本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)方法，尤其涉及一種胰島素抵抗狀態(tài)下子宮內膜增殖培育方法。
背景技術：
子宮內膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,發(fā)病率呈逐年上升且年輕化的趨勢。大量流行病學研究表明肥胖、糖尿病和胰島素抵抗是子宮內膜癌的危險因素。近年來，隨著生活水平的提高及生活方式的改變、膳食結構的變化，超重和肥胖人群逐年增多。大量脂肪攝入是胰島素抵抗形成的主要因素，胰島素作為生長因子家族的成員調控細胞生長和能量代謝，在腫瘤形成過程中起重要作用，子宮內膜增殖是子宮內膜癌的癌前病變，飲食引起的代謝異常與子宮內膜增殖和子宮內膜癌的關系仍不明確。因此在驗證利用長期高脂飲食誘導的胰島素抵抗對子宮內膜增殖影響時需要建立一種動物模型，并為進一步深入的胰島素抵抗和高胰島素血癥與子宮內膜增殖和子宮內膜癌發(fā)生之間的相互作用機制研究奠定實驗室基礎。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種建立胰島素抵抗和子宮內膜增殖動物模型方法，可以有效和快速的實現(xiàn)子宮內膜增殖。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種胰島素抵抗狀態(tài)下子宮內膜增殖培育方法，所述方法包括：
步驟1，胰島素抵抗動物模型的建立；
1.1，將大鼠適應性喂養(yǎng)1周后分為2組，對照組(n組)、雌激素組(ne組)和胰島素抵抗+雌激素組組(fe組)；
1.2，給予對照組和雌激素組正常維持飼料飲食：碳水化合物66％、脂肪10％、蛋白質24％，胰島素抵抗+雌激素組高脂飲食：碳水化合物20％、脂肪60％、蛋白質20％；
1.3，大鼠喂養(yǎng)40周，禁食10～12h，內眥靜脈取血檢測血脂、空腹血糖及胰島素水平，計算homa-ir指數(shù)，腹腔注射葡萄糖后于30min、60min、90min和120min尾靜脈取血測定血糖值并計算血糖曲線下面積；
1.4，測定糖耐量1周，兩組大鼠禁食5～7h，尾靜脈取血測空腹血糖后，腹腔注射胰島素，測定30min、60min、90min和120min血糖值并計算曲線下面積；
步驟2，將所述大鼠去勢及給予雌激素；
2.1，大鼠取仰臥位，消毒后5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，于尿道口上方1cm處向上行正中縱形切口皮膚3cm，分離皮下組織及肌肉進入腹腔，在子宮角與輸卵管交界靠子宮角側結扎，摘除大鼠雙側卵巢，關閉腹腔。對照組僅切開皮膚暴露腹腔取出與卵巢等量的脂肪組織后關閉腹腔；
2.2，術后1周，灌胃給予雌激素和胰島素抵抗+雌激素組大鼠17β-雌二醇【800μg/kg(體重)】4周，對照組給予等量溶劑橄欖油；
步驟3，陰道脫落細胞巴氏染色；
3.1，給予溶劑或17β-雌二醇3天后，每天行陰道涂片的巴氏染色：95％酒精5min，碳酸鋰溶液5min，95％酒精5min，橘黃染液3min，95％酒精ⅰ、ⅱ各5min，ea-505min，95％酒精ⅰ、ⅱ各5min，無水乙醇ⅰ、ⅱ各5min，二甲苯ⅰ、ⅱ各5min，中性樹膠封片；
步驟4，分離肝臟、內臟脂肪和子宮；
4.1，給予雌激素4周后，暴露腹腔處理，分離腹腔脂肪并稱重，分離子宮并稱量子宮的濕重和干重，取子宮角中段8-10mm和5mm×5mm×5mm肝臟固定于10％中性福爾馬林中用于he染色，觀察肝臟脂肪樣變和子宮上皮鱗狀化生，測量子宮腔上皮細胞和腺上皮細胞高度、固有層和肌層的厚度。剩余組織經(jīng)液氮迅速冷凍后置于-80℃冰箱保存，斷頸處死大鼠；
步驟5，組織學染色；
5.1，固定于10％中性福爾馬林中的肝臟和子宮組織經(jīng)石蠟包埋、切片，烤片2h后，脫蠟入水，蘇木精染色后鹽酸酒精分化至切片呈粉紅色，氨水返藍后，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片；
進一步的，所述方法還包括：步驟6，統(tǒng)計學處理；
6.1，定量資料以均值±標準差表示，兩組比較采用獨立樣本的t檢驗，三組比較采用單因素方差分析。
因此，本發(fā)明的一種胰島素抵抗狀態(tài)下子宮內膜增殖培育方法方法實現(xiàn)了有效和快速的實現(xiàn)子宮內膜增殖培養(yǎng)。
附圖說明
圖1為本發(fā)明一種胰島素抵抗狀態(tài)下子宮內膜增殖培育方法的流程圖。
具體實施方式
下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。
長期高脂飲食誘導的胰島素抵抗是否影響子宮內膜增殖，代謝異常與子宮內膜增殖及其癌變之間的關系目前尚不明確。本發(fā)明通過對正常sprague-dawley大鼠進行長期的高脂飲食，誘導大鼠胰島素抵抗，觀察在胰島素抵抗狀態(tài)下，大鼠子宮內膜增殖的變化，為進一步發(fā)明高胰島素環(huán)境及糖代謝異常對子宮內膜的作用機制提供實驗依據(jù)。
圖1為本發(fā)明子宮內膜增殖培養(yǎng)方法的流程圖，如圖所示，本發(fā)明具體包括如下步驟：
材料的準備。材料是spf級性成熟雌性性成熟sprague-dawley大鼠(8周齡)27只，購自北京維通利華公司。大鼠體重無明顯差異，自由進食水、光照12h/天，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20～25℃、濕度40-50％。高脂飼料(60％脂肪含量)購自北京華阜康公司，葡萄糖、17β-雌二醇購自美國sigma公司，血糖試紙和血糖儀購自美國羅氏公司。
步驟1，胰島素抵抗動物模型的建立；
1.1，適應性喂養(yǎng)1周后，大鼠分為3組，即對照組(n組，n＝9)、雌激素組(ne組，n＝9)和胰島素抵抗+雌激素組(fe組，n＝9)；
1.2，給予對照組和雌激素組正常維持飼料飲食(碳水化合物66％，脂肪10％，蛋白質24％)、給予胰島素抵抗+雌激素組高脂飲食(碳水化合物20％，脂肪60％，蛋白質20％)；
1.3，大鼠喂養(yǎng)40周時，禁食10～12h后，內眥靜脈取血檢測血脂(酶法)、空腹血糖(氧化酶法)及胰島素水平(碘125放射免疫法)，計算homa-ir指數(shù)【空腹血糖(mmol/l)×空腹胰島素(mu/ml)/22.5)】，腹腔注射葡萄糖(2g/kg)后于30min、60min、90min和120min測定血糖值并計算血糖曲線下面積；
1.4，測定糖耐量1周后，各組大鼠禁食7h后，尾靜脈取血測空腹血糖水平后，腹腔注射胰島素(0.75u/kg)，測定30min、60min、90min和120min血糖值并計算曲線下面積；
步驟2，將所述大鼠去勢及給予雌激素；
2.1，大鼠取仰臥位，消毒后5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，于尿道口上方約1cm處向上行正中縱形切口皮膚約3cm，分離皮下組織及肌肉進入腹腔，在子宮角與輸卵管交界靠子宮角側結扎，摘除大鼠雙側卵巢，關閉腹腔。對照組僅切開皮膚暴露腹腔，取出卵巢旁等量脂肪組織后關閉腹腔。
2.2，術后1周，灌胃給予雌激素組和胰島素+雌激素組大鼠17β-雌二醇【800μg/kg(體重)】4周，對照組給予等量溶劑橄欖油。
步驟3，陰道脫落細胞巴氏染色；
3.1，給予溶劑或17β-雌二醇3天后，每天行陰道涂片后行脫落細胞的巴氏染色，95％酒精固定5min，碳酸鋰溶液5min，95％酒精5min，橘黃染液3min，95％酒精ⅰ、ⅱ各5min，ea-505min，95％酒精ⅰ、ⅱ各5min，無水乙醇ⅰ、ⅱ各5min，二甲苯ⅰ、ⅱ各5min，中性樹膠封片。
步驟4，分離肝臟、內臟脂肪和子宮；
4.1，給予溶劑或17β-雌二醇(800μg/kg【體重】)4周后，暴露腹腔操作如前，分離腹腔脂肪并稱重，分離子宮并稱量子宮的濕重和干重。取子宮角中段8～10mm和5mm×5mm×5mm的肝臟固定于10％中性福爾馬林中用于he染色，觀察肝臟脂肪樣變和子宮上皮鱗狀化生，測量子宮腔上皮細胞和腺上皮細胞高度、固有層和肌層的厚度。剩余組織經(jīng)液氮迅速冷凍后置于-80℃冰箱保存。最終，斷頸處死大鼠。
步驟5，組織學(he)染色；
5.1，固定于10％中性福爾馬林中的肝臟和子宮組織經(jīng)石蠟包埋、切片(5μm)，烤片2h后，脫蠟(二甲苯ⅰ、ⅱ，各15min)入水(無水乙醇ⅰ、ⅱ、95％、90％、80％、75％乙醇各1次，各5min)，漂洗(自來水5min)，蘇木精(5min)，自來水漂洗3min，鹽酸酒精分化(濃鹽酸1ml，75％酒精99ml，2s)至切片呈粉紅色，自來水漂洗(3min)后氨水返藍(氨水0.2ml，自來水99.8ml，10s)，自來水漂洗(3min)后，伊紅染色5min，自來水漂洗(3min)后，梯度酒精脫水(90％、95％酒精各1次，無水乙醇ⅰ、ⅱ，各3min)，透明(二甲苯ⅰ、ⅱ，各10min)，中性樹膠封片。
步驟6，統(tǒng)計學處理。
具體的，采用spss16.0軟件，定量資料以均值±標準差
處理結果如下：
結果一，胰島素抵抗大鼠模型的建立。
飼養(yǎng)第2周，胰島素抵抗+雌激素組大鼠體重大于對照組和雌激素組(271.41±21.16gvs251.71±13.94g，p<0.05)，飼養(yǎng)至第40周末，與對照組和雌激素組相比，胰島素抵抗組大鼠體重顯著增加(462.50±86.99gvs379.46±53.19g，p<0.01)。飼養(yǎng)至第胰島素抵抗組糖負荷在60min、90min和120min血糖比對照組和雌激素組明顯升高(p<0.01)，且血糖恢復至正常水平時間延遲，葡萄糖曲線下面積比對照組和雌激素組也明顯增大(p<0.01)，見表1。胰島素抵抗組腹腔注射胰島素后90min和120min血糖比對照組和雌激素組明顯升高(p<0.05)，血糖恢復至正常水平時間延遲，葡萄糖曲線下面積比對照組和雌激素組也明顯增多(p<0.05)，見表2。飼養(yǎng)至第40周末，胰島素抵抗組大鼠胰島素抵抗指數(shù)10.01±3.04較對照組和雌激素組的7.16±2.97顯著升高(p<0.05)。胰島素抵抗組大鼠甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白與對照組和雌激素組無顯著差異。胰島素抵抗組內臟脂肪含量大于對照組和雌激素組(p<0.001)，見表3。
表1高脂飲食對大鼠葡萄糖耐量的影響
**p<0.01vsn+ne。n，對照組；ne，雌激素組；fe，胰島素抵抗+雌激素組。
表2高脂飲食對大鼠胰島素耐量的影響
*p<0.05vsn+ne。n，對照組；ne，雌激素組；fe，胰島素抵抗+雌激素組。
表3大鼠內臟脂肪、子宮重量和子宮各指標的變化
*p<0.01vsn組、ne組；#p<0.05vsn組；**p<0.05vsne組。n，對照組；ne，雌激素組；fe，胰島素抵抗+雌激素組。
結果二，子宮內膜增殖情況。
去勢后的大鼠給予雌激素灌胃3天后，陰道脫落細胞經(jīng)巴氏染色后，鏡下可見滿視野的細胞質粉染的完全角化的上皮細胞，說明給予雌激素有效。給予雌激素4周后，雌激素組和胰島素抵抗+雌激素組大鼠子宮角與對照組相比明顯增粗，內含或清亮無色液體，子宮的重量顯著增加(p<0.05)。見表3。he染色可見雌激素組和胰島素抵抗+雌激素組大鼠宮腔擴張，黏膜層向腔內凸出，腔上皮和腺上皮細胞高柱狀，可呈假復層或復層排列，細胞內可有空泡出現(xiàn)，腺腔內可有大量分泌物，細胞漿核比增高。和對照組相比，雌激素組和胰島素抵抗+雌激素組大鼠子宮腔上皮細胞和腺上皮細胞高度均變大(p<0.01)。雌激素組和胰島素抵抗+雌激素組大鼠的子宮內膜腔上皮和腺上皮出現(xiàn)了鱗狀細胞化生。此外，雌激素組和胰島素抵抗+雌激素組大鼠子宮內膜間質內嗜酸性粒細胞增多。對照組、雌激素組和胰島素抵抗+雌激素組大鼠子宮固有層、環(huán)形肌層和縱形肌層厚度無顯著性差異。胰島素抵抗+雌激素組腔上皮細胞和腺上皮細胞厚度顯著大于雌激素組(p<0.05)，見表3。此外，雌激素組和胰島素抵抗+雌激素組大鼠的子宮內膜出現(xiàn)鱗狀細胞化生的比例為66.7％(7/9)，大于雌激素組33.3％(3/9)的鱗狀上皮化生比例。對照組大鼠子宮內膜腔上皮和腺上皮細胞呈矮柱狀，未見鱗狀上皮化生。
長期高熱量和低纖維飲食可使與代謝紊亂有關的慢性疾病發(fā)病率增加。機體胰島素抵抗的存在使胰島分泌更多的胰島素代償，從而發(fā)生高胰島素血癥。高脂飲食的胰島素抵抗大鼠與人類肥胖時出現(xiàn)胰島素抵抗病因學類似。發(fā)明表明，肥胖和運動減少等因素導致的ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗和高胰島素血癥等可增加子宮內膜癌的風險。本發(fā)明通過單純高脂飲食誘導大鼠胰島素抵抗，觀察長期胰島素抵抗狀態(tài)下，大鼠發(fā)生子宮內膜增值時子宮內膜形態(tài)學等方面的改變，以證實胰島素抵抗可加速子宮內膜增殖的病變。
與正常飲食相比，高脂飲食脂肪含量高、熱量大，使骨骼肌葡萄糖攝取減少、胰島素抑制肝糖原輸出的能力減弱，影響葡萄糖刺激胰島細胞的胰島素分泌。本發(fā)明中大鼠經(jīng)過長期的高脂喂養(yǎng)后，大鼠體內出現(xiàn)了顯著的胰島素抵抗。大鼠的體重增加，內臟脂肪含量也明顯增加。大鼠出現(xiàn)的糖耐量異常，一方面表現(xiàn)口服糖耐量發(fā)明和腹腔注射胰島素發(fā)明后，胰島素抵抗大鼠的血糖曲線下面積增加，另一方面表現(xiàn)在homa-ir指數(shù)的增大。胰島素抵抗常伴有脂代謝異常，胰島素狀態(tài)下肝脂酶的活性增加使tg合成增加也反應了大鼠胰島素抵抗的狀態(tài)。子宮的結構和功能受到雌激素和孕激素的雙重調控，子宮內膜增殖癥則是由于雌激素水平增高而無孕激素拮抗引起的子宮內膜腺體或間質增生，是子宮內膜癌的癌前病變，如無對抗的雌激素繼續(xù)持續(xù)作用，子宮內膜上皮和腺體可發(fā)生惡性轉化導致子宮內膜癌發(fā)生。本發(fā)明中給予雌激素使大鼠持續(xù)處于動情期，即雌激素分泌水平高、孕激素分泌水平低的狀態(tài)，刺激子宮內膜出現(xiàn)增殖，子宮增重以增加子宮內膜腺細胞分泌活動為主,對子宮固有層和肌層的影響不大。
胰島素抵抗以及繼發(fā)的高胰島素血癥作為肥胖、糖尿病和pcos等的共同病理生理學基礎，與代謝紊亂有關，也與多種腫瘤的發(fā)生有關。胰島素作為生長因子家族成員之一，與胰島素受體結合后誘發(fā)細胞下游信號，激活pi3k/akt、ras/mapk等通路使信息傳遞到細胞核，激活轉錄因子，啟動相關基因轉錄翻譯，以適應細胞增殖和細胞周期等反應。本發(fā)明中大鼠行去勢手術以排除自身不同水平雌激素的影響，通過外源性給予17β-雌二醇，除了子宮內膜增殖的改變外，同時出現(xiàn)了鱗狀上皮細胞化生，有胰島素抵抗的大鼠出現(xiàn)鱗狀上皮化生的比例高于未發(fā)生胰島素抵抗的大鼠。絕經(jīng)后婦女體內雌激素水平明顯降低，但在肥胖等因素作用下，脂肪中的芳香化酶使雄激素轉化為雌激素的量明顯增高，絕經(jīng)后的部分子宮內膜仍處于較活躍的增殖狀態(tài)，即使無外源性雌激素作用，仍可能引起子宮內膜的增生甚至癌變。本發(fā)明中在胰島素抵抗狀態(tài)下大鼠在發(fā)生子宮內膜增殖時，子宮腔上皮和腺上皮細胞的高度顯著大于無胰島素抵抗的大鼠，且子宮內膜鱗狀上皮化生的比例升高，說明胰島素抵抗或者血循環(huán)中高胰島素的水平可使子宮內膜在已有增殖的基礎上進一步加重病變程度。
綜上所述，本發(fā)明通過長期高脂飲食誘導大鼠胰島素抵抗的情況下觀察大鼠在發(fā)生子宮內膜增殖時子宮內膜的形態(tài)學改變，提示在胰島素抵抗存在時，子宮內膜增殖的表現(xiàn)更顯著，主要表現(xiàn)在子宮腔上皮和腺上皮細胞的高度增大以及子宮內膜的鱗狀上皮化生的比例升高，為高胰島素環(huán)境對子宮內膜增殖病變提供實驗依據(jù)。此外，通過合理的飲食和運動改善改善胰島素抵抗的狀態(tài)，積極預防子宮內膜癌前病變的發(fā)生。
最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍。