經膠質細胞活化的控制和保護神經細胞是用于中風的預防和控制以及治療發(fā) 展的主要目標。
[0013] 開發(fā)為使用植物用于特殊目的新的作物的努力使它們的年產量增加，但是，作通 過簡單的工藝，如用油提取工藝而作為一般的添加劑，或以提取物形式加入到東方藥物中 的利用率是低的。但是，因為植物是非常有望包含對缺血性中風顯示預防活性的活性物質， 并且在東方藥物中，在傳統(tǒng)上幾種植物一直用于中風的預防，植物作為保健食品原料的開 發(fā)有望顯示植物的附加值。因此，需要系統(tǒng)的方法來開發(fā)的功能保健食品，其是通過發(fā)展能 夠從國內植物中篩選用于預防缺血性中風的食品原料，在動物實驗中研究它們的療效，然 后將它們應用于功能性食品的技術。
[0014] 藍靛果忍冬是屬于忍冬科茜草目的雙子葉植物。其是長至1.5米高的落葉灌木， 分枝密集，并且在樹枝的節(jié)點具有盾狀苞片。分枝的內部部分是白色的。葉子是對生的，矛 形或橢圓形，鈍的或尖的端部，邊緣缺齒，在邊緣和表面具有短毛，并在底面有許多茸毛?；?通常有短梗，從葉腋處長出，有漏斗形乳白色的花冠，夏季開花。每個花萼有五片有齒萼片。 在花冠是黃白色，圓柱形鐘狀，長1. 2-1. 5厘米，并有些許毛。雄蕊比花柱短并且無毛，并且 兩個子房融為一體。果實為橢圓形或近圓形，在七月和十月之間成熟至紫黑色，并覆蓋著白 粉。這種灌木是北極植物，廣泛分布于西伯利亞，庫頁島，中國北部地區(qū)，西藏，朝鮮等。
[0015] 目前，作為涉及藍靛果忍冬提取物應用的發(fā)明，韓國專利第10-0699790號公開了 一種含有藍靛果忍冬提取物的藥物組合物，用于肝臟疾病的預防和治療，其中所述組合物 表現(xiàn)出對肝癌、肝硬化和脂肪肝的預防和治療效果，而韓國專利第10-0454150號公開了一 種抗刺激的化妝品組合物，以所述組合物的總重量計，包括0. 001重量％ -10重量％的一種 或多種草本植物提取物，其選自鬯查，、徐長卿（扮翻瑪）和藍靛果忍冬，其可用于預防 瘙癢，存在較少的如皮疹或皮膚過敏的副作用。然而，還沒有關于使用藍靛果忍冬的果實提 取物用于缺血性腦血管病的發(fā)明。
[0016] 因此，本發(fā)明人開發(fā)了可用于缺血性腦病預防或治療的物質，并發(fā)現(xiàn)藍靛果忍冬 的果實提取物抑制神經行為障礙，并減少腦梗死體積，由此其可以用作缺血性腦病的預防 或治療劑的活性成分，從而完成本發(fā)明。


【發(fā)明內容】

[0017] 本發(fā)明的一個目的是提供一種藥物組合物，其包含作為活性成分的藍靛果忍冬的 果實提取物，該藥物組合物用于預防或治療缺血性腦血管病。
[0018] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種保健食品，其包含作為活性成分的藍靛果忍冬的 果實提取物，所述保健食品用于預防或改善缺血性腦血管病。
[0019] 本發(fā)明的又一個目的是提供用于治療缺血性腦血管病的方法，包括向受試者施用 藥學上有效量的藍靛果忍冬的果實提取物的步驟。
[0020] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種用于保護神經細胞免受氧化應激的方法，包括向 受試者施用藥學上有效量的藍靛果忍冬的果實提取物的步驟。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是顯示通過阻塞大鼠大腦中動脈的基底誘發(fā)腦缺血90分鐘后進行24小時 的神經行為分數(shù)的圖，其中鹽水表示對照組，而SH-1013表示本發(fā)明藍靛果忍冬的果實提 取物（〇,無神經行為障礙（正常）；1，當通過尾巴將大鼠完全抬起時，左前肢無法伸展（輕 度）；2,向病變的對側轉圈（中度）；3,休息時倒向病變對側或無自主運動（重度））；
[0022] 圖2是顯示本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物對MCAO(大腦中動脈閉塞）的梗死 體積的影響的圖；
[0023] 圖3是典型的TTC染色組織圖像，其顯示本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物對 MCAO(大腦中動脈阻塞）的梗死體積的影響，其中對應于每個實驗組，從額極的4mm到16mm 范圍內切割顱頂制得6個截面（2mm厚）；以及
[0024] 圖4是典型的甲酚紫染色組織圖像，顯示了本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物對 MCAO(大腦中動脈阻塞）的神經細胞損傷的影響，其中，從各實驗組的大腦皮層和紋狀體觀 察甲酚紫染色的椎體形神經細胞。

【具體實施方式】
[0025] 在下文中，將詳細描述本發(fā)明。
[0026] 實現(xiàn)上述目的一個方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含作為活性成分的藍靛 果忍冬的果實提取物，該組合物用于缺血性腦血管病的預防和治療。
[0027] 如本文使用的，術語"藍靛果忍冬"是指所有的器官，例如，天然的，雜交的或變異 類型的藍靛果忍冬的根、枝條、莖、葉、花和果實，但優(yōu)選表示藍靛果忍冬的果實。
[0028] 如本文使用的，術語"缺血性腦血管病"統(tǒng)指任何理由所致腦血管阻塞且腦部供血 中斷時發(fā)生的疾病，并且也被稱為缺血性腦病。缺血性腦血管病是指當大腦血液流量減少 而氧氣或葡萄糖耗盡引起的已知對腦缺血敏感的腦組織中的神經細胞死亡而發(fā)生的疾病。 缺血性腦血管病可以包括腦梗死、中風、腦內出血、蛛網膜下腔出血、白質異常、血管性癡呆 等。
[0029] 優(yōu)選地，本發(fā)明的缺血性腦血管病可以是選自血管性癡呆、腦梗死、中風、腦內出 血、蛛網膜下腔出血和白質異常中的任一種。
[0030] 優(yōu)選地，本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物具有神經細胞保護作用，但不限于此。
[0031] 如本文使用的，術語"提取"是指一系列工序以獲得提取物，而術語"提取物"指的 是用的適當?shù)奶崛∪芤禾崛〔菟幉⒄舭l(fā)提取液而得到的濃縮產物。所述提取物可以是，但 不限于，由提取處理獲得的液體提取物，稀釋或濃縮的液體提取物液體，通過干燥液體提取 物制得的干燥提取物，或其粗純化的或其純化的提取物。所述本發(fā)明提取物可以通過用提 取溶劑提取，或通過添加分餾溶劑到通過用提取溶劑提取制得的提取物中分餾制備。提取 溶劑可以是，但不限于，水、有機溶劑或它們的混合溶劑，其中有機溶劑可以是C1-C4醇、如 乙酸乙酯或丙酮的極性溶劑，如己烷或二氯甲烷的非極性溶劑或其混合溶劑。優(yōu)選地，溶劑 可以是水、C1-C4的醇或其混合溶劑。藍靛果忍冬的果實提取物可以通過本領域中已知的常 規(guī)提取，分離和純化的方法來制備。提取方法可以是，但不限于，優(yōu)選加熱提取、熱水提取、 冷浸泡提取、回流冷提取，或超聲提取。
[0032] 本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物優(yōu)選通過包括下列步驟的制備方法制備，但并 不限于此。
[0033] 本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物可通過這樣的方法制備，包括以下步驟：1)在 攪拌下將醇或醇水溶液加入藍靛果忍冬果實中，接著在80-KKTC提取溫度下回流提取3至 5小時；2)分離步驟1)回流提取制得的溶液的濾液，隨后在40至70°C下，減壓并冷凍干燥 以濃縮。
[0034] 在步驟1)中，提取溶劑可以是水、醇或其混合溶劑，優(yōu)選地，選自Cl至C4的低級 醇或其混合溶劑、1，3-丁二醇中的任一溶劑，但不限于此。最優(yōu)選地，是使用1，3-丁二醇提 取，但不限于此。最優(yōu)選地，所述提取的溶劑是1至100%的乙醇或1至100%的甲醇，但不 限于此。
[0035] 在步驟1)中，提取溶劑的量優(yōu)選為藍靛果忍冬果實干重的10重量％至40重 量％，更優(yōu)選30重量％，但不限于此。
[0036] 在步驟1)中，提取溫度為KTC至KKTC，但不限于此，優(yōu)選80至KKTC，而更優(yōu)選 為90至95°C，但不限于此。
[0037] 在步驟1)中，提取時間優(yōu)選為1小時至7小時，更優(yōu)選為3小時至5小時，但不限 于此。最優(yōu)選地，提取的時間是3小時，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明的方法，提取頻率優(yōu)選為 1至5次，但不限于此。
[0038] 提取物的制備方法，可以是本領域已知的典型的提取方法，亦即，使用提取裝置的 方法，如熱水提取、浸漬提取、回流冷提取、超臨界提取、亞臨界提取、加熱提取，高壓提取或 超聲提取，或用包含XAD和HP-20的吸附樹脂的方法，優(yōu)選在低溫下超聲提取的方法，但不 限于此。
[0039] 如本文使用的，術語"預防"是指所有施用提取物或包含該提取物作為活性成分的 組合物以抑制或延遲缺血性腦血管病的行為。如本文使用的，術語"治療"是指所有施用提 取物或包含該提取物作為活性成分的組合物以恢復或有利改變缺血性腦血管病的行為。
[0040] 在本發(fā)明的一個實施方式中，給缺血性腦血管病的動物模型施用本發(fā)明的藍靛果 忍冬的果實提取物，該模型是通過在麻醉狀態(tài)下阻塞大鼠大腦中動脈基底誘發(fā)的腦缺血， 然后使用該模型對缺血性腦血管病的治療進行評價。
[0041] 在本發(fā)明的一個實施方式中，通過神經學得分評價實驗動物的神經行為障礙，而 其結果是，它們的神經學評分較對照組顯著較低。
[0042] 在本發(fā)明的一個實施方式中，評價了本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物在梗死體 積上的功效，而其結果是，以l〇〇mg/kg藍靛果忍冬的果實提取物治療，梗死體積顯著減少。 [0043] 進一步地，在本發(fā)明的一個實施方式中，通過染色神經細胞評估其療效。結果，藍 靛果忍冬的果實提取物表現(xiàn)出顯著地抑制由于腦缺血所致的神經細胞死亡的效果，暗示提 取物具有優(yōu)異的神經細胞保護功效。
[0044] 因此，本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物具有神經細胞保護效果，從而顯著地減 少神經行為障礙以及缺血性腦血管病的梗死體積。因此，本發(fā)明提供了組合物，其包含作為 活性成分的藍靛果忍冬的果實提取物，該組合物用于預防和治療缺血性腦血管病。
[0045] 在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，本發(fā)明的提取物是來自天然植物的提取物， 并顯示無副作用，并在缺血性腦血管病的動物模型中具有神經細胞保護效果，從而抑制神 經行為障礙，并減少梗死體積。因此，其可以在包含該提取物的藥物組合物中作為活性成分 使用，用于預防或治療缺血性腦血管病的。
[0046] 以所述組合物的總重量計，含有本發(fā)明提取物的組合物可包括0. 1至50重量％的 提取物，但不限于此。
[0047] 在本發(fā)明的組合物還可以進一步包含典型地用于制備藥物的合適的載體、賦形劑 和稀釋劑。
[0048] 本發(fā)明的組合物可以根據(jù)典型方法配制成口服制劑，例如粉劑、顆粒劑、片劑、膠 囊劑、混懸劑、乳劑、糖漿、氣霧劑等，外用制劑，栓劑或用于注射的無菌溶液劑?？稍诒景l(fā)明 的組合物中使用的載體，賦形劑和稀釋劑可以示例性的為乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露 醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠樹膠（0卜汧人l〇l·衛(wèi)￥)、海藻酸鹽、明 膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、無定形纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸 甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。制劑可以通過使用常規(guī)使用的賦形劑 或稀釋劑如填充劑、增量劑（吾葑刻）、粘合劑、濕潤劑、崩解劑和表面活性劑來制備。所 述為口服施用的固體制劑可以包含片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑等，除了可以使用簡單 的賦形劑、潤滑劑，例如，硬脂酸鎂、滑石等，還通過混合本發(fā)明的組合物與例如，淀粉、碳酸 鈣、蔗糖或乳糖、明膠等的一種或多種賦形劑以制備。用于口服施用的液體制劑的實施例包 括混懸劑，供內用的液體、乳劑、糖漿等，除了通常使用的簡單稀釋劑諸如水和液體石蠟，還 可以含有各種賦形劑，如潤濕劑、甜味劑、調味劑、防腐劑等。在制備用于腸胃外施用的實施 例可包含無菌的水性溶液、非水性溶劑、混懸劑、乳劑、凍干劑，以及栓劑。作為非水溶劑和 混懸劑可以使用，丙二醇、聚乙二醇，如橄欖油的植物油，如油酸乙酯的可注射酯。作為栓劑 基質可以使用Wit印sol、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、月桂酸脂、甘油明膠等。
[0049] 藥物組合物可通過口服或胃腸外施用。腸胃外施用是通過局部施用和全身施用方 式的任一種進行。更優(yōu)選地是全身性施用，而最優(yōu)選地是靜脈內注射。
[0050] 在本發(fā)明的治療性組合物的優(yōu)選劑量可以基于病情以及體重、疾病的嚴重程度、 藥物的制備、施用途徑和時間，由本領域技術人員適當?shù)卮_定本發(fā)明合適的劑量。以藍靛果 忍冬的果實提取物的量計，本發(fā)明的治療組合物優(yōu)選施用劑量〇. 0001至l〇〇〇mg/kg/日，為 更好的效果更優(yōu)選為〇. 01至l〇〇mg/kg/日。施用頻率可一天一次或一天幾次。上述施用 劑量和施用頻率不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0051] 本發(fā)明的包含作為活性成分的藍靛果忍冬果實提取物的藥物組合物（該藥物組 合物用于預防和治療缺血性腦血管?。┛赏ㄟ^單劑量大丸劑類型或輸液相對短時間對患 者施用，或通過分級治療方案以多劑量長時間對患者施用。關于本發(fā)明藥物組合物的施用 濃度，考慮各種因素，如患者的年齡和健康狀況，以及藥物的施用途徑和治療頻率，用于患 者的有效施用劑量是確定的。因此，考慮各種因素，本領域的技術人員可以適當?shù)卮_定有效 的施用劑量。
[0052] 在本發(fā)明的組合物除了藍靛果忍冬的果實提取物，還可以進一步包括營養(yǎng)素、維 生素、電解質、矯味劑、著色劑、增稠劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體 增稠劑、PH調節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇、碳酸飲料中使用的碳酸化劑等。該組合物可 以進一步單獨地或與其他組分組合。以100重量份藍靛果忍冬的果實提取物計，附加組分 的含量可以優(yōu)選為〇. 1至20重量份。
[0053] 所述本發(fā)明的藥物組合物可配制成安瓿作為單一劑量形式或者多劑量容器使用， 根據(jù)本領域技術人員容易實現(xiàn)的本發(fā)明適合的方法，使用的藥學上可接受載體和/或賦形 齊U。在這方面，制劑可以使用任何類型的適合的藥物制劑，其中包括如粉劑、顆粒劑、片劑、 膠囊劑、混懸劑、乳液、糖漿、氣霧劑等的口服制劑，如軟膏、乳膏等的外用制劑，栓劑或注射 用無菌溶液劑。
[0054] 本發(fā)明的另一個方面，提供一種保健食品，其含有作為活性成分的藍靛果忍冬的 果實提取物，該保健食品用于預防或改善缺血性腦血管病。
[0055] 在本發(fā)明中，藍靛果忍冬的果實提取物和缺血性腦血管病，與所描述相同。
[0056] 本發(fā)明一個【具體實施方式】中，本發(fā)明的提取物在缺血性腦血管病的動物模型中具 有神經細胞保護效果，從而抑制神經行為障礙，并減少梗死體積，因此，其可以在包含該提 取物的保健食品中作為活性成分使用，用于預防或治療缺血性腦血管病。
[0057]食品的種類沒有特別地限制?？梢蕴砑游镔|到其中的食品的例子可包括飲料、肉 類、香腸、面包、餅干、年糕、巧克力、糖果、小吃、曲奇、比薩餅、方便面、其他的面、口香糖、包 括冰淇淋的乳制品、湯、飲料、酒精飲料、維生素復合物等，以及普遍接受的各種類型保健食 品。
[0058] 本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物可按原樣或者與其它食品或食品組分一起添 加到食品中，并根據(jù)典型的方法恰當?shù)厥褂谩Ｋ龌钚猿煞值幕旌媳瓤赏ㄟ^使用的目的 (用于預防或改善）適當確定。通常，以所述食品的總重量計，提取物可以〇. 1至90重量份 的量添加到保健食品中。然而，如果出于健康和保健的目的或健康管理的目的而長期施用， 其用量可以低于該范圍。因為不存在安全問題，所述活性成分也可以在上述范圍內使用。
[0059] 在包含所示比例的上述提取物作為必需成分的液體的范圍內，本發(fā)明的功能性保 健飲料組合物不限于任何特定的組合物。如普通的飲料，其可以包含各種甜味劑或天然糖 類作為附加組分。上述天然糖類的實施例可包括普通糖如，例如葡萄糖和果糖的單糖，例如 麥芽糖和蔗糖的二糖，例如糊精和環(huán)糊精的多糖，和例如木糖醇，山梨糖醇和赤蘚糖醇的糖 醇。作為甜味劑除上面提到的之外，天然甜味劑（索馬甜（E丨罕0[包），甜葉菊提取物（例 如，萊鮑迪甙A)，甘草甜素），和合成的甜味劑（糖精，阿斯巴甜等）可以有效地使用。每 100毫升的本發(fā)明組合物中天然碳水化合物的含量一般為約1至20g，優(yōu)選約5至12g。
[0060] 除了上述組分外，本發(fā)明的提取物可包括各種營養(yǎng)素，維生素，礦物質（電解質）， 如合成香料和天然香料的矯味劑，著色劑和增強劑（奶酪，巧克力等），果膠酸和及其鹽，海 藻酸及其鹽，有機酸，保護膠體增稠劑、PH調節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇，以及用于碳酸 飲料中使用的碳酸劑等。此外，本發(fā)明的提取物可包括天然果汁和果肉用于果汁飲料和蔬 菜飲料的供應。這些組分可以單獨或組合使用。這些添加劑的含量并非如此決定性的，但 以每100重量份的本發(fā)明提取物計，一般可以選擇0. 1至約20重量份。
[0061] 在又一個方面中，本發(fā)明提供一種預防或治療缺血性腦血管病的方法，包括向受 試者施用含有藥用有效量的以藍靛果忍冬的果實提取物為活性成分的組合物的步驟。
[0062] 如本文使用的，術語"施用"是指以適當?shù)姆绞綄㈩A定材料的引入患者體內。所述 組合物的施用沒有特別的限制。只要其允許該組合物在體內到達目標，可以采取任何施用 途徑。施用的實施例包括腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內 施用。然而，由于肽以口服施用會被消化，用于口服施用的組合物的活性成分為防止在胃中 降解應當包衣或是配制的。
[0063] 又一方面，本發(fā)明提供了保護神經細胞免受氧化應激的方法，包括給受試者施用 含有藥物有效量的藍靛果忍冬的果實提取物作為活性成分的組合物的步驟。
[0064] 如本文使用的，術語"氧化應激"是指一種活性氧類生產和消除系統(tǒng)之間平衡的障 礙，其是由各種因素，如化學品，輻射，缺血等引起的。細菌中具有一組由活性氧類誘導的 酶，這是由于直接氧化所致的轉錄因子活化引起的。在高等生物中，許多基因也由氧化應激 誘導，這被認為是由細胞內信號轉導通路的活化引起的。因此，氧化應激也誘導病理狀態(tài)， 如細胞的損傷（特別地，細胞膜脂質的氧化），DNA修飾所致的突變，細胞凋亡或壞死的誘導 等。
[0065] 氧化應激可通過活性氧類或活性氮類引起。所述活性氧類表示超氧（02〇、過氧化 氫（H2O2)、羥自由基（OH)、和單線態(tài)氧（1O2),其通過逐步還原三線態(tài)氧（3O2)的產生，以及活 性氮，包括一氧化氮自由基（NO)，和過亞硝酸鹽（0N00)等。
[0066] 在再一個方面中，本發(fā)明提供了藍靛果忍冬的果實提取物在制備用于缺血性腦血 管病預防劑或治療劑中的應用。
[0067] 在本發(fā)明中，藍靛果忍冬的果實提取物和缺血性腦血管病是相同的，與如上描述 相同。
[0068] 在下文中，本發(fā)明將根據(jù)實施例，實驗實施例和制備實施例詳述。
[0069] 但是，以下的實施例，實驗實施例和制備實施例僅用于說明的目的，而本發(fā)明并不 旨在通過這些實施例，實驗實施例和制備實施例進行限制。
[0070]〈實施例1>藍靛果忍冬的果實提取物的制備
[0071] 〈1-1>使用水溶劑熱水提取
[0072] 將在中國延邊和長白山親自收獲的野生藍靛果忍冬果實干燥并用于制備藍靛果 忍冬的果實提取物。將IOOg粉碎的藍靛果忍冬果實加入到1升的蒸餾水中，并充分攪拌， 接著以90至95°C的提取溫度回流提取3小時。然后，分離濾液，并且草本植物提取物在 55-65°C下，減壓濃縮，接著冷凍干燥以得到21. 2克的草藥粉末提取物。
[0073] 〈1_2>使用水-醇混合溶劑熱水提取
[0074] 將1升25 %的乙醇加入到IOOg在實施例1-1中粉碎的藍靛果忍冬果實中，并充 分攪拌，接著在80至90°C的提取溫度（通過加熱維持）下回流提取3小時。然后，分離濾 液，并且草本植物提取物在55-65°C下，減壓濃縮，然后冷凍干燥以得到19. 5克的草藥粉末 提取物。
[0075]〈實施例2>局灶性的缺血模型的制備
[0076] 使用Sprague-Dawley(SD)大鼠（250-300克）作為試驗動物。SD大鼠禁食24小 時，然后利用7:3比例的氮氣和氧氣混合氣體，用2. 5%異氟烷麻醉。將頸總動脈和頸外動 脈結扎，將17毫米長的探針從頸內動脈分叉點插入到頸內動脈以阻塞大腦中動脈的基底 90分鐘以誘導缺血。在誘導缺血過程中，插入直腸溫度計、監(jiān)測溫度并保持37±0. 3°C的正 常體溫。大腦中動脈阻塞預定的時間后，拉出插入頸內動脈的探針以完成再灌注。
[0077]〈例3>缺血性腦損傷的評估
[0078] 〈3_1>2, 3, 5-氯三苯四唑（TTC)染色
[0079] 為了根本上觀察短暫性腦缺血誘導的腦組織損傷，進行TTC染色。將腦從實驗組 中轉移，并且用大腦基質制備2毫米厚的片，并用2% 2, 3, 5-氯三苯四唑（TTC)溶液在37°C 下染色60分鐘。TTC溶液染色的腦切片在10%中性福爾馬林緩沖溶液中固定以測量梗塞 體積（Lee等人，Glia，50 :168-181，2005)。
[0080] 〈3_2>組織染色
[0081] 缺血后，正常組和各實驗組均在預定時間點腹膜內注射水合氯醛（400毫克/)以 全身麻醉。打開實驗動物的胸腔，一個套管通過左心室插入升主動脈。當動物通過右心室 放血時，用注射器（ColeParmer，美國）用生理鹽水（pH7. 4)以每分鐘10毫升的速率進行 灌注清洗。接著，將動物灌注4%多聚甲醛[0.IM磷酸鹽緩沖液（PB)，pH為7. 4]以固定， 然后在顱骨用骨刀破開從其中取出腦。固定的腦組織通過典型的組織處理過程包埋在石蠟 中，然后用顯微鏡以薄片切片機（Reichert-Jung，德國）對5μηι厚的石錯連續(xù)切片制備。 在用二甲苯脫蠟后，將切片用100 %，95 %，90 %，80 %，70 %和50 %的乙醇處理，隨后用甲 酚紫和酸性品紅染色檢查正常細胞的分布及變形。經過典型的脫水和清潔流程，用封片劑 將切片密封。
[0082]〈實驗實施例1>神經行為觀察評分的分析
[0083] 在誘導腦缺血3小時后，觀察手術后SD大鼠的神經行為障礙。神經行為試驗是通 過尾巴將老鼠在空中完全抬起直到發(fā)生左側偏癱，或通過檢查是否發(fā)生自發(fā)向左轉圈來評 分。神經學評分如下：〇,無神經行為障礙（正常）；1，當通過尾巴完全抬起時，左前肢無法伸 展（輕度）；2,向病變的對側轉圈（中度）；3,休息時倒向病變對側或無自主運動（重度）。
[0084] 在誘導腦缺血約30分鐘和3小時后，當通過尾巴將大鼠完全抬起時，檢測是否發(fā) 生逆時針轉圈。95%或更多的大鼠中觀察到逆時針轉圈，并且神經學評分為2. 8±0. 28。與 此相反，藍靛果忍冬的果實提取物處理的組中自發(fā)轉圈減少，并且用藍靛果忍冬的果實提 取物處理過的組中（SH-1013) (100毫克/千克），神經學評分為1.48±0.23,顯示了顯著地 神經行為障礙抑制（圖1)。
[0085] 這些結果提示，本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物顯著地降低了缺血性腦血管病 動物模型的神經行為障礙。
[0086]〈實驗實施例2>藥物的缺血性腦損傷保護作用
[0087] 為了根本上評估因短暫性MCAO(大腦中動脈阻塞）引起的腦損傷，進行TTC染色， 并測定總梗死體積。正常組織由于TTC被線粒體酶還原而染成暗紅色，而梗死組織由于線 粒體損傷沒有還原而從正常組織中區(qū)分開來。連續(xù)地從所述前部區(qū)域切割6個2_厚的截 面，但不包括每個實驗組的腦嗅球，這6個2mm厚的截面分別用TTC染色，并且作為結果， 第2,第3和4號組織中觀察顯著的梗死區(qū)域，在缺血后24小時的組中總梗塞體積測量為 25. 38±2. 85%，而用藍靛果忍冬的果實提取物處理的組中總梗塞體積（8. 59±4. 68% )顯 著降低（SH-1013)，顯示了用藍靛果忍冬的果實提取物處理的組中腦梗死體積降低了 60% 或更多（圖2和圖3)。
[0088] 進一步地，在大腦中動脈2小時阻塞和24小時再灌注后，進行甲酚紫染色。其結 果是，缺血性腦皮層和缺血性紋狀體中甲酚紫染色細胞的數(shù)目減少了。特別地，未發(fā)現(xiàn)錐體 形神經細胞。與之相反，在用本發(fā)明藍靛果忍冬的果實提取物處理的組中，缺血性腦皮層和 缺血性紋狀體中觀察到大量錐體形神經細胞（圖4)。
[0089] 這些結果提示，在缺血性腦血管病的動物模型中，本發(fā)明藍靛果忍冬的果實提取 物顯著地減小了梗死體積并顯示出了顯著的神經細胞保護效果。
[0090] 〈制備實施例1>藥物制劑的制備
[0091] 〈1-1>粉劑的制備
[0092] 藍靛果忍冬的果實提取物20mg
[0093]乳糖 20mg
[0094] 將上述組分混合，然后裝入密閉袋，以制備粉劑。
[0095] 〈1_2>片劑的制備
[0096]
[0097] 藍靛果忍冬的果實提取物IOmg 米淀粉 IOOmg 乳糖 IOOmg 硬脂酸鎂2mg
[0098] 將上述組分混合，然后按照典型的制備片劑方法壓片以制備片劑。
[0099] 〈1_3>膠囊劑的制備
[0100] 藍K果忍冬_果實提取物謂mg結晶纖維素 3mg 乳糖 14 Jmg 硬脂酸鎂〇.2mg
[0101] 將上述組分混合，然后按照典型的制備膠囊劑方法裝填膠囊以制備膠囊劑。
[0102] 〈1_4>液體制劑的制備
[0103] 藍腚采忍冬的果實提取物20mg異構化糖 IOg H'illfSg 純凈水足貴
[0104] 按典型液體制劑的方法將各組分加入并溶解于純凈水中，而后加入適量檸檬味香 料。然后，將上述組分混合，并加入純凈水至總體積100ml。將所得物填充到棕色瓶中，而后 滅菌以制備液體制劑。
[0105] 〈1_5>注射用制劑的制備
[0106] 藍靛果忍冬的果實提取物10 μ g/ml
[0107]稀鹽酸BP 至 ρΗ7·6
[0108] 注射用氯化鈉BP 直至Iml
[0109] 藍靛果忍冬的果實提取物溶解于足夠量的注射用氯化鈉BP中，然后用稀鹽酸BP 將所得溶液的PH調節(jié)至ρΗ7. 6,并用注射用氯化鈉BP調節(jié)體積，隨后充分混合。該溶液裝 入I型5毫升安瓿瓶中（透明玻璃），在空氣環(huán)境下通過熔化玻璃密封，然后，以120°C進行 15分鐘或更長時間的高壓滅菌以制備可注射制劑。
[0110] 〈制備實施例2>食品的制備
[0111] 如下制備含本發(fā)明藍靛果忍冬的果實提取物的食品。
[0112] 〈2_1>小麥粉食品的制備
[0113] 0. 5-5. 0重量份的本發(fā)明藍靛果忍冬的果實提取物中加入面粉中，而該混合物用 于制備面包，蛋糕，曲奇，薄餅干和面條作為用于健康改善的食品。
[0114] 〈2_2>乳制品的制備
[0115] 將5-10重量份的本發(fā)明藍靛果忍冬的果實提取物加入到牛奶中，而后該牛奶用 于制備各種如黃油和冰淇淋的乳制品。
[0116] 〈2_3>保健粉狀食品的制備
[0117] 將糙米、大麥、糯米，和薏苡預膠化，干燥，然后按已知的常規(guī)方法焙烤。然后，使用 壓碎機制成60目大小的粉末。
[0118] 將黑豆、黑芝麻，和紫蘇的種子蒸制，干燥，然后按已知的常規(guī)方法焙烤。然后，使 用壓碎機制成60目大小的粉末。
[0119] 將本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物在真空中濃縮機中真空濃縮，且通過噴霧和 熱風干燥機進行干燥。然后，將得到的干燥產物用壓碎機制備成60目大小的干燥粉末。
[0120] 谷粒、種子和干燥的藍靛果忍冬的果實提取物的粉末以下述比例共混。
[0121] 谷粒（30重量份糙米，15重量份薏苡，20重量份大麥），
[0122] 種子（7重量份紫蘇種子，8重量份黑豆，7重量份黑芝麻），
[0123] 藍靛果忍冬的果實提取物（3重量份），
[0124] 靈芝（0. 5重量份），以及
[0125] 地黃（0. 5重量份）。
[0126] 〈2_4>保健食品的制備
[0127] 藍鏇果忍冬的果實提取物IOOmg維斗:索浞介物 足設 維生索Aif酸_ 7_g 維牛索ELOmg 維生素B丨 O.Bmg 維生素B2 OJSmg
[0128] 維^索Bf> O.Smg 濰::?索Β〗2 0.2μ§ 維生素€ IOmg 生物素 IOpg iJlftitL7mg 葉酸 5%ig 泛酸側' 0.5mg 無機混介物 硫酸亞鐵 1.75mg 氣化_ 0.82mg 碳酸鎂 25.3mg 磷酸二氫鉀 15mg 晴酸M鈣 55mg 檸檬酸鉀 90mg 碳酸例 IOOmg 氯化鎂 24.8mg
[0129] 在含有多種維生素和礦物質的上述組合物中，將各組分以適于保健食品的比例混 合，但混合比例可以改變。將上述組分按典型的保健食品的方法制備顆粒劑，該顆粒劑可按 常規(guī)方法，用于制備保健食品組合物。
[0130] 〈制備實施例3>保健飲料的制備
[0131] 藍靛果忍冬的果實提取物 IOOmg 檸檬PtIOOmg 寡糖 IOOmg 李子濃縮物 2mg ?；撬?IOOmg 純化水 至總體積500ml
[0132] 按典型的保健飲料將上述組分混合，并在攪拌下加熱至85°C約1小時。將所得溶 液過濾并加入到IL滅菌的容器中，并將該溶液進行密封和殺菌處理，并保存在冰箱中。然 后，最終的溶液用于在制備本發(fā)明的保健飲料組合物。
[0133] 在上述組合物中，各成分以用于保健飲料的適當比例混合，但混合比例可以根據(jù) 地區(qū)/國家的偏好，如階級，國家，消費者的用途來改變。
[0134] 在本發(fā)明并不局限于如上描述的實施例、實驗實施例和制備實施例，而且本領域 技術人員將理解，各種修改和變更是可能的，未脫離如公開在所附權利要求書中的本發(fā)明 范圍和精神。
[0135] 本發(fā)明的效果
[0136] 本發(fā)明的藍靛果忍冬的果實提取物是來自天然植物的提取物，并顯示較少的副作 用，并在缺血性腦血管病的動物模型中具有神經細胞保護作用，從而抑制神經行為障礙且 減少梗死體積。因此，含有該化合物作為活性成分的組合物對缺血性腦血管病有優(yōu)異的預 防和治療效果。
【權利要求】
1. 一種藥物組合物，其包含作為活性成分的藍靛果忍冬的果實提取物，所述藥物組合 物用于預防或治療缺血性腦血管病。
2. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述缺血性腦血管病為選自血管性癡呆、腦梗 死、中風、腦出血、蛛網膜下腔出血和白質異常中的任一種。
3. -種果實提取物保健食品，其包含作為活性成分的藍靛果忍冬的果實提取物，所述 保健食品用于預防或改善缺血性腦血管病。
4. 根據(jù)權利要求3所述的保健食品，其中所述缺血性腦血管病為選自血管性癡呆、腦 梗死、中風、腦出血、蛛網膜下腔出血和白質異常中的任一種。
5. -種用于治療缺血性腦血管病的方法，包括向受試者施用包含藥學上有效量的作為 活性成分的藍靛果忍冬的果實提取物的組合物的步驟。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述缺血性腦血管病為選自血管性癡呆、腦梗死、 中風、腦出血、蛛網膜下腔出血和白質異常中的任一種。
7. 保護神經細胞免受氧化應激的方法，其包括給受試者施用包含藥學上有效量的作為 活性成分的藍靛果忍冬的果實提取物的組合物的步驟。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述氧化應激是由活性氧類或活性氮類引起的。
【文檔編號】A61P25/00GK104302302SQ201380025820
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年3月19日 優(yōu)先權日:2012年3月19日
【發(fā)明者】S·H·曹, W·K·金, J·C·李 申請人:慶熙大學校產學協(xié)力團