專利名稱：用于大流行相關(guān)毒株的流感疫苗方案的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗給予方案的領(lǐng)域，該疫苗用于提供針對流感病毒感染的保護(hù)作用，具體是含有來自大流行相關(guān)毒株的抗原的疫苗。
背景技術(shù)：
流行甲型流感病毒是Hmi和H3N2亞型，但預(yù)計(jì)H5亞型在近期可能也會(huì)流行。由于人類對新血凝素亞型缺乏免疫力，這種抗原性轉(zhuǎn)變將引起流感大爆發(fā)。在應(yīng)對流感大流行時(shí)，已提出采用大流行前接種策略。用當(dāng)前的H5毒株(來自鳥類)接種，期望所產(chǎn)生的免疫力能夠在大流行發(fā)生時(shí)有用，盡管在此期間可能會(huì)出現(xiàn)各種抗原性轉(zhuǎn)變。2008年，格蘭素史克公司(GlaxoSmithKline)的PREPANDRIX 產(chǎn)品在歐洲被批準(zhǔn)用于人大流行前應(yīng)用。PREPANDRIX 產(chǎn)品根據(jù)一兩劑方案給予。臨床實(shí)驗(yàn)隔21天給予所述藥劑(即在第 0和第21天給予)，這一方案在文獻(xiàn)1中也有報(bào)道。文獻(xiàn)2和3報(bào)道，賽諾菲巴斯德(Sanofi Pasteur)的大流行前疫苗也在第0和第21天給予。諾華疫苗公司(Novartis Vaccines) 的AFLUN0V 產(chǎn)品也已根據(jù)此方案給藥[4]。類似的，文獻(xiàn)5報(bào)道了來自澳大利亞CSL的疫苗的21天兩劑方案，相同的方案也在文獻(xiàn)6中使用。文獻(xiàn)7涉及使用21天兩劑方案的各種研究，但也提及一觀天方案(還可參見文獻(xiàn)8)。在獼猴中展開的一項(xiàng)研究[9]在第0和第27天給予兩劑。在一臨床前研究中，PREPANDRIX 在第0和第M天給予兔。本發(fā)明的目的是提供用于給予大流行相關(guān)流感疫苗的進(jìn)一步改進(jìn)的方案，以用于如大流行前免疫。

發(fā)明內(nèi)容
與現(xiàn)有的隔3-4周給予藥劑的方案不同，根據(jù)本發(fā)明，兩劑大流行相關(guān)流感抗原隔1周、2周或6周給予人對象。因此，本發(fā)明提供一種免疫人的方法，該方法包括(a)給予該人含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第一疫苗；和w周后，(b)給予該人含有來自該大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第二流感疫苗。本發(fā)明還提供第一和第二流感疫苗，用于通過該方法免疫人，所述疫苗含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原。本發(fā)明還提供第一和第二疫苗在制備用于免疫人的藥物中的用途，其中所述第一和第二疫苗各自含有來自大流行相關(guān)流感疫苗毒株的抗原，且所述第一和第二疫苗隔W周給予同一個(gè)人。本發(fā)明還提供含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第一疫苗在制備用于預(yù)先免疫將在w周后接受含有來自該大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第二疫苗的人的藥劑中的用途。本發(fā)明還提供含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第二疫苗在制備用于免疫接受該第二疫苗前w周已接受含有來自該大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第一疫苗的人的藥劑中的用途。本發(fā)明還提供含有第一和第二疫苗的藥盒，所述第一和第二疫苗各自含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原，所述第一和第二疫苗隔w周給予人。w 值為 1、2 或 6。疫苗目前可獲得各種形式的流感病毒，疫苗通常基于活病毒或滅活病毒。滅活病毒可以基于完整的病毒粒子、裂解的病毒粒子或純化的表面抗原。流感抗原還可以病毒體的形式提供。本發(fā)明可使用任何這些類型的疫苗，但通常使用滅活疫苗。在使用滅活病毒時(shí)，疫苗可含有完整的病毒粒子，裂解的病毒粒子，或純化的表面抗原(包括血凝素，通常還包括神經(jīng)氨酸酶)。滅活病毒的化學(xué)方法包括用有效量的一種或多種以下試劑處理去污劑、甲醛、β-丙內(nèi)酯、亞甲基藍(lán)、補(bǔ)骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺(binary ethylamine)、乙?；襾啺坊蛩鼈兊慕M合。滅活病毒的非化學(xué)方法是本領(lǐng)域已知的，例如UV光或γ照射?？赏ㄟ^各種方法從含病毒的液體中收集病毒粒子。例如，純化方法可包括利用線性蔗糖梯度溶液的區(qū)帶離心，所述蔗糖溶液含有去污劑以使病毒粒子破裂。任選稀釋后，可通過滲濾純化抗原。用去污劑(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、磷酸三-N-丁酯、曲通X-100、 曲通N101、溴化十六烷基三甲銨、Tergitol NP9，等等)處理純化的病毒粒子來產(chǎn)生亞病毒粒子制品，包括“吐溫-醚”裂解方法，從而獲得裂解的病毒粒子。本領(lǐng)域熟知裂解流感病毒的方法，例如參見參考文獻(xiàn)10-15等。通常利用破裂濃度(disrupting concentration) 的裂解劑(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎來進(jìn)行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白質(zhì)完全或部分溶解，改變病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子和離子性(例如，陽離子)表面活性劑，例如烷基糖苷、烷基硫代糖苷、?；恰⒒腔鸩藟A、 甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N, N-二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、?？他湼?Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、十二烷基肌氨酸鈉(SarcOSyl)、CTAB(溴化十六烷基三甲銨)、磷酸三-N- 丁酯、塞太弗倫(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基銨鹽、脂轉(zhuǎn)染試劑 (Iipofectin)、脂轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)、和D0T-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性劑，如曲通X-100或曲通附01)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，裂解可發(fā)生在最初的病毒粒子純化期間(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解方法可包括使含病毒粒子的物質(zhì)澄清(以除去非病毒粒子物質(zhì))，濃縮收集的病毒粒子(例如，采用吸附法，如CaHPO4吸附)，分離完整病毒粒子與非病毒粒子物質(zhì)，在密度梯度離心步驟中利用裂解劑裂解病毒粒子(例如，利用含有裂解劑(如脫氧膽酸鈉)的蔗糖梯度)，然后過濾(例如，超濾)以除去不需要的物質(zhì)。可將裂解的病毒粒子有用地重懸在磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。PREPANDRIX 、BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZONE 和 FLUSHIELD 產(chǎn)品是裂解疫苗。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶。本領(lǐng)域熟知制備純化形式的這些蛋白質(zhì)的方法。AFLUNOV 、FLUVIRIN , AGRIPPAL 和INFLUVAC 產(chǎn)品是這些疫苗的例子。滅活的流感抗原的另一種形式是病毒體[16](不含核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒)。 可使用去污劑溶解流感病毒、接著除去核殼體和重構(gòu)含有病毒糖蛋白的膜而制備病毒體。 制備病毒體的另一種方法涉及將病毒的膜糖蛋白加到過量的磷脂中，以產(chǎn)生其膜中具有病毒蛋白的脂質(zhì)體。本發(fā)明可用于保存大批病毒體，如在INFLEXAL V 和INVAVAC 產(chǎn)品中那樣。病毒體H5W疫苗是已知的[17]。根據(jù)本發(fā)明方案給予的第一和第二疫苗優(yōu)選是同類型的，即兩者都是滅活或都是活疫苗。當(dāng)兩者都是滅活疫苗時(shí)，滅活類型優(yōu)選相同，即兩者都是完全的病毒粒子，兩者都是裂解病毒粒子，兩者都是病毒體，或兩者都是純化的表面抗原。優(yōu)選裂解病毒粒子和表面抗原。HA是目前滅活流感疫苗的主要免疫原，通過參照一般由SRID測量的HA水平來標(biāo)準(zhǔn)化疫苗劑量?，F(xiàn)有的季節(jié)性疫苗通常含有約15 μ g HA/毒株，但例如對兒童、或在大流行情況下、或在使用佐劑時(shí)可使用較低的劑量。已使用分?jǐn)?shù)劑量，例如1/2(即7. 5yg HA/毒株)、1/4 (即3. 75 μ g HA,如PREPANDRIX 中那樣)和1/8，以及較高劑量(如3x或9x劑量 [18，19])。除非另有說明，疫苗可含有0. 1到150 μ g的來自大流行相關(guān)流感毒株的HA，優(yōu)選為 0. 1 到 50 μ g 之間，例如 0. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5μ g、0. 5-5 μ g 等。 具體的劑量包括如約45 μ g、約30 μ g、約15 μ g、約10 μ g、約7. 5 μ g、約5 μ g、約3. 75 μ g、 約 1. 9μ g、約 1. 5μ g 等。對于活疫苗，通過中值組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)而非HA含量來測定劑量，通常是每株 IO6 到 IO8 (優(yōu)選 IO6 5-IO7-5)的 TCID500本發(fā)明的疫苗含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原。甲型流感病毒目前具有 16 種 HA 亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。大流行相關(guān)流感毒株的特征如下(a)含有與目前流行的人毒株的血凝素相比新的血凝素，即在過去10年以上的時(shí)間內(nèi)在人群中未出現(xiàn)過(例如，ffi)，或者以前在人群中從未發(fā)現(xiàn)(例如，通常只在鳥類中發(fā)現(xiàn)的H5、H6或H9)，因此，疫苗接受者和普通人群沒有免疫接觸過該毒株的血凝素；(b)能夠在人群中水平傳播；以及(C)對人致病。用于本發(fā)明的大流行相關(guān)的毒株通常具有H2、H5、H7或H9亞型，如H5N1、H5N3、 H9N2、H2N2、H7m或H7N7毒株。優(yōu)選H5m毒株。對于H5亞型，毒株可以為0、1、2、3、4、 5、6、7、8或9進(jìn)化枝的毒株。大流行毒株可具有Hl亞型(如Hmi)，例如，HA可以與A/ California/04/09毒株具有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性。如前所述，本發(fā)明的疫苗含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原。該抗原是疫苗中的唯一抗原，或者除來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的該抗原外，疫苗還可含有至少一種其它抗原。該其它抗原可來自流感病毒，且可來自例如甲型流感病毒和/或乙型流感病毒。例如，疫苗可含有來自Hmi毒株、H3N2和/或乙型流感病毒毒株的抗原。這種類型的 4價(jià)疫苗在文獻(xiàn)20中公開。在含有來自兩種甲型流感病毒毒株的抗原的情況下，這些抗原可共有共同的神經(jīng)氨酸酶亞型，如Hmi和H5W。該共同的N亞型可增強(qiáng)交叉保護(hù)[21]。
本發(fā)明使用的毒株可具有野生型病毒中發(fā)現(xiàn)的天然HA，或修飾的HA。例如，已知可改變HA，以除去使病毒對禽類高度致病的決定簇(如HA1/HA2裂解位點(diǎn)附近的超堿性區(qū)域)。本發(fā)明使用的流感病毒可以是重配毒株，并可通過反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得。反向遺傳學(xué)技術(shù)[例如，2216]能利用質(zhì)?；蚱渌斯ぽd體在體外制備含所需基因組區(qū)段的流感病毒。該技術(shù)通常涉及表達(dá)(a)能從例如poll啟動(dòng)子或噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)能從例如polll啟動(dòng)子編碼病毒蛋白質(zhì)的DNA分子，從而使得在細(xì)胞中表達(dá)兩種類型的DNA能裝配完整的感染性病毒粒子。DNA優(yōu)選能提供所有病毒RNA和蛋白質(zhì)，但也可利用輔助病毒提供所述RNA和蛋白質(zhì)中的一些?？墒褂美脝为?dú)的質(zhì)粒制備各病毒RNA的基于質(zhì)粒的方法[27-29]，且這些方法也將涉及使用質(zhì)粒來表達(dá)所有或一些(如僅僅PB1、PB2、PA和NP蛋白)病毒蛋白，一些方法利用高達(dá)12種質(zhì)粒。 為減少所需的質(zhì)粒數(shù)，一種方法[30]在同一質(zhì)粒上組合了多個(gè)RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(用于病毒RNA合成)(例如，編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8個(gè)甲型流感vRNA區(qū)段的序列)，在另一質(zhì)粒上組合了含RNA聚合酶II啟動(dòng)子的多個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)(例如，編碼1、2、3、4、5、6、 7或所有8個(gè)甲型流感mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)。參考文獻(xiàn)30所述方法的優(yōu)選方面包括(a) 一個(gè)質(zhì)粒上的PB1、PB2和PA mRNA編碼區(qū)；和(b) —個(gè)質(zhì)粒上的所有8個(gè)vRNA編碼區(qū)段。 在一個(gè)質(zhì)粒上包含NA和HA區(qū)段和在另一質(zhì)粒上包含6個(gè)其它區(qū)段也是有利的。作為使用poll啟動(dòng)子編碼病毒RNA區(qū)段的替代方式，還可能用細(xì)菌噬菌體聚合酶啟動(dòng)子[31]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的啟動(dòng)子。由于poll啟動(dòng)子的種屬特異性，噬菌體聚合酶啟動(dòng)子對于許多細(xì)胞類型(例如，MDCK)更方便，但還必須用編碼外源性聚合酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 在其它技術(shù)中，可采用雙重polI和polII啟動(dòng)子從一個(gè)模板同時(shí)編碼病毒RNA和可表達(dá)的mRNA [32，33]。因此，甲型流感病毒可包含來自A/PR/8/34病毒的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段(通常是 A/PR/8/34的6個(gè)區(qū)段，其中HA和N區(qū)段來自疫苗毒株，即6 2重配株)。還可包含A/ WSN/33病毒或用于生產(chǎn)疫苗制備用重配病毒的任何其它病毒毒株的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段。 甲型流感病毒可包括少于6個(gè)(即O、1、2、3、4或5個(gè))來自AA/6/60流感病毒的病毒區(qū)段 (A/Ann Arbor/6/60)。乙型流感病毒可包括少于6個(gè)(即O、1、2、3、4或5個(gè))來自AA/1/66 流感病毒的病毒區(qū)段(B/Arm Arbor/1/66)。通常，本發(fā)明抵御能人向人傳播的毒株，因此該毒株的基因組一般包含源自哺乳動(dòng)物(例如人)流感病毒的至少一個(gè)RNA區(qū)段。其可包含源自禽流感病毒的NS區(qū)段。其抗原可包含在組合物中的毒株可對抗病毒治療具有耐受性(如耐奧司他韋和/或耐扎那米韋)，包括耐藥性流行性毒株[35]。流感病毒可以被減毒。流感病毒可以是溫度敏感的。流感病毒可以是冷適應(yīng)性的。 當(dāng)使用活病毒作為抗原時(shí)，這三種特征特別有用。特別有用的毒株是那些從分離自患者開始到在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中復(fù)制的任何階段 (包括分離和在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中復(fù)制)都未通過雞蛋傳代的毒株。可在從分離到病毒復(fù)制的所有步驟中都只用MDCK細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明使用的毒株的血凝素相對于具有Sia(a 2，3)Gal末端二糖的寡糖而言對具有Sia(α 2，6)Gal末端二糖的寡糖具有結(jié)合偏好。人流感病毒結(jié)合具有Sia(a 2，6)Gal (唾液酸以α 2，6方式連接于半乳糖)末端二糖的受體寡糖，而雞蛋和 Vero細(xì)胞的受體寡糖具有Sia (α 2，3) Gal末端二糖。人流感病毒在細(xì)胞如MDCK中的生長提供了針對血凝素的選擇壓力，以維持天然的Sia(a 2，6)Gal結(jié)合，這與雞蛋傳代不同。為了測定病毒是否相對于具有Sia(a 2，3)Gal末端二糖的寡糖對具有Sia(a 2， 6)Gal末端二糖的寡糖具有結(jié)合偏好，可進(jìn)行各種檢測。例如，參考文獻(xiàn)36描述了一種檢測流感病毒受體-結(jié)合活性的固相酶聯(lián)檢測，該檢測提供敏感和定量的親和常數(shù)測量值。 參考文獻(xiàn)37使用固相檢測，其評估了病毒對兩種不同的唾液酸基糖蛋白的結(jié)合(卵類粘蛋白，具有Sia ( α 2，3) Gal決定簇；和豬α 2-巨球蛋白，具有Sia ( α 2，6) Gal決定簇)，該文獻(xiàn)還描述了評估病毒對兩種受體類似物游離唾液酸(Neu5Ac)和3’ -唾液酸基乳糖 (Neu5Aca2-3Gal^l-4Glc)的結(jié)合的檢測。參考文獻(xiàn)38報(bào)道了一種使用能清楚區(qū)分針對 α 2，3或α 2，6連接的受體偏好的聚糖陣列進(jìn)行的檢測。參考文獻(xiàn)39報(bào)道了一種基于人紅血球的凝集的檢測，該人紅血球經(jīng)酶學(xué)修飾含有Sia ( α 2，6) Gal或Sia ( α 2，幻Gal。根據(jù)檢測的類型，該檢測可直接使用病毒自身，或可間接使用由病毒純化得到的血凝素進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明使用的流感毒株具有其糖基化模式不同于雞蛋衍生病毒的糖蛋白(包括血凝素)。因此，糖蛋白將包括在雞蛋中未發(fā)現(xiàn)的糖形。細(xì)胞系用于本發(fā)明的疫苗的制備可使用SPF雞蛋作為底物進(jìn)行病毒生長，其中從感染的母雞雞蛋的尿囊液收集病毒。但是，可使用支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系取代雞蛋。細(xì)胞系通常是哺乳動(dòng)物來源的。合適的哺乳動(dòng)物來源細(xì)胞包括但不限于倉鼠、牛、靈長類(包括人和猴)和犬細(xì)胞，但靈長類動(dòng)物細(xì)胞不是優(yōu)選的?？衫酶鞣N細(xì)胞類型，例如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞等。合適的倉鼠細(xì)胞的例子是名為ΒΗΚ21或HKCC的細(xì)胞系。 合適的猴細(xì)胞是，例如非洲綠猴細(xì)胞，例如腎細(xì)胞，如Vero細(xì)胞系W0-42]。合適的犬細(xì)胞是，例如腎細(xì)胞，如CLDK和MDCK細(xì)胞系。因此，合適的細(xì)胞系包括但不限于=MDCK ；CHO ；CLDK ；HKCC ；293Τ ；BHK ；Vero ； MRC-5 ；PER. C6[43] ；FI hL2 ;WI_38 ；等等。這些細(xì)胞系可廣泛獲自，例如美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCCK44]、寇里爾細(xì)胞保藏中心(Coriell Cell Repositories) [45]或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)。例如，ATCC 提供目錄號(hào)為 CCL-81、CCL-81. 2、CRL-1586 和 CRL-1587 的各種不同Vero細(xì)胞，目錄號(hào)為CCL-34的MDCK細(xì)胞。PER. C6可以保藏號(hào)9602^40獲自 ECACC0最優(yōu)選的細(xì)胞系是具有哺乳動(dòng)物型糖基化的那些細(xì)胞系。作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的次優(yōu)替代，也可以用禽細(xì)胞系培養(yǎng)病毒[例如，參考文獻(xiàn)46-48]，這包括鴨細(xì)胞系(例如，鴨的視網(wǎng)膜)或雞細(xì)胞系。禽細(xì)胞系的例子包括禽胚胎干細(xì)胞[46，49]和鴨視網(wǎng)膜細(xì)胞W7]。 合適的禽胚胎干細(xì)胞包括來源于雞胚胎干細(xì)胞的EBx細(xì)胞系EB45、EB14和EB14_074[50]。 也可以使用雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)。但是，與使用禽細(xì)胞不同，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞意味著疫苗將不含禽類DNA和雞蛋蛋白(例如卵清蛋白和卵類粘蛋白)，由此可以降低過敏性。培養(yǎng)流感病毒最優(yōu)選的細(xì)胞系是MDCK細(xì)胞系[51-54]，該細(xì)胞系源于馬-達(dá)二氏(Madin-Dardy)犬腎。原始的MDCK細(xì)胞系可從ATCC獲得，編號(hào)為CCL-34，但也可以使用這個(gè)細(xì)胞系的衍生物和其它MDCK細(xì)胞系。例如，參考文獻(xiàn)51公開了一種適化后能在懸浮培養(yǎng)物中生長的MDCK細(xì)胞系(“MDCK33016”，保藏編號(hào)為DSM ACC 2219)。同樣，參考文獻(xiàn)55公開了一種能在無血清培養(yǎng)物中懸浮生長的MDCK衍生的細(xì)胞系(“B-702”，保藏編號(hào)為FERM BP-7449)。參考文獻(xiàn)56公開了非致瘤性MDCK細(xì)胞，包括“MDCK-S”(ATCC PTA-6500)、“MDCK-SF101，，(ATCC PTA-6501)、"MDCK-SF102，，(ATCC PTA-6502)禾口 “MDCK-SF103”(PTA-650;3)。參考文獻(xiàn)57公開了對感染高度易感的MDCK細(xì)胞系，包括 “MDCK. 5F1”細(xì)胞(ATCC CRL-12042)。這些MDCK細(xì)胞系都可以使用。病毒可以在貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中生長。也可以采用微載體培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，可改造細(xì)胞使其適應(yīng)懸浮生長。優(yōu)選將細(xì)胞系培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基和/或不含蛋白的培養(yǎng)基中。在本發(fā)明中稱某培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基表示，該培養(yǎng)基中不含來源于人或動(dòng)物血清的添加物。在這種培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞天然地包含其自身的蛋白質(zhì)，但是不含蛋白的培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)被理解為這樣的培養(yǎng)基在沒有蛋白質(zhì)、生長因子、其他蛋白添加物和非血清蛋白的情況下細(xì)胞能夠在其中繁殖(如，在感染前)，但是可選地包含如胰蛋白酶或可能為病毒生長所需的其他蛋白酶之類的蛋白。在病毒復(fù)制期間，支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系以在37°C以下培養(yǎng)為佳[58](例如 30-36°C，或約 30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C )。在培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增流感病毒的方法通常包括用待生長的毒株接種物接種細(xì)胞培養(yǎng)物，將被感染的細(xì)胞培養(yǎng)一段所需時(shí)間來擴(kuò)增病毒，例如根據(jù)病毒滴度或抗原表達(dá)情況確定(例如接種后M到168小時(shí))，以及收集擴(kuò)增的病毒。以1 500到1 1的病毒 (根據(jù)PFU或TCID5tl測定)細(xì)胞比接種培養(yǎng)的細(xì)胞，優(yōu)選1 100到1 5，更優(yōu)選1 50 到1 10。將病毒加到細(xì)胞懸液中或細(xì)胞單層上，在25°C到40°C、優(yōu)選到37°C，讓病毒吸附到細(xì)胞上，歷時(shí)至少60分鐘，但是一般不超過300分鐘，優(yōu)選90到240分鐘?？赏ㄟ^凍融或通過酶作用分離感染的細(xì)胞培養(yǎng)物(例如細(xì)胞單層)，以增加收獲的培養(yǎng)物上清中的病毒含量。然后對收獲的液體進(jìn)行滅活或凍存。培養(yǎng)細(xì)胞按約0. 0001到10的感染復(fù)數(shù)(“m.o. i. ”)感染，優(yōu)選約0.002到5，更優(yōu)選0.001到2。更優(yōu)選的是，細(xì)胞按約0. 01 的m. ο. i.感染?？稍诟腥竞?0到60小時(shí)收獲被感染的細(xì)胞。優(yōu)選在感染后34到48小時(shí)收獲細(xì)胞。更優(yōu)選在感染后38到40小時(shí)收獲細(xì)胞。通常在細(xì)胞培養(yǎng)期間添加蛋白酶 (一般是胰蛋白酶)以使病毒釋放?？稍谂囵B(yǎng)期間任何合適的階段添加蛋白酶，例如，在接種前，在接種的同時(shí)或接種后[58]。在一些實(shí)施方式中，特別是采用MDCK細(xì)胞的實(shí)施方式中，細(xì)胞系從主工作細(xì)胞庫傳代的群體倍增水平不超過40。病毒接種物和病毒培養(yǎng)物最好不含(S卩，已檢測污染且污染檢測結(jié)果呈陰性)單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、 多瘤病毒、雙核糖核酸病毒、環(huán)狀構(gòu)象病毒和/或細(xì)小病毒[59]。特別好的是不含單純皰疹病毒。宿主細(xì)胞DNA如病毒已在細(xì)胞系上生長，那么盡可能減少最后疫苗內(nèi)殘存細(xì)胞系DNA就是標(biāo)準(zhǔn)操作，這是為了盡可能消除該DNA的致瘤性。因此，根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗組合物優(yōu)選每個(gè)劑量包含IOng以下(優(yōu)選Ing以下，更優(yōu)選IOOpg以下)的殘存宿主細(xì)胞DNA，但仍可能存在痕量的宿主細(xì)胞DNA。優(yōu)選的是包含< IOng(例如，< lng, < IOOpg)宿主細(xì)胞DNA/15 μ g血凝素的疫苗，以及包含< IOng(例如，< lng, < IOOpg)宿主細(xì)胞DNA/0. 25ml體積的疫苗。更好的是包含< IOng(例如，< lng, < IOOpg)宿主細(xì)胞DNA/50 μ g血凝素的疫苗，以及包含
<IOng (例如，< lng, < IOOpg)宿主細(xì)胞DNA/0. 5ml體積的疫苗。較好的是，任何殘存宿主細(xì)胞DNA的平均長度小于500bp，例如，小于400bp、小于 300bp、小于 200bp、小于 IOObp 等。污染性DNA可在疫苗制備過程中通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法去除，例如，色譜法等。核酸酶處理，例如DNA酶處理，可提高殘存宿主細(xì)胞DNA的清除率。降低宿主細(xì)胞DNA污染的合適方法可見參考文獻(xiàn)60和61，包括兩步處理，第一步使用DNA酶(例如，Benzonase)，可在病毒生長期使用，然后用陽離子去污劑(例如，CTAB)，可在病毒粒子裂解過程中使用。也可以采用β-丙內(nèi)酯處理進(jìn)行去除。測定殘存宿主細(xì)胞DNA現(xiàn)在是生物制品的常規(guī)法定要求，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)能力之一。用于測定DNA的方法通常是經(jīng)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)W2，63]。一項(xiàng)經(jīng)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)其性能特征可以數(shù)學(xué)和定量術(shù)語來描述，其可能的誤差原因應(yīng)是已知的。這樣的實(shí)驗(yàn)通常已就諸如精度、準(zhǔn)度、特異性等特征經(jīng)過了測試。待一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)經(jīng)過校準(zhǔn)(例如，用已知標(biāo)準(zhǔn)量的宿主細(xì)胞DNA校準(zhǔn))并測試后，就可進(jìn)行常規(guī)的定量DNA測定。有三種主要的DNA定量測定技術(shù)可以使用雜交方法，如DNA印跡(Southern Blots)或狹縫印跡(Slot Blots) [64]；免疫測定方法，如Threshold 系統(tǒng)W5]；以及定量PCR[66]。這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，但每一種方法的精準(zhǔn)度可能與待測的宿主細(xì)胞有關(guān)，例如，雜交探針的選擇、擴(kuò)增用的引物和/或探針的選擇等。分子設(shè)備(Molecular Devices)的Ilireshold 系統(tǒng)是一種可測定Pg級總DNA的定量分析方法，已被用于檢測生物藥物的污染DNA水平 W5]。典型的實(shí)驗(yàn)包括生物素化的ssDNA結(jié)合蛋白、尿素酶結(jié)合的抗ssDNA抗體和DNA之間非序列特異性地形成反應(yīng)復(fù)合物。所有檢測組分都包括在廠家生產(chǎn)的完整總DNA分析藥盒內(nèi)。許多商業(yè)制造商都提供用于檢測殘存宿主細(xì)胞DNA的定量PCR實(shí)驗(yàn)，例如AppTec 實(shí)驗(yàn)室服務(wù)公司(AppTec Laboratory Services)、BioReliance 、阿爾泰技術(shù)公司(Althea Technologies)等。參考文獻(xiàn)67對用于測定人病毒疫苗內(nèi)宿主細(xì)胞DNA污染的化學(xué)發(fā)光雜交分析和總DNA Threshold 系統(tǒng)進(jìn)行了比較。藥用組合物本發(fā)明使用的疫苗通常除流感抗原外還包含其它組分，如它們通常包含一種或多種藥用載體和/或賦形劑。有關(guān)這些組分的全面討論可參見參考文獻(xiàn)68。在許多實(shí)施方式中，還可包含佐劑。組合物在給藥時(shí)通常為水溶液形式。組合物可包含防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。優(yōu)選疫苗應(yīng)基本上不含(如
<10yg/ml)含汞物質(zhì)，例如不含硫柳汞[14，69]。不含汞的疫苗是更優(yōu)選的，α -生育酚琥珀酸鹽可作為汞化合物的替代物[14]。特別優(yōu)選的是不含防腐劑的疫苗。為了控制滲透壓(tonicity)，優(yōu)選包含生理鹽，如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其濃度可為1到20mg/ml。其他可存在的鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和/或氯化鎂等。在佐劑與抗原分開存在于不同容器時(shí)，氯化鈉可存在于兩個(gè)容器中。
組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg到400m0sm/kg，優(yōu)選M0-360m0sm/kg，更優(yōu)選 290-310m0sm/kgo本發(fā)明組合物可包含一種或多種緩沖劑。典型的緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑； Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑(特別是與氫氧化鋁佐劑一起)；或者檸檬酸鹽緩沖劑。緩沖劑的使用濃度一般為5-20mM。組合物的pH —般在5. 0到8. 1之間，更常見的是在6. 0到8. 0之間，例如6. 5-7. 5 或 7. 0-7.8。組合物最好是無菌的。組合物最好是無熱原的，例如，每劑EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量)< 1，每劑EU優(yōu)選<0.1。組合物優(yōu)選不含谷蛋白。本發(fā)明的組合物，特別是裂解疫苗或表面抗原疫苗，可包含去污劑，例如，聚氧乙烯脫水山梨酯表面活性劑(被稱為“吐溫”)、辛苯聚醇(如辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲胺(“CTAB”)或脫氧膽酸鈉。去污劑可以只以痕量存在。因此，疫苗可包含含量各低于lmg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。其它痕量存在的殘留組分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。在佐劑與抗原分開保存在不同容器時(shí)，去污劑通常存在于含有抗原的容器中(如抗原與聚山梨醇酯80和辛苯聚醇-10在一起)。組合物可包含用于單次免疫的材料，或者包含用于多次免疫的材料(即，“多劑量” 藥盒)。多劑量組合物中優(yōu)選包含防腐劑。作為多劑量組合物包含防腐劑的替代手段，或者除包含防腐劑以外，可以將組合物裝在帶有用于取用材料的無菌接配器的容器內(nèi)。流感疫苗通常以約0. 5mL的劑量體積給藥，但也可給予一半的劑量(即，約 0. 25ml)，尤其是給予兒童。優(yōu)選將疫苗存放在2°C到8°C。它們不應(yīng)被冷凍。理想的是避免光線直射。可以各種合適的容器提供疫苗，疫苗可被配制成立即可用的，或者為給藥前臨時(shí)混合的藥盒的一部分，如分開的抗原和佐劑組分(如PREPANDRIX 產(chǎn)品中的那樣)。合適的容器包括小瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻噴霧器等。這些容器應(yīng)無菌。如果將組合物/組分存于小瓶中，所述小瓶優(yōu)選由玻璃或塑料材料制成。優(yōu)選先將小瓶滅菌再加入組合物。為避免患者對乳膠過敏的問題，優(yōu)選用無乳膠的塞子密封小瓶，優(yōu)選所有包裝材料均不含乳膠。小瓶可裝有單劑量疫苗，或可裝有一劑量以上(“多劑量”小瓶)，例如10劑量。 優(yōu)選用無色玻璃制成小瓶。小瓶可裝有蓋子(例如，Luer鎖扣)，該蓋子適于將注射器插入其中。小瓶，尤其是多劑量小瓶，可具有允許無菌取出其內(nèi)容物的蓋子。如果組分包裝在注射器中，注射器可裝有針頭。如果未裝針頭，可隨注射器提供單獨(dú)的針頭用于裝配和使用。 這種針頭可以是有鞘的。優(yōu)選安全針頭。常見的是1英寸23號(hào)、1英寸25號(hào)和5/8英寸25 號(hào)針頭。注射器可裝有可剝離標(biāo)簽，其上打印了批號(hào)、流感季節(jié)和內(nèi)含物的有效期，從而有助于記錄保管。注射器的柱塞優(yōu)選具有限位器，從而能防止柱塞在抽吸期間意外掉出。注射器可裝有乳膠橡膠蓋子和/或柱塞。一次性注射器含有單劑量疫苗。在裝上針頭之前， 注射器一般裝有針帽以密封頂端，所述針帽優(yōu)選由丁基橡膠制成?？山o容器做上顯示半劑量體積的標(biāo)記，例如以有助于遞送給兒童。例如，含有 0. 5ml劑量的注射器可具有顯示0. 25ml體積的標(biāo)記。如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，則優(yōu)選使用硼硅酸鹽玻璃而不是鈉鈣玻璃制成的容器?？呻S容器裝有(例如，裝在同一盒子中)插頁，該插頁包括疫苗的細(xì)節(jié)，例如給藥說明書，疫苗中抗原的細(xì)節(jié)等。說明書還可包括警告，例如準(zhǔn)備腎上腺素溶液以防疫苗接種后的過敏反應(yīng)，等等。佐劑在使用時(shí)，本發(fā)明疫苗宜包含佐劑，佐劑的作用是增強(qiáng)在接受該組合物的患者中引起的免疫應(yīng)答(體液免疫和/或細(xì)胞免疫)。水包油乳液佐劑(尤其是含有角鯊烯的佐劑)的存在被證明可增強(qiáng)季節(jié)性[70]和大流行[71，72]流感疫苗的免疫應(yīng)答的毒株交叉反應(yīng)性。本發(fā)明所用的水包油乳液通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。乳液中的油滴直徑通常小于5μπι，甚至可具有亞微米直徑，通過微流化床實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳液。優(yōu)選小于220nm的液滴，因?yàn)樗鼈兛蛇M(jìn)行過濾除菌。本發(fā)明可使用的油諸如動(dòng)物油(如魚油)或植物油。植物油的來源包括堅(jiān)果、種籽和谷物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅(jiān)果油的代表例子。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆(jojoba bean)的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用來自其它谷類，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草(teff)、黑小麥(triticale)等的油?？蓮膱?jiān)果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適物質(zhì)制備甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是種籽油中天然產(chǎn)生的)。來自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實(shí)施本發(fā)明。由動(dòng)物來源獲得純油的過程中必需的分離、純化、皂化和其它方法的步驟是本領(lǐng)域眾所周知的。 大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和如鯨蠟的鯨油是可以用于本發(fā)明的幾種魚油的代表例子。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，它們總稱為萜類化合物。鯊魚肝油含有稱為角鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，即2，6，10，15， 19，23-六甲基_2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯。也可采用角鯊烯的飽和類似物角鯊?fù)?(squalane)。魚油，包括角鯊烯和角鯊?fù)?，易于從商業(yè)來源獲得，或可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。優(yōu)選角鯊烯。其他有用的油是生育酚，它宜包含在針對老年患者(如年齡大于60歲或更大的患者)的疫苗中，因?yàn)閾?jù)報(bào)道維生素E在此患者群體中對免疫應(yīng)答有正面作用[73]。它們也具有抗氧化特性，這種特性有助于穩(wěn)定該乳液[74]。存在各種生育酚(α、β、Y、δ、ε或 ξ )，但通常使用α -生育酚。優(yōu)選的α -生育酚是DL- α -生育酚。已知琥珀酸α -生育酚與流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐劑[14]?？墒褂糜偷幕旌衔铮?，角鯊烯和α -生育酚的混合物。油含量通常為2-20% (體積)?？赏ㄟ^'HLB'(親水/親脂平衡)對表面活性劑分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16?？梢耘c本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨醇酯20 和聚山梨醇酯80 ；以商品名D0WFAX 出售的環(huán)氧乙烷(Ε0)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷 (BO)的共聚物，如線性ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；乙氧基(氧-1，2-乙二基)重復(fù)數(shù)量不同的辛活性劑。用于乳液的最優(yōu)選的表面活性劑是聚山梨醇酯80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯；吐溫80)?？墒褂帽砻婊钚詣┑幕旌衔?，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和辛苯聚醇的組合也適用。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚9和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。優(yōu)選的表面活性劑的用量(重量％ )為聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(如吐溫 80)0. 01-1%，特別是約0. ；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污劑)0. 001-0. 1%，特別是0. 005-0. 02% ；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚 9)0. 1-20%，優(yōu)選 0. 1-10%，特別是 0. 1-1%或約 0.5%。優(yōu)選含角鯊烯的水包油乳液，特別是含有聚山梨醇酯80的那些乳液。本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于 角鯊烯、聚山梨醇酯80和失水山梨糖醇三油酸酯的亞微米乳液。該乳液的體積組成可以是約5%角鯊烯、約0. 5%聚山梨醇酯80和約0. 5%司盤85。以重量計(jì)，這些比例為4. 3%角鯊烯、0. 5%聚山梨醇酯80和0. 48%司盤85。這種佐劑稱為‘MF59，[75-77]，參考文獻(xiàn)78的第10章和參考文獻(xiàn)79的第12章更詳細(xì)地描述了該佐劑。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 角鯊烯、生育酚和聚山梨醇酯80的亞微米乳液。這些乳液可含有2-10%角鯊烯、2-10%生育酚和0. 3-3%聚山梨醇酯80，角鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選< 1(例如 0.90)，因?yàn)檫@能提供更穩(wěn)定的乳液。角鯊烯和聚山梨醇酯80的體積比可以約為5 2，或者重量比約為11 5?？赏ㄟ^下述方法制備一種這樣的乳液將吐溫80溶解于PBS得到 2%溶液，然后將90ml該溶液與5g DL-α-生育酚和5ml角鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液含有平均直徑為如100-250nm，優(yōu)選約ISOnm的亞微米油滴。該乳液也可含有3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3d-MPL)。此種類型的另一種有用乳液可包含 (每個(gè)人用劑量)0. 5-10mg角鯊烯、0. 5-1 Img生育酚和0. Hmg聚山梨醇酯80 [80]。 角鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可包含 3d-MPL(見下文)。該乳液可含有磷酸鹽緩沖劑。 含有聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75 11 10(如 7501^/1111聚山梨醇酯80，1101^/1111曲通Χ-100和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。該乳液還可包含角鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL。水相可含有磷酸鹽緩沖劑。 角鯊烯、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401 (〃普流羅尼克(Pluronic) L121") 的乳液。可以用PH 7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽的遞送載體，已在〃 SAF-I “佐劑(0.05-1% Thr-MDP、5%角鯊烯、2. 5%普流羅尼克L121和0. 2%聚山梨酸酯80) [81]中與蘇氨酰-MDP —起使用。也可不與Thr-MDP —起使用，例如〃 AF"佐劑(5%角鯊烯、1.25%普流羅尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80) [82]。優(yōu)選微流體化。 含有角鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯(1 十六烷基一十八烷基醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如失水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如失水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳液優(yōu)選為熱可逆的和 /或其中至少90%油滴(以體積計(jì))的尺寸小于200nm[83]。該乳液也可含有以下一種或多種物質(zhì)醛醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。該乳液可包含TLR4激動(dòng)劑[84]。這類乳液可以被凍干。 角鯊烯、泊洛沙姆105和Abil-Care的乳液[85]。含佐劑疫苗中這些組分的終濃度(重量)是5%角鯊烯、4%泊洛沙姆105(普流羅尼克多元醇)和2% Abil-Care 85 (雙-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。 含有0. 5-50%油、0. 1-10%磷脂和0. 05_5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)86所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸。 不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿?，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GPI-0100，參見參考文獻(xiàn) 87)、二甲基二-十八烷基溴化銨和/或N，N- 二-十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。 皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[88]。 包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[89]。 包含礦物油、非離子親水性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[89]?？稍谝呙缰苽溥^程中將乳液與抗原混合，或者可以獨(dú)立的組分提供，以在遞送時(shí)與獨(dú)立的含抗原組分臨時(shí)混合(如PREPANDRIX 產(chǎn)品那樣)。這兩種組分是液體時(shí)，混合兩種液體的體積比可變(例如5 1-1 5)，但通常約為1 1?？乖妥魟┗旌虾?，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，如果有，也是很少的血凝素會(huì)進(jìn)入該乳液的油相。在一些實(shí)施方式中，第一疫苗和第二疫苗中僅有一種含有佐劑(優(yōu)選是第一疫苗含有)。但優(yōu)選的是，兩種疫苗都含有佐劑，通常使用相同的佐劑。疫苗給藥將疫苗用于在患者中引起免疫應(yīng)答的方法中，所述方法包括給予該患者本發(fā)明組合物的步驟。本發(fā)明的方法、藥盒和用途通常被用于產(chǎn)生抗體應(yīng)答，優(yōu)選是保護(hù)性抗體應(yīng)答。本領(lǐng)域周知評估流感病毒接種后的抗體反應(yīng)、中和能力和保護(hù)作用的方法。人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗人流感病毒血凝素的抗體滴度與保護(hù)作用呈正相關(guān)關(guān)系(血清樣本內(nèi)血凝素抑制滴度達(dá)到約30-40時(shí)產(chǎn)生約50%的針對同源病毒感染的保護(hù)作用)[90]?？贵w反應(yīng)一般用血凝素抑制、微量中和法、單輻射免疫擴(kuò)散(SRID)和/或單輻射溶血分析(SRH)來測得。可采用假型(pseudotype)分析。所有這些分析技術(shù)就是都是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明的組合物可以多種途徑給藥。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉注射(例如，注射到胳膊或大腿內(nèi))，但是其他可用的途徑還有皮下注射、鼻內(nèi)給藥[91-93]、經(jīng)口給藥[94]、 含服(buccal)、舌下、皮內(nèi)[95，96]、經(jīng)皮、透皮給藥[97]等。按照本發(fā)明的方法制備的疫苗可用于治療兒童和成人。目前推薦將流感疫苗用于兒科和成人免疫接種，從6個(gè)月大開始。因此，患者可以是1歲以下、1-5歲、5-15歲、15-55 歲或55歲以上。優(yōu)選的疫苗接種者有高齡的(例如彡50歲、彡60歲，優(yōu)選彡65歲)、低齡的(例如，< 5歲)、住院患者、醫(yī)療保健人員、軍隊(duì)服務(wù)人員和軍事人員、孕婦、慢性病患者、免疫缺陷患者、接種疫苗前7天內(nèi)服用過抗病毒化合物(例如，奧司他韋或扎那米韋；見下文)的患者、對雞蛋過敏的人以及到國外旅行的人。疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更多其他人群。疫苗可以在大流行前(即大流行發(fā)生前)給予，或在大流行時(shí)(即大流行爆發(fā)開始之后)給予。本發(fā)明的優(yōu)選組合物可滿足療效CPMP標(biāo)準(zhǔn)的1、2或3條。對于成人來說(18_60 歲)，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)彡70%的血清保護(hù)；(2)彡40%的血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT升高彡2. 5倍。對于高齡患者來說(> 60歲)，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)彡60%的血清保護(hù)；(2) ^30% 的血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT升高> 2倍。這些標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)至少包括50個(gè)患者的開放標(biāo)簽研究(Open Label Study)制定的。本發(fā)明生產(chǎn)的疫苗可與其他疫苗一起基本同時(shí)(例如，在同一次醫(yī)療咨詢或或訪問健康護(hù)理專業(yè)人員或疫苗接種中心期間)給藥，如基本上同時(shí)與下述疫苗給予麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的乙型流感嗜血桿菌疫苗、滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗、乙肝疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(如四價(jià)A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)疫苗等。對于高齡患者來說優(yōu)選與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本上同時(shí)給藥。同樣，本發(fā)明的疫苗可與抗病毒化合物基本上同時(shí)給藥(例如，在同一次醫(yī)療咨詢或看醫(yī)生期間)，特別是抗流感病毒的抗病毒化合物(例如，奧司他韋和/或扎那米韋)。這些抗病毒化合物包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如(3R，4R，5Q-4-乙酰基氨基-5-氨基-3 (1-乙基丙氧基)-1-環(huán)己烯-1-羧酸或5-(乙?；被?-4-[(氨基亞胺甲基)-氨基]-2，6-無水-3,4,5-三脫氧-D-甘油-D-半乳糖酮_2_烯酸(galactonon-2-enonic acid)，包括其酯(例如，乙酯)和其鹽(例如，磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒化合物是(3R，4R， 5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-環(huán)己烯-1-羧酸、其乙酯和磷酸鹽 (1 1)，也被稱為磷酸奧司他韋(oseltamivir phosphate)(達(dá)菲(TAMIFLU ))。方案本發(fā)明的方法涉及給予兩劑大流行相關(guān)抗原，其中隔1周、2周或6周給予這兩劑。 給予這兩劑期間不給予大流行相關(guān)抗原，但第二劑后可進(jìn)一步給予大流行相關(guān)抗原。在隔1周給予兩劑時(shí)，它們可正好隔7天給予(如，在連續(xù)的兩個(gè)星期一)，但根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐可存在一些誤差。同樣地，隔2周或6周給予的劑量也可存在誤差。因此，兩劑可以隔χ到y(tǒng)天給予。在第一實(shí)施方式中，X的值是5，y的值是9。在第二實(shí)施方式中，χ的值是6，y的值是8。在第三實(shí)施方式中，χ的值是12，y的值是16。在第四實(shí)施方式中，χ的值是13，y 的值是15。在第五實(shí)施方式中，χ的值是35，y的值是49。在第六實(shí)施方式中，χ的值是38， y的值是46。在第七實(shí)施方式中，χ的值是40，y的值是44。在第八實(shí)施方式中，χ的值是 41，y的值是43。在一些實(shí)施方式中，χ和y相同，在這種情況下，短語“χ到y(tǒng)”僅指X，而χ為7、14 或42。概述術(shù)語“含有”包括“包含”以及“由…組成”，例如“含有” X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。術(shù)語〃基本上〃不排除〃完全〃，如〃基本上不含〃 Y的組合物可能完全不含Y。 必要時(shí)，可從本發(fā)明定義中刪去術(shù)語"基本上"。與數(shù)值χ相關(guān)的術(shù)語“約”是任選的，其表示(例如)x士 10%。除非另有說明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的方法不要求任何特定的混合順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時(shí)，兩種組分可以相互混合，然后將混合的組分再與第三種組分混合等。將動(dòng)物(特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，它們應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病 (TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源?？傊瑑?yōu)選在完全不含動(dòng)物來源物質(zhì)的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞底物用于重配或反向遺傳學(xué)方法時(shí)，或用于培養(yǎng)病毒時(shí)，優(yōu)選批準(zhǔn)用于人類疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞底物，例如Wi Eur總綱5. 2. 3所述的細(xì)胞底物。實(shí)施本發(fā)明的方式對年齡在18到60歲的約240位患者進(jìn)行預(yù)期的、隨機(jī)的III期開放標(biāo)簽研究。對象以1 1 1 1的比例隨機(jī)分組，接受4種不同的疫苗接種方案中的一種。隔1、2、3 或6周肌肉內(nèi)給予疫苗到三角肌(優(yōu)選非慣用臂的三角肌)。每次疫苗接種前(訪問1和 2)和第二次疫苗接種后3周(訪問幻從所有對象采血，用于通過血凝反應(yīng)抑制(HI)、微量中和(MN)和單徑向溶血分析(SRH)評估免疫原性。進(jìn)一步測試2周組和3周組的血樣，以檢測該組針對異源H5m (A/turkey/Turkey/1/105)抗原的免疫應(yīng)答。所有患者都給予相同的疫苗，即0. 5mL單價(jià)表面抗原疫苗，其含有7. 5 μ g來自A/ H5N1毒株的血凝素。該疫苗含有水包MF59 角鯊烯乳液，通過混合0. 25mL的h佐劑和 0. 25mL的h抗原而制得。該疫苗以預(yù)填充注射器的形式提供，溢出至多0. 05ml?；趯ν匆呙缈乖?NIBRG14，進(jìn)化枝1)的MN、HI和SRH檢測，第一劑疫苗后2、 3或6周接受第二劑疫苗的組滿足所有CHMP標(biāo)準(zhǔn)。與3周組(72% )相比，2周組和6周組接受第二劑后的血清轉(zhuǎn)化率較高(分別為76%和79% )。同樣地，2周組和6周組中麗檢測中顯示4倍增加的患者百分比(分別為75%和90%)也高于3周組的百分比(73%)。 如SRH所示，該疫苗還誘導(dǎo)了針對異源A/turkey/Turkey/1/105的異源免疫保護(hù)。1周組、2周組和6周組的患者顯示較少的局部不良事件，如疫苗引起的疼痛、充血、腫脹(見表1)。
15
應(yīng)理解，僅以實(shí)施例的方式描述了本發(fā)明，在維持本發(fā)明的范圍和精神的情況下可做出任何改動(dòng)。表1 顯示誘發(fā)的局部不良事件的患者百分比
給予第--劑疫苗后給予第二劑疫苗后1周組2周組3周組6周組1周組2周組 3周組6；疼痛736570633734 4837充血0-0121203 85腫脹 0130]3 參考文獻(xiàn)210700 75[1] Leroux-Roels 等，(2008)PLoS ONE 3(2) :el665. doi 10. 1371/journal. pone.0001665[2]Bresson 等，(2006)Lancet 367:1657-64.[3]Levie 等，(2008) J Infect Dis 198 :642-9.[4] 印henson 等，(2008)NEJM 359:1631-3.[5]Nolan 等，(2008) Vaccine 26:4160-7.[6]mirlich 等，(2008)NEJM 358:2573-84.[7]Girard 等，(2008) Vaccine 26:4975-7.[8]Zangwill 等，(2008) J Infect Dis 197 :580-3.[9]Ruat 等，(2008) J Virol 82 :2565-9.[10]W002/28422.[ll]W002/067983.[12]W002/074336.[13]W001/21151.[14]W002/097072.[15]W02005/113756.[16]Huckriede 等，Q003)Methods Enzymol 373 :74-91.[17]de Vries 等，(2009)Vaccine 27:945-55.[18]Treanor (1996) J Infect Dis 173:1467-70.[19]Keitel 等，(1996)Clin Diagn Lab Immunol3 :507-10.[20] WO 2008/068631.[21] Sandbulte 等，(2007)PLoS Med. 4(2) :e59.[22]Hoffmann 等，(2002) Vaccine 20:3165—3170·[23] Subbarao 等，(2003) Virology 305:192-200.[24]Liu 等，(2003)Virology 314:580-590.[25]0zaki 等，(2004) J. Virol 78:1851-1857.[26]Webby 等，(2004)Lancet 363:1099-1103.
[27]W000/60050.[28]W001/04333.[29]美國專利 6649372.[30]Neumann 等，U005)Proc Natl Acad Sci USA 102:16825-9.[31]W02006/067211.[32]W001/83794.[33]Hoffmann 等，(2000) Virology 267(2) :310-7.[34]Herlocher 等，(2004) J Infect Dis 190(9) :1627-30.[35]Le 等，(2005)Nature 437(7062) :1108.[36]Gambaryan 禾口 Matrosovich(1992)J Virol Methods 39(1—2) :111-23.[37]Mastrosovich 等，(1999) J Virol 73:1146-55.[38]Mevens 等，(2006) J Mol Biol 355:1143-55.[39]Couceiro 禾口 Baum(1994)Mem Inst Oswaldo Cruz 89(4) :587-91.[40]Kistner 等，(1998) Vaccine 16 :960-8.[41]Kistner 等，(1999)Dev Biol Stand 98:101-110.[42]Bruhl 等，QOOO) Vaccine 19:1149-58.[43]Pau 等，QOOl) Vaccine 19:2716-21.[44]http: //www.atcc.org/[45]http :// locns. umdnj. edu/[46]W003/076601.[47]W02005/042728.[48]W003/043415.[49]WOO 1/85938.[50]W02006/108846.[51]W097/37000.[52]Brands 等，(1999)Dev Biol Stand 98:93-100.[5 Halperin 等，(2002) Vaccine 20:1240-7.[54]Tree 等，QOOl) Vaccine 19:3444-50.[55]EP-A-1260581(W001/64846).[56]W02006/071563.[57]W02005/113758.[58]W097/37001.[59]W02006/027698.[60]EP-B-0870508.[61]US 5948410.[62]Lundblad(2001)Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195—197.R3]工業(yè)指南生物分析方法有效性(Guidance for Industry =Bioanalytical MethodValidation)，美國健康和人服務(wù)部食品藥品管理局獸醫(yī)(CVM)藥物評估和研究(CDER)中心(U. S. Department of Health and Human Services Food and DrugCN 102438651 A
說明書
16/17頁
Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM))2001 年 5 月.[64] Ji 等，(2002)Biotechniques. 32 :1162-7.[65]Briggs(1991) J Parenter Sci Technol 45 :7-12.[66]Lahijani 等，(1998)Hum Gene Ther. 9 :1173-80.[67] Lokteff 等，(2001) Biologicals. 29 :123-32.[68]Gennaro (2000)《雷明頓藥劑科學(xué)和實(shí)踐》(Remington :The Science and Practice of Pharmacy).第 20 版，ISBN :0683306472.[69]Banzhoff(2000)Immunology Letters 71 :91-96.[70]0' Hagan(2001)Expert Rev Vaccines. 6 (5) :699-710.[71]Bernstein 等，(2008) J Infect Dis. 197(5) :667-75.[72] 印henson 等，(2005) J Infect Dis. 191(8) :1210-5.[73]Han等，(2005)從營養(yǎng)、免疫功能和健康角度看維生素E對年老者免疫功能禾口感染疾病的影口向(Impact of Vitamin E on Immune Function and Infectious Diseases in the Aged at Nutrition, Immune functions and Health),歐洲會(huì)議 (EuroConference)，巴黎，2005 年 6 月 9-10 日·[74]US-6630161.[75]W090/14837.[76]Podda 禾口 Del Giudice (2003)Expert Rev Vaccines 2 :197-203.[77]Podda(2001)Vaccine 19 :2673-2680.[78]疫苗設(shè)計(jì)亞單位和佐劑方法(Vaccine Design :The Subunit and Adjuvant Approach) (Powell 和 Newman 編輯)，普萊努出版社(Plenum)，1995 (ISBN 0-306-44867-X.[79]疫苗佐劑制備方法和研究手段(《分子醫(yī)學(xué)方法》叢書第42卷)〔Vaccine Adjuvants !Preparation Methods and Research Protocols(Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series) ), ISBN :1-59259-083-7. 0' Hagan 編.[80]W02008/043774.
[81]Allison 和 Byars(1992)Res Immunol 143 :519-25.
[82]Hariharan 等，(1995)Cancer Res 55:3486-9.
[83]US-2007/0014805.
[84]US-2007/0191314.
[85]Suli 等，(2004)Vaccine 22(25-26) :3464-9.
[86]W095/11700.
[87]美國專利 6，080，725.
[88]W02005/097181.
[89]W02006/113373.
[90]Potter 和 Oxford(1979)Br Med Bull 35:69-75
[91]Greenbaum 等，Q004)Vaccine 22:2566-77.
[92]Zurbriggen 等，(2003)Expert Rev Vaccines 2:295-304,
[93]Piascik(2003)JAm Pharm Assoc(Wash DC) · 43 728-30.
[94]Mann 等，(2004) Vaccine 22:2425—9.[95]Halperin 等，(1979)Am J Public Health 69:1247-50.[96]Herbert 等，(1979) J Infect Dis 140 :234-8.[97]Chen 等，(2003) Vaccine 21:2830—6.
權(quán)利要求
1.一種免疫人的方法，該方法包括以下步驟(a)給予該人第一疫苗，所述第一疫苗含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原；和w周后，(b)給予同一人第二流感疫苗，該第二流感疫苗含有來自該大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原，其中，w是1、2或6。
2.含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第一和第二流感疫苗，用于通過權(quán)利要求1所述的方法免疫人。
3.各含有來自相同的大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第一和第二疫苗在制備用于免疫人的藥劑中的用途，其中所述第一和第二疫苗隔w周給予同一個(gè)人，w為1、2或6。
4.含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第一疫苗在制備用于預(yù)先免疫將在w 周后接受含有來自該大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第二疫苗的人的藥劑中的用途，其中，w為1、2或6。
5.含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第二疫苗在制備用于免疫在接受該第二疫苗前w周已接受含有來自該大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第一疫苗的人的藥劑中的用途，其中，w為1、2或6。
6.含有第一和第二疫苗的藥盒，所述第一和第二疫苗各自含有來自相同大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原，所述第一和第二疫苗隔W周給予人，W為1、2或6。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述第一和第二疫苗都是滅活病毒疫苗。
8.如權(quán)利要求7所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述第一和第二疫苗都是裂解病毒粒子疫苗或都是純化的表面抗原疫苗。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述大流行相關(guān)流感病毒毒株具有H5血凝素亞型。
10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述第一和第二疫苗用含角鯊烯的水包油乳液佐劑作為佐劑。
11.如權(quán)利要求10所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述乳液具有亞微米油滴，含有角鯊烯、聚山梨醇酯80和失水山梨糖醇三油酸酯。
12.如權(quán)利要求10所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述乳液具有亞微米油滴，含有角鯊烯、DL-α -生育酚和聚山梨醇酯80。
13.如權(quán)利要求10所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述乳液具有亞微米油滴，含有角鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑和疏水性非離子型表面活性劑。
14.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述第一和第二疫苗都不含有硫柳汞。
15.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述第一和第二疫苗以約0. 5ml的劑量體積給予。
16.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法、疫苗、用途或藥盒，其特征在于，所述第一和第二疫苗通過肌肉內(nèi)注射給予。
全文摘要
與已知的隔3-4周給予大流行相關(guān)抗原以進(jìn)行免疫的方案不同，根據(jù)本發(fā)明，兩劑大流行相關(guān)流感抗原隔1周、2周或6周給予人對象。因此，本發(fā)明提供一種免疫人的方法，該方法包括(a)給予該人含有來自大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第一疫苗；和1、2或6周后，(b)給予該人含有來自該大流行相關(guān)流感病毒毒株的抗原的第二流感疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/145GK102438651SQ201080016360
公開日2012年5月2日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者E·弗拉加帕尼, N·格羅斯 申請人:諾華有限公司