專利名稱：射頻場(chǎng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用和用于腹腔鏡處理的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于處理組織的裝置和方法以及能量轉(zhuǎn)移對(duì)細(xì)胞的作用。在一個(gè)特別 方面，本發(fā)明涉及射頻/微波處理裝置的用途及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的作用，并且在一個(gè) 更具體的實(shí)施方式中，其對(duì)子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的作用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及射頻/微 波能量在所需群體中影響細(xì)胞生長(zhǎng)的用途，同時(shí)基本上避免對(duì)鄰近或附近細(xì)胞的有害加熱 和破壞作用。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及能量處理對(duì)細(xì)胞和組織的控制。如下文所示， 對(duì)細(xì)胞短的集中處理導(dǎo)致細(xì)胞增殖速率的顯著減少和/或細(xì)胞DNA的降解?；趯?duì)特定細(xì) 胞和組織的作用，可以設(shè)計(jì)和/或控制處理以避免或基本上避免對(duì)周圍細(xì)胞的熱破壞。處 理的裝置和方法可以在許多疾病條件中使用，包括但不限于子宮內(nèi)膜異位。發(fā)明關(guān)聯(lián)性和相關(guān)領(lǐng)域描述存在通過(guò)暴露于射頻(RF)能量用于誘導(dǎo)對(duì)活細(xì)胞的毒性作用的各種方法。對(duì)于 大多數(shù)部分，在這些處理中使用的RF場(chǎng)給細(xì)胞加熱，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡或損害。由于幾個(gè) 原因，包括細(xì)胞之間和組織內(nèi)的熱轉(zhuǎn)移，該作用一般包括相對(duì)大的面積并且不限于特定細(xì) 胞。作為細(xì)胞增殖性疾病的一個(gè)類型，子宮內(nèi)膜異位是特征在于組織如子宮內(nèi)膜 (子宮的襯里)的生長(zhǎng)超過(guò)子宮或在子宮外的常見(jiàn)醫(yī)學(xué)病狀。該疾病影響全世界估計(jì) 90，000，000名女性(通常約30至40歲從未懷孕過(guò)的女性)。在其他罕見(jiàn)病例中，子宮內(nèi) 膜異位也在皮膚、肺、眼、橫膈膜和腦組織中發(fā)現(xiàn)。處理一般經(jīng)由手術(shù)，并且備選方案，尤其是腹腔鏡或最低限度侵入性的方法是希 望的。然而，一般的RF裝置和處理不是特異性的，具有副作用，并且不采用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的控 制作用。發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明滿足了用于處理增殖性或受損害細(xì)胞的改良方法的需要。在 其他方面，該方法可以用于引起細(xì)胞損害并且在特定細(xì)胞或組織子集中誘導(dǎo)修復(fù)。因此，各 種細(xì)胞處理方法和方案可以包括在本發(fā)明的范圍中。部分地，這些處理基于對(duì)經(jīng)處理細(xì)胞 的特定作用的識(shí)別，作用可以在組織內(nèi)的大小和程度中得到控制和限制。在另一個(gè)方面，本 發(fā)明的方法涉及測(cè)量射頻/微波處理對(duì)細(xì)胞和組織的作用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及減 少細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的處理。更特別地，本文的發(fā)現(xiàn)指出通過(guò)射頻/微波(RF/EMFs)場(chǎng)處理子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞、 基質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞抑制了它們?cè)鲋澈图湫纬赡芰?。因此，RF/MW處理可以是用于各 種細(xì)胞和組織處理方法的重要工具和方法，所述處理方法包括子宮內(nèi)膜異位病變的腹腔鏡 處理、衰老或受損害皮膚的處理、以及人和動(dòng)物的相似處理。本公開(kāi)內(nèi)容自始至終，申請(qǐng)人參考期刊論文、專利文件、出版參考文獻(xiàn)、網(wǎng)頁(yè)和其
3他信息來(lái)源。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用任何所引用的信息來(lái)源的完整內(nèi)容，以利用且使用 本發(fā)明的方面。各自和每一個(gè)所引用的信息來(lái)源特別通過(guò)引用整體合并入本文。允許或需 要時(shí)，這些來(lái)源的部分可以包括在這個(gè)文件中。然而，本公開(kāi)內(nèi)容中特別定義或解釋的任何 術(shù)語(yǔ)或短語(yǔ)的含義不應(yīng)由任何來(lái)源的內(nèi)容修飾。下述說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例僅示例本發(fā)明的范圍 和本公開(kāi)內(nèi)容的內(nèi)容，并且不限制本發(fā)明的范圍。事實(shí)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)想且構(gòu)建 下文列出的實(shí)施例的眾多修飾，而不背離本發(fā)明的范圍。附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了在用多個(gè)時(shí)間段的MW能量處理后8小時(shí)測(cè)量的增殖性細(xì)胞的％的曲 線圖。使子宮內(nèi)膜(EM Che-I)細(xì)胞與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞相比較。圖2描述了在用多個(gè)時(shí)間段的MW能量處理后72小時(shí)測(cè)量的增殖性細(xì)胞的％的曲 線圖。再次，使子宮內(nèi)膜(EM Che-I)細(xì)胞與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞相比較。 在3秒或更多秒的處理后存在的增殖性細(xì)胞的百分比極低，指出這種3-5秒的處理足以抑 制在條件下的增殖。圖3、4和5顯示在對(duì)照處理、2秒MW處理(2s)和5秒MW處理(5s)后的培養(yǎng)細(xì) 胞。圖6、7和8顯示在對(duì)照處理、2秒MW處理(2s)和5秒MW處理(5s)后的培養(yǎng)細(xì) 胞。圖9A和9B顯示在對(duì)照(9A)與麗處理(9B)細(xì)胞比較中的集落形成能力。圖10顯示來(lái)自對(duì)照處理的細(xì)胞，用MW處理1秒(Is)、2秒(2s)和3秒(3s)的細(xì) 胞的凝膠電泳分離的基因組DNA。標(biāo)記DNA(M)顯示在左側(cè)。特別地在2s和3s條帶中可見(jiàn) DNA的明顯降解。示例性實(shí)施方案的詳述在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及RF/MW能量對(duì)多種細(xì)胞類型，包括子宮內(nèi)膜異位和成纖 維細(xì)胞的用途。子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞系EM. Che-Ι、正常子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì) 胞在具有10% FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于RF/MW處理， Nymax裝置(如待審批申請(qǐng)PCT/EP2007/059486或US 11/882，453中描述的裝置)用于細(xì) 胞處理。細(xì)胞在96微孔板中生長(zhǎng)，并且暴露于所需能量場(chǎng)(2450MHz)多個(gè)時(shí)間段。評(píng)估 了經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)/數(shù)天的細(xì)胞生長(zhǎng)的進(jìn)展、隨著時(shí)間的過(guò)去的集落形成能力和DNA斷裂的發(fā) 生。多種方法可以用于測(cè)量在經(jīng)處理的細(xì)胞中的這些特征或作用，包括BrDU摻入測(cè)定法、 在MATRIGEL膜中的三維細(xì)胞生長(zhǎng)操作、和通過(guò)細(xì)胞DNA的電泳。在處理后，經(jīng)處理的EM. Che-I、基質(zhì)細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)3小時(shí)、24小時(shí) 和49小時(shí)后的生長(zhǎng)曲線，顯示增殖速率的顯著減少。與基質(zhì)細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞的那種 相比較，EM. Che-I細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制更強(qiáng)烈。此外，EM. Che-I細(xì)胞的集落形成能力在處理(3 秒)后減少42% 士3，這在處理后約8天進(jìn)行評(píng)估，并且與對(duì)照相比較?？梢詫⒈疚拿枋龅奶幚矸椒ú⑷氡姸嗳撕蛣?dòng)物處理方案中，所述處理方案包括如 Chapron，等人(Hum Reproduct. 14 =329-332(1999))描述的子宮內(nèi)膜異位的處理、以及如 PCT/EP2007/059486或US 11/882,453中描述的皮膚斑點(diǎn)和皺紋的處理。涉及增殖細(xì)胞的 選擇性破壞的其他病狀例如癌癥也可以從本文描述的方法中獲益。
4實(shí)施例子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞培養(yǎng)模型(1)命名為Em Che-I的人細(xì)胞系得自來(lái)自35歲患者的腹膜結(jié)節(jié)的活組織檢查。細(xì)胞 在DMEM+10% FCS+L-谷氨酰胺+抗生素中在基底膜基質(zhì)(MATRIGEL Basement Membrane Matrix ；BDBiosciences)上生長(zhǎng)。細(xì)胞顯示出基質(zhì)樣、粘附細(xì)胞形態(tài)，并且具有在基質(zhì)中 形成集落的能力。細(xì)胞類似異常核型，但具有細(xì)胞角蛋白8、9、18標(biāo)記蛋白質(zhì)，雌激素受體 (ER)和孕酮受體(PR)的一致表達(dá)。細(xì)胞顯示于圖4和5中。子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞培養(yǎng)模型(2)經(jīng)培養(yǎng)的自體子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(圖7和8中所示)維持在補(bǔ)充有10% FCS、L_谷 氨酰胺和抗生素的DMEM培養(yǎng)基中。人皮膚成纖維細(xì)胞(圖3和6)也可以在MW處理中使用，并且用于對(duì)照，與增殖子 宮內(nèi)膜細(xì)胞相比較。細(xì)胞增殖速率可以使用本領(lǐng)域已知的測(cè)定法，例如TACS XTT細(xì)胞增殖測(cè)定法 (Trevigen, Inc)進(jìn)行確定。類似地，集落形成能力可以通過(guò)在MATRI(iELTM(BD Biosciences) 中培養(yǎng)進(jìn)行確定，并且細(xì)胞DNA斷裂可以使用經(jīng)分離的基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)凝膠電泳進(jìn)行評(píng) 估。RF/麗暴露系統(tǒng)RF/MW處理裝置(如待審批申請(qǐng)？07^ 2007/059486或舊11/882，453中描述的) 通過(guò)雙極、手提式探針用于允許非常精確的能量轉(zhuǎn)移。細(xì)胞可以在96孔板中維持亞融合， 暴露于具有平均功率IOW的2. 45GHz以多個(gè)時(shí)間，例如約1秒到約12. 5秒。一般的能量遞 送可以是約5到約125焦耳之間。結(jié)果RF/MW對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用在暴露于RF以不同時(shí)間(0至5秒)后，EM. Che-I子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞、自體子宮 內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(在8小時(shí)和76小時(shí)后，圖1和2)顯示增 殖速率的顯著減少。圖3-8中的細(xì)胞顯微照片顯示相同結(jié)果。集落形成能力在圖9A和9B 的顯微照片中進(jìn)行比較，而經(jīng)MW處理的子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞(9B)顯示與未經(jīng)處理的子宮內(nèi) 膜異位細(xì)胞相比較，在25至125焦耳處理后8天集落數(shù)目的明顯減少?；蚪M細(xì)胞DNA降 解可以通過(guò)使用常規(guī)方法分離基因組DNA并且通過(guò)凝膠電泳分離DNA進(jìn)行測(cè)量。一般結(jié)果 在圖10的凝膠中的條帶比較中描述。腹腔鏡處理腹腔鏡處理裝置，例如本領(lǐng)域可用的那些(參見(jiàn)例如，Karl Storz, Thubingen, Germany)可以用于顯現(xiàn)在處理過(guò)程中和在處理后對(duì)細(xì)胞的作用，以監(jiān)視最佳處理方案。該 裝置可以與上文所述RF/MW處理裝置結(jié)合使用。指示子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的熒光探針也可以 加入處理中，從而使得可以顯現(xiàn)特定處理位點(diǎn)。上文呈現(xiàn)的實(shí)施例和申請(qǐng)的內(nèi)容僅限定且描述了由本發(fā)明涵蓋的許多方法、處理 方案、人處理和細(xì)胞測(cè)量過(guò)程中的某些。另外的產(chǎn)物、裝置和方法可以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生且使 用。實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)的部分都不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明總體范圍或下述權(quán)利要求含義的限制。
權(quán)利要求
處理細(xì)胞以阻止細(xì)胞增殖的方法，其包括以下述一種或多種的RF/MW能量處理細(xì)胞具有平均功率10W的約2.45GHz以1秒到15秒的所需時(shí)間段；或約5到約125焦耳之間，并且測(cè)量下述中的一種或多種隨著時(shí)間的過(guò)去細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的減少；關(guān)于集落形成的能力；或基因組DNA降解。
2.用于測(cè)定用于細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制RF/MW處理的方法，其包括對(duì)所述細(xì)胞應(yīng)用來(lái)自 雙極裝置的RF/MW能量，并且測(cè)量下述中的一種或多種隨著時(shí)間的過(guò)去細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖 的減少；關(guān)于集落形成的能力；或基因組DNA降解。
3.處理子宮內(nèi)膜異位的方法，其包括提供RF/MW發(fā)射裝置，并且遞送約5至約125焦 耳，由此用于生長(zhǎng)或集落形成的細(xì)胞能力得以減少。
4.權(quán)利要求3的方法，其中使用最低限度侵入性技術(shù)將所述發(fā)射裝置插入體內(nèi)。
5.用于處理子宮內(nèi)膜異位或細(xì)胞增殖性疾病的MW發(fā)射裝置，其包括用于發(fā)射MW的手 提式雙極尖端，所述手提式雙極尖端包括在腹腔鏡手術(shù)棒(wand)內(nèi)，所述裝置能夠遞送約 25至約125焦耳，或在約IOW下約2. 54GHz以1至15秒。
6.權(quán)利要求5的裝置，其經(jīng)配置用于人中的子宮內(nèi)膜異位的腹腔鏡處理。
7.如權(quán)利要求1中要求的用于處理有此需要的患者中的子宮內(nèi)膜異位的方法，其中遞 送RF/MW能量的裝置經(jīng)配置用于人中的腹腔鏡手術(shù)，并且由此所述處理導(dǎo)致對(duì)與所述子宮 內(nèi)膜異位相關(guān)的增殖性細(xì)胞的細(xì)胞損害。
8.如權(quán)利要求1-4或7中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括用熒光或自體熒光化合物處理 細(xì)胞或組織，由此所述處理面積或細(xì)胞通過(guò)熒光進(jìn)行指示。全文摘要
本發(fā)明涉及射頻/微波處理裝置的用途及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的作用，并且特別是在子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的更具體實(shí)施方式
中。在另一方面，本發(fā)明涉及射頻/微波能量在所需群體中影響細(xì)胞生長(zhǎng)的用途，同時(shí)基本上避免對(duì)鄰近或附近細(xì)胞的有害加熱和破壞作用。使用所述裝置，對(duì)細(xì)胞和組織的特定處理方案和控制能量輸出可以影響人的特定細(xì)胞和疾病，例如，涉及不受控制或有害細(xì)胞生長(zhǎng)的那些。
文檔編號(hào)A61B18/18GK101902980SQ200880122063
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日
發(fā)明者J·布凱德若蘭尼耶, J·戈古塞夫 申請(qǐng)人:新波醫(yī)藥系統(tǒng)股份有限公司