個性化的高純度肝細(xì)胞癌干細(xì)胞、所述干細(xì)胞的方法和用圖
【專利說明】個性化的高純度肝細(xì)胞癌干細(xì)胞、所述干細(xì)胞的方法和用 途
[0001] 相關(guān)申請的奪叉參考 本申請根據(jù)35U.S.C. § 119(e)要求2013年3月7日提交的美國臨時專利申請 61/774,517的權(quán)益。本申請也是2013年8月6日提交的國際申請PCT/US2013/053850的 部分繼續(xù)申請，所述國際申請根據(jù)35U.S.C. § 119(e)要求2012年8月15日提交的美國 臨時專利申請61/683, 477和2012年10月25日提交的美國臨時專利申請61/718, 643的 權(quán)益。所述申請的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及肝細(xì)胞癌干細(xì)胞、源自所述干細(xì)胞的免疫原性組合物以及制造和使用 所述干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 在實體腫瘤中，較小百分比的細(xì)胞具有作為親本腫瘤引發(fā)具有相同組織學(xué)異質(zhì)性 的腫瘤的能力。這些細(xì)胞被稱為癌癥干細(xì)胞，并且也被稱為腫瘤起始細(xì)胞或癌癥起始細(xì)胞。 癌癥干細(xì)胞可以由一組特性來定義。首先，其具有使自身再生的能力。第二，其在移植時能 夠建立新腫瘤。第三，其可以被表征為休眠或緩慢循環(huán)(細(xì)胞周期)的腫瘤細(xì)胞。第四，其可 能是造成腫瘤對化學(xué)療法或放射療法的抵抗性的原因。第五，其取決于維持其再生并且產(chǎn) 生更分化祖細(xì)胞的能力的特定微環(huán)境，其中所述環(huán)境維持癌癥干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。這種 微環(huán)境可以包括間充質(zhì)細(xì)胞干細(xì)胞、組織相關(guān)聯(lián)的成纖維細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞。在體外培養(yǎng) 的情況下形成球狀體的能力是可以有助于將特定細(xì)胞識別為癌癥干細(xì)胞的又一個特征。癌 癥干細(xì)胞的一個非限制性定義是能夠再生親本腫瘤的完整異質(zhì)性并且即使在多次傳代之 后也連續(xù)地生長的細(xì)胞。
[0004] 特定癌癥干細(xì)胞群體可能是贅瘤來源，并且可能是已經(jīng)治療的癌癥復(fù)發(fā)的來源。 另外，癌癥干細(xì)胞在組織中的亞群當(dāng)暴露于某些信號中時可能重新啟動生長周期并且產(chǎn)生 可以重建腫瘤的細(xì)胞。癌癥干細(xì)胞的小環(huán)境是休眠的，直到正確的信號傳導(dǎo)觸發(fā)再進(jìn)入增 殖周期。再進(jìn)入信號可以來源于局部事件，如外傷、細(xì)胞損傷、微生物攻擊(病毒、細(xì)菌或真 菌)，或由局部生長因子、細(xì)胞因子或細(xì)胞間通信來介導(dǎo)。另外，激素可以調(diào)節(jié)組織特異性小 環(huán)境中的干細(xì)胞。干細(xì)胞小環(huán)境的缺陷或突變可能導(dǎo)致上文功能的擾動。贅瘤可能由這類 擾動產(chǎn)生，并且這些擾動包括影響對細(xì)胞周期的控制的隨機(jī)突變。導(dǎo)致癌癥的突變在個體 之間變化。在患有一種類型的癌癥的那些人之間（如一個乳腺癌患者對比另一個乳腺癌患 者）以及在不同類型的癌癥之間（如肝癌對比黑色素瘤）觀察到這類變化性。
[0005] 針對癌癥發(fā)展出的療法包括涉及自體免疫反應(yīng)的方法。這些方法包括使用新鮮采 集的自體腫瘤細(xì)胞，所述自體腫瘤細(xì)胞解聚并調(diào)配成疫苗載體。另一種方法是樹突狀細(xì)胞 疫苗，其中樹突狀細(xì)胞用自體腫瘤裂解物脈沖。又一種方法是用半乳糖聚合物對患者的腫 瘤細(xì)胞進(jìn)行體外修飾，并且將經(jīng)修飾的腫瘤細(xì)胞注射回到所述患者中，其中半乳糖標(biāo)記的 腫瘤細(xì)胞更容易由抗原呈遞細(xì)胞（APC)吸收，由此增加抗腫瘤反應(yīng)。這些涉及自體免疫療法 的方法中的缺點(diǎn)是當(dāng)使用塊狀腫瘤或塊狀腫瘤抗原作為免疫刺激劑時的低的抗原信噪比。 大部分腫瘤細(xì)胞是相當(dāng)分化的并且與正常細(xì)胞如血管成分、結(jié)締組織、分化的腫瘤細(xì)胞、非 活細(xì)胞和壞死細(xì)胞以及正常宿主組織混合。癌癥干細(xì)胞僅代表腫瘤塊的較小部分，在更具 攻擊性的腫瘤中有時最多4%，最常見小于1%。因此，當(dāng)使用塊狀腫瘤作為抗原來源時，免疫 反應(yīng)是針對更分化的細(xì)胞，從而允許干細(xì)胞逃避攻擊并且可能造成腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。
[0006] 另一種新療法是針對在癌癥中更豐富地表達(dá)的正?？乖膯我话邢蚩贵w。特異性 抗原靶向療法(如抗⑶133、抗EpCAM、抗⑶44、抗⑶13等）是無辨別力的，并且影響正常細(xì) 胞以及癌細(xì)胞，從而引起對患者的巨大不良作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本文公開肝細(xì)胞癌（HCC)癌癥干細(xì)胞（CSC)、HCC_CSC細(xì)胞系以及用于治療肝細(xì)胞 癌的包含HCC-CSC負(fù)載型樹突狀細(xì)胞的免疫原性組合物。
[0008] 特別地，本文提供一種用于制備肝細(xì)胞癌（HCC)癌癥干細(xì)胞（CSC)的群體的方法， 所述方法包含：獲取HCC樣本；使所述樣本的細(xì)胞解離，以及在非粘附性底物上在成分確定 的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)所述解離的細(xì)胞，其中所述成分確定的培養(yǎng)基是無血清的并且補(bǔ)充有 至少一種經(jīng)由促分裂原活化蛋白激酶（MAPK)路徑起作用的生長因子，由此形成HCC-CSC球 狀體；其中所述HCC-CSC球狀體群體中至少約80%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記中的兩個或更 多個：α胎蛋白（AFP)、EpCAM、0vl以及0V6。在另一個實施方案中，所述HCC-CSC球狀體群 體中至少約80%的細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)以下生物標(biāo)記中的一個或多個：CK7、CK19以及E-鈣粘 素。在另一個實施方案中，所述HCC-CSC球狀體群體中至少約90%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo) 記中的兩個或更多個：AFP、EpCAM、Ovl以及0V6。
[0009] 在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包含在粘附性底物上在成分確定的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)所述HCC-CSC球狀體，其中所述成分確定的培養(yǎng)基是無血清的并且補(bǔ)充有至少 一種經(jīng)由所述MAPK路徑起作用的生長因子，由此形成早期HCC-CSC的群體，其中所述早 期HCC-CSC群體中至少約80%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記中的兩個或更多個：Nanog、Sox2、 0ct3/4以及c-kit。在另一個實施方案中，所述早期HCC-CSC群體中至少約80%的細(xì)胞進(jìn)一 步表達(dá)以下生物標(biāo)記中的一個或多個：EpCAM、E-鈣粘素、Sox 7、Sox 17、Fox2A、0vl、0V6、 ⑶133以及⑶90。在另一個實施方案中，所述早期HCC-CSC群體中至少約90%的細(xì)胞表達(dá) 以下生物標(biāo)記中的兩個或更多個：Nanog、Sox2、0ct3/4以及c-kit。
[0010] 在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包含在粘附性底物上在成分確定的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)所述HCC-CSC球狀體，其中所述成分確定的培養(yǎng)基含有血清并且補(bǔ)充有至少一種經(jīng) 由所述MAPK路徑起作用的生長因子，由此形成混合HCC-CSC的群體，其中所述混合HCC-CSC 群體中至少約80%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記中的兩個或更多個：AFP、CK7、CK19、EpCAM、 E-鈣粘素、Nanog、FoxA2HNF4a以及ABCG2。在另一個實施方案中，所述混合HCC-CSC群體 中至少約90%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記中的兩個或更多個：六??、〇(7、〇(193?041^-鈣粘 素、Nanog、FoxA2HNF4a以及ABCG2。
[0011] 在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包含在粘附性底物上在成分確定的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)所述HCC-CSC球狀體，其中所述成分確定的培養(yǎng)基含有血清來源并且補(bǔ)充 有至少一種經(jīng)由所述MAPK路徑起作用的生長因子，由此形成胚胎向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的 (EMT)-HCC-CSC的群體，其中所述EMT-HCC-CSC群體中至少約80%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記 中的兩個或更多個：NCAM、Slug/Snail以及Twist。在另一個實施方案中，所述EMT-HCC-CSC 群體中至少約80%的細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)以下生物標(biāo)記中的一個或多個：AFP、N-鈣粘素、⑶44 以及波形蛋白。在又一個實施方案中，所述EMT-HCC-CSC群體中至少約90%的細(xì)胞表達(dá)以 下生物標(biāo)記中的一個或多個：NCAM、Slug/Snail以及Twist。
[0012] 在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包含在粘附性底物上在成分確定的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)所述HCC-CSC球狀體、所述混合HCC-CSC或EMT-HCC-CSC，其中所述成分確定的培養(yǎng) 基是無血清的并且補(bǔ)充有至少一種經(jīng)由所述MAPK路徑起作用的生長因子，由此形成早期 HCC-CSC的群體，其中所述早期HCC-CSC群體中至少約80%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記中的兩 個或更多個：似11(^、3(?2、0(^3/4以及(3-1^^。在另一個實施方案中，所述早期!1〇：-03(：群 體中至少約80%的細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)以下生物標(biāo)記中的一個或多個：CK7、CK19以及E-鈣粘 素。在又一個實施方案中，所述早期HCC-CSC群體中至少約90%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記 中的一個或多個：Nanog、Sox2、0ct3/4 以及c-kit〇
[0013] 在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包含在粘附性底物上在成分確定的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)所述HCC-CSC球狀體、所述早期HCC-CSC或EMT-HCC-CSC，其中所述成分確定的培養(yǎng) 基含有血清來源并且補(bǔ)充有至少一種經(jīng)由所述MAPK路徑起作用的生長因子，由此形成混 合HCC-CSC的群體，其中所述混合HCC-CSC群體中至少約80%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記中 的兩個或更多個：4??、〇(7、〇(193口041^-鈣粘素、似11(^、？(《42!1即43以及48062。在另 一個實施方案中，所述混合HCC-CSC群體中至少約90%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記中的兩個 或更多個：AFP、CK7、CK19、EpCAM、E-鈣粘素、Nanog、FoxA2 HNF4a以及ABCG2。
[0014] 在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包含在粘附性底物上在成分確定的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)所述HCC-CSC球狀體、所述早期HCC-CSC或混合HCC-CSC，其中所述成分確定的培 養(yǎng)基含有血清來源并且補(bǔ)充有至少一種經(jīng)由所述MAPK路徑起作用的生長因子，由此形成 EMT-HCC-CSC的群體，其中所述EMT-HCC-CSC群體中至少約80%的細(xì)胞表達(dá)以下生物標(biāo)記中 的兩個或更多個：NCAM、Slug/Snail以及Twist。在另一個實施方案中，所述EMT-HCC-CSC 群體中至少約80%的細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)以下生物標(biāo)記中的一個或多個：AFP、N-鈣粘素、⑶44 以及波形蛋白。在又一個實施方案中，所述EMT-HCC-CSC群體中至少約90%的細(xì)胞表達(dá)以 下生物標(biāo)記中的一個或多個：NCAM、Slug/Snail以及Twist。
[0015] 在一個實施方案中，所述成分確定的培養(yǎng)基是表2中所描述的任何培養(yǎng)基；來自 于表2和表3的組合的任何培養(yǎng)基；來自于表2、表3和表4的組合的任何培養(yǎng)基；或來自 于表2和表4的組合的任何培養(yǎng)基。
[0016] 在一個實施方案中，所述生長因子是成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)、表皮生長因子 (EGF)或活化素A中的一個或多個。在另一個實施方案中，所述FGF是堿性FGF(bFGF)。在 又一個實施方案中，所述成分確定的培養(yǎng)基并未補(bǔ)充有活化素A。在另一個實施方案中，所 述成分確定的培養(yǎng)基以有效防止HCC干細(xì)胞自發(fā)分化的量補(bǔ)充有活化素A的激動劑。在又 一個實施方案中，所述活化素A拮抗劑是卵泡抑素或與活化素A特異性結(jié)合的抗體。
[0017] 在另一個實施方案中，所述培養(yǎng)基并未補(bǔ)充有抗氧化劑。在另一個實施方案中，所 述抗氧化劑是超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽、腐胺或β-巰基乙醇。在又一個實 施方案中，所述成分確定的培養(yǎng)基補(bǔ)充有谷胱甘肽。
[0018] 在另一個實施方案中，所述粘附性底物經(jīng)配置以與錨著依賴性細(xì)胞(如成纖維細(xì) 胞）粘附，并且收集所述細(xì)胞。在另一個實施方案中，所述非粘附性底物是超低粘附性聚苯 乙烯表面。在又一個實施方案中，所述粘附性底物包含涂布有富含RGD三肽基序的蛋白質(zhì) 的表面。
[0019] 本文還提供一種經(jīng)純化的HCC-CSC細(xì)胞的群體，其通過本文所公開的方法中的 任一種來制備。在某一實施方案中，所述經(jīng)純化的HCC-CSC細(xì)胞是HCC-CSC球狀體、早期 HCC-CSC、混合HCC-CSC或EMT-HCC-CSC。
[0020] 本文還提供一種HCC-CSC細(xì)胞系，其通過本文所公開的方法中的任一種方法來制 備。在某一實施方案中，所述經(jīng)純化的HCC-CSC細(xì)胞是HCC-CSC球狀體、早期HCC-CSC、混合 HCC-CSC或EMT-HCC-CSC。
[0021] 在一個實施方案中，本文提供一種免疫原性組合物，其包含由源自本文所公開的 經(jīng)純化HCC-CSC細(xì)胞群體或HCC-CSC細(xì)胞系的腫瘤抗原離體活化的樹突狀細(xì)胞。在另一個 實施方案中，所述腫瘤抗原包含所述經(jīng)純化HCC-CSC細(xì)胞或所述HCC-CSC細(xì)胞系的細(xì)胞提 取物。在另一個實施方案中，所述腫瘤抗原包含所述經(jīng)純化HCC-CSC細(xì)胞或所述HCC-CSC 細(xì)胞系的裂解物。在另一個實施方案中，所述腫瘤抗原包含完整的經(jīng)純化HCC-CSC細(xì)胞或 來自所述HCC-CSC細(xì)胞系的完整細(xì)胞。
[0022] 在另一個實施方案中，所述完整HCC-CSC細(xì)胞被賦予非增殖性。在另一個實施方 案中，所述完整細(xì)胞通過輻射而被賦予非增殖性。在又一個實施方案中，所述完整細(xì)胞通過 將所述細(xì)胞暴露于核交聯(lián)劑中而被賦予非增殖性。
[0023] 在另一個實施方案中，所述免疫原性組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體和/ 或賦形劑。在另一個實施方案中，所述免疫原性組合物進(jìn)一步包含佐劑。在另一個實施方 案中，所述佐劑是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
[0024] 在又一個實施方案中，所述免疫原性組合物包含樹突狀細(xì)胞和HCC-CSC細(xì)胞。在 另一個實施方案中，所述經(jīng)純化的HCC-CSC細(xì)胞或所述HCC-CSC細(xì)胞系呈HCC-CSC球狀體、 早期HCC-CSC、混合HCC-CSC或EMT-HCC-CSC形式。
[0025] 還提供一種在有需要的受試者中治療肝細(xì)胞癌的方法，其包含向所述受試者給予 本文所公開的免疫原性組合物。在一個實施方案中，所述免疫原性組合物以多個劑量形式 給予，每一個劑量包含約5-20X106個細(xì)胞。在另一個實施方案中，所述劑量包含約10X 1〇6個細(xì)胞。在另一個實施方案中，所述劑量每周給予一次，持續(xù)2-5個劑量，接著每月給予 一次，持續(xù)3-6個劑量。在又一個實施方案中，所述受試者接受6-10個劑量的免疫原性組 合物。
[0026] 還提供一種在有需要的受試者中刺激針對肝細(xì)胞癌的免疫反應(yīng)的方法，其包含向 所述受試者給予本文所公開的免疫原性組合物、本文所公開的HCC-CSC或本文所公開的 HCC-CSC細(xì)胞系。
[0027] 還提供本文所公開的免疫原性組合物、本文所公開的HCC-CSC或本文所公開的 HCC-CSC細(xì)胞系在制備用于治療肝細(xì)胞癌的藥物中的用途。
[0028] 還提供本文所公開的免疫原性組合物、本文所公開的HCC-CSC或本文所公開的 HCC-CSC細(xì)胞系用于治療肝細(xì)胞癌的用途。
【附圖說明】
[0029] 圖1是從切除的腫瘤中（實線方框和箭頭）或從如針活檢的小樣本(虛線方框和箭 頭）中將肝細(xì)胞癌（HCC)干細(xì)胞（HCC-CSC)分離、擴(kuò)增以及采集成球狀體的過程的流程圖。 在生成球狀體之后，產(chǎn)生HCC-CSC亞群的路徑是常見路徑。
[0030] 圖2是球狀體的示意圖。
[0031] 圖3A和3B描繪各種形狀和大小的球狀體。
[0032] 圖4描繪處于擴(kuò)增期的HCC干細(xì)胞。
[0033]圖5描繪附接到超低粘附性底物上的細(xì)胞。
[0034] 圖6描繪對活化素A不敏感的HCC干細(xì)胞。這些細(xì)胞以緊密集落生長，并且由正 常宿主組織(成纖維細(xì)胞）環(huán)繞。更分化的腫瘤細(xì)胞通過活化素A的存在來消除。
[0035] 圖7描繪通過暴露于活化素A中而選擇的以對干細(xì)胞具有特異性的緊密集落生長 的HCC干細(xì)胞。
[0036]圖8描繪用含有小的自身再生細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞樣集落的富集HCC培養(yǎng)物。
[0037]圖9描繪在接種在粘附性底物上之后七天時，由來自HCC腫瘤的針活檢的酶促解 離而產(chǎn)生的細(xì)胞(相襯10X)。
[0038] 圖10描繪在圖9的細(xì)胞生長14-21天之后的典型密集集落形成_襯10X)。
[0039] 圖11描繪在多次傳代之后建立的高增殖性HCC干細(xì)胞系_襯10X)。
[0040] 圖12A描繪用核復(fù)染(雙苯甲亞胺)對α胎蛋白（AFP)呈染色陽性的HCC細(xì)胞系， 證實HCC身份(落射熒光，20Χ)。圖12Β描繪在用于AFP染色的紅色通道圖像中的圖12Α 細(xì)胞。圖12C描繪用于雙苯甲亞胺的藍(lán)色通道圖像。
[0041] 圖13Α描繪具有高百分比神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（NCAM)染色的細(xì)胞，證實在確立的培 養(yǎng)物中的早期癌癥祖細(xì)胞表型選擇(包括核復(fù)染，雙苯甲亞胺)(落射熒光，40Χ)。圖13Β描 繪在用于NCAM染色的紅色通道圖像中的圖13Α細(xì)胞。圖13C描繪用于雙苯甲亞胺的藍(lán)色 通道圖像。
[0042] 圖14Α描繪針對⑶44標(biāo)記為陽性的HCC細(xì)胞系，所述⑶44是對具有高轉(zhuǎn)移潛力 的癌癥干細(xì)胞具有特異性的侵襲力標(biāo)記。細(xì)胞也用核復(fù)染，雙苯甲亞胺染色(落射熒光， 40Χ)。圖14Β描繪在用于⑶44染色的綠色通道圖像中的圖14Α細(xì)胞。圖13C描繪用于雙 苯甲亞胺的藍(lán)色通道圖像。
[0043] 圖15Α描繪使用雙苯甲亞胺核復(fù)染的EMT-HCC-CSC細(xì)胞系中上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì) 胞轉(zhuǎn)變標(biāo)記波形蛋白和Slug/Snail。圖15Β描繪在用于Slug/Snail染色的紅色通道圖像 中的圖15A細(xì)胞。圖15C描繪在用于波形蛋白的綠色通道圖像中的圖15A細(xì)胞。圖15D描 繪用于雙苯甲亞胺的藍(lán)色通道圖像。
【具體實施方式】
[0044] 本發(fā)明提供一種從人