一種嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，尤其涉及一種嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一。在我國，腫瘤極大地威脅著人民的生命健康，極大地降低了腫瘤患者的生活質(zhì)量，同時腫瘤也給家庭和社會造成了巨大的負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的腫瘤治療方法，徹底攻克腫瘤是世界醫(yī)學(xué)界的重要研究課題。
[0003]腫瘤免疫療法是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域最具前景研究方向之一，是近年來一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療新型方法。初步的臨床試驗結(jié)果表明其治療效率非常高，各大藥企紛紛尋求與其他公司合作研發(fā)腫瘤免疫相關(guān)治療方法。而傳統(tǒng)的三大主要治療手段即手術(shù)治療、化療、放療雖然是全球腫瘤治療的基本手段方法，然而其治療效果有限。手術(shù)治療雖然可以切除較大體積的腫瘤，然而對于體積較小以及腫瘤轉(zhuǎn)移之后的小型病灶無法達(dá)到切除的目的?；熓抢没瘜W(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞的生長繁殖的一種治療方式，然而，對大多數(shù)腫瘤的治療的有效性較低，特別對中晚期腫瘤患者，治療效果有限，并且化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也將正常細(xì)胞和免疫細(xì)胞一同殺滅，導(dǎo)致病患者免疫能力和身體機(jī)能下降，生活質(zhì)量降低。放療是用放射線照射癌組織，以抑制和殺滅癌細(xì)胞的一種治療方法，然而，放療對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞沒有分辨能力，多次放療后，患者會產(chǎn)生一系列毒副作用和反應(yīng)，對治療腫瘤效果非常有限。因此，隨著腫瘤免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，免疫細(xì)胞治療在腫瘤治療中的作用日益受到重視。腫瘤生物治療是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù)，具有極其光明的應(yīng)用前景。
[0004]目前，免疫腫瘤療法最熱門、最有效果的療法是基于嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric antigen receptor T cells, CART)療法。CART免疫療法的基本原理是首先分離患者的T細(xì)胞，然后利用基因工程改造這種T細(xì)胞，即通過逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體給T細(xì)胞加入一個能識別腫瘤細(xì)胞，并且同時激活T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的嵌合抗體。然后將這些T細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，使免疫細(xì)胞具有特異性識別和殺傷腫瘤的能力。
[0005]嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)主要由三部分組成，位于細(xì)胞外的抗原結(jié)合區(qū)scFv，跨膜區(qū)以及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成。其中，根據(jù)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的研究發(fā)展，CAR從第一代發(fā)展到目前第三代。第一代CART僅含有一個信號單元，大多來自于⑶3ζ。第二代CART是在第一代CART的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)之上增加了一個共刺激結(jié)構(gòu)域，比如CD28、0X40或者4-1ΒΒ。第三代CART是在第二代CART的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)之上再增加一個共刺激結(jié)構(gòu)域，因此具有兩個共刺激結(jié)構(gòu)域，能夠進(jìn)一步提高CART的擴(kuò)增倍數(shù)以及在體內(nèi)存活的時間，提升腫瘤治療效果。
[0006]盡管目前嵌合抗原受體結(jié)合T細(xì)胞在治療一些腫瘤方面取得了非常重大的突破，然而，也存在一些致命缺陷。比如“免疫風(fēng)暴”反應(yīng)，這主要是由于T細(xì)胞被過度激活，從而引起全身性的激烈的免疫反應(yīng)，會造成輸入CART的患者死亡。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒或者慢病毒也不容易感染T細(xì)胞，這會造成表達(dá)目的嵌合抗原受體的T細(xì)胞數(shù)量較少，達(dá)不到治療腫瘤的良好效果。并且，T細(xì)胞具有個體特異性，每個患者只能夠擴(kuò)增自己的T細(xì)胞，而不能夠異體移植T細(xì)胞，因為會產(chǎn)生免疫排斥，然而腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者免疫系統(tǒng)已經(jīng)遭到巨大的破壞，分離的T細(xì)胞活性不高，不容易在短時間內(nèi)大規(guī)模擴(kuò)增，因而最終CART的治療效果大打折扣。
[0007]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞及其制備方法，旨在解決現(xiàn)有嵌合抗原受體T細(xì)胞治療腫瘤容易產(chǎn)生“免疫風(fēng)暴”、病毒感染效率低以及異體移植產(chǎn)生免疫排斥的問題。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞由嵌合抗原受體、脂肪干細(xì)胞和腫瘤殺傷因子組成。
[0010]所述的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述嵌合抗原受體由SCFv抗原結(jié)合序列、跨膜序列及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列組成。
[0011]所述的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述SCFv抗原結(jié)合序列包括輕鏈可變區(qū)序列和重鏈可變區(qū)序列。
[0012]所述的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述scFv抗原結(jié)合序列包括輕鏈可變區(qū)序列、重鏈可變區(qū)序列、連接輕鏈可變區(qū)序列和重鏈可變區(qū)序列的優(yōu)化聯(lián)結(jié)區(qū)序列及位于輕鏈可變區(qū)序列之前的可溶信號肽序列。
[0013]所述的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述scFv抗原結(jié)合序列為CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、GD2、PSMA、Mesothelin 和 NCAM 中的一種。
[0014]所述的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述scFv抗原結(jié)合序列和跨膜序列之間包含一段Hinge序列。
[0015]所述的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述跨膜序列為CD8。
[0016]所述的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列包括CD28胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列、4-1BB胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列和CD3G胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列。
[0017]所述的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述腫瘤殺傷因子為TRAIL基因、TNF-α基因及TNF家族具有腫瘤殺傷作用的基因、具有腫瘤殺傷作用的microRNA分子以及具有腫瘤殺傷作用的蛋白因子中的一種。
[0018]—種如上任一所述的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞的制備方法，其中，包括步驟:
A、首先合成針對脂肪干細(xì)胞的嵌合抗原受體序列，并合成能夠分泌到胞外的腫瘤殺傷因子序列；
B、然后將上述嵌合抗原受體序列和腫瘤殺傷因子序列分別構(gòu)建到慢病毒載體上，得到表達(dá)嵌合抗原受體或者腫瘤殺傷因子的慢病毒；
C、將表達(dá)嵌合抗原受體或者腫瘤殺傷因子的慢病毒感染脂肪干細(xì)胞，慢病毒感染完成之后，得到分泌表達(dá)腫瘤殺傷因子的嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞。
[0019]有益效果:本發(fā)明結(jié)合了嵌合抗原受體特異性地結(jié)合特異腫瘤類型的高靶向性特點(diǎn)，以及脂肪干細(xì)胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短時間內(nèi)大規(guī)模擴(kuò)增以及腫瘤殺傷因子的抗腫瘤作用，能夠解決當(dāng)前CART治療腫瘤的多個包括“免疫風(fēng)暴”、嵌合抗原表達(dá)效率低以及異體移植免疫排斥等難以解決的問題，進(jìn)而提高了治療腫瘤的效果。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明的第三代CAR的組成示意圖。
[0021 ] 圖2為本發(fā)明的CAR-Trunc-FGFRl的組成示意圖。
[0022]圖3為本發(fā)明實施例1中第三代CAR、脂肪干細(xì)胞以及TRAIL共表達(dá)及體外大規(guī)模擴(kuò)增之后輸入人體治療腫瘤的流程示意圖。
[0023 ]圖4為本發(fā)明實施例2中CAR-Trunc-FGFRl、脂肪干細(xì)胞以及TRAIL共表達(dá)及體外大規(guī)模擴(kuò)增之后輸入人體治療腫瘤的流程示意圖。
[0024]圖5為本發(fā)明實施例3中第三代CAR、脂肪干細(xì)胞以及TNF-α共表達(dá)及體外大規(guī)模擴(kuò)增之后輸入人體治療腫瘤的流程示意圖。
[0025]圖6為本發(fā)明實施例4中CAR-Trunc-FGFRl、脂肪干細(xì)胞以及TNF-a共表達(dá)及體外大規(guī)模擴(kuò)增之后輸入人體治療腫瘤的流程示意圖。
[0026]圖7為本發(fā)明實施例5中第三代CAR、脂肪干細(xì)胞以及microRNA-ΙΟ?共表達(dá)及體外大規(guī)模擴(kuò)增之后輸入人體治療腫瘤的流程示意圖。
[0027]圖8為本發(fā)明實施例6中CAR-Trunc-FGFRl、脂肪干細(xì)胞以及microRNA_101共表達(dá)及體外大規(guī)模擴(kuò)增之后輸入人體治療腫瘤的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0028]本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞及其制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0029]本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞，其中，所述嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞由嵌合抗原受體、脂肪干細(xì)胞和腫瘤殺傷因子組成。
[0030]本發(fā)明選擇脂肪干細(xì)胞來作為承載嵌合抗原受體靶向治療腫瘤的載體，其比T細(xì)胞作為嵌合抗原受體的載體治療腫瘤更加具有優(yōu)勢，這是因為脂肪干細(xì)胞來源廣泛、易于分離、取材方便、給患者帶來的痛苦較小、免疫原性極低并且不涉及道德倫理問題等優(yōu)點(diǎn)而日益受到研究者的重視，在臨床上治療疾病有著廣泛的應(yīng)用前景。
[0031]本發(fā)明中采用的脂肪干細(xì)胞在臨床治療疾病方面已經(jīng)有比較成熟、廣泛的應(yīng)用。例如，脂肪干細(xì)胞可以作為種子細(xì)胞;脂肪干細(xì)胞分泌多種因子可支持造血;脂肪干細(xì)胞可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。尤其重要的是，脂肪干細(xì)胞還可以作為基因工程載體。帶有目的基因的病毒直接用于基因治療時，因體內(nèi)的抗病毒效應(yīng)以及病毒的整合性，往往達(dá)不到理想的基因治療效果，用脂肪干細(xì)胞作為基因治療載體后可以大大降低病毒感染對體內(nèi)細(xì)胞組織的直接損傷，而且脂肪干細(xì)胞本身可以分泌一些營養(yǎng)因子，從而更加有助于組織缺陷的康復(fù)。
[0032]本發(fā)明所述嵌合抗原受體脂肪干細(xì)胞還包括腫瘤殺傷因子，所述腫瘤殺傷因子為TRAIL基因(又名TNFSF10)、TNF-a基因及TNF家族具有腫瘤殺傷作用的基因、microRNA-101等具有腫瘤殺傷作用的microRNA分子以及其他具有腫瘤殺傷作用的蛋白因子中的一種，上述腫瘤殺傷因子均能夠在腫瘤部位高效殺傷腫瘤，進(jìn)而達(dá)到治療腫瘤的目的。
[0033]本發(fā)明結(jié)合了嵌合抗原受體特異性地結(jié)合特異腫瘤類型的高靶向性特點(diǎn)，以及脂肪干細(xì)胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短時間內(nèi)大規(guī)模擴(kuò)增以及腫瘤殺傷因子的抗腫瘤作用，能夠解決當(dāng)前CART治療腫瘤的多個包括“免疫風(fēng)暴”、嵌合抗原表達(dá)效率低以及異體移植免疫排斥等難以解決的問題，進(jìn)而提高了治療腫瘤的效果。經(jīng)過本發(fā)明改造的脂肪干細(xì)胞，既具有了非常特異的迀移至特定腫瘤部位的高效靶向性，同時又避免了過度激活免疫系統(tǒng)從而進(jìn)一步產(chǎn)生免疫排斥的風(fēng)險，并且其攜帶的腫瘤殺傷因子又能夠在腫瘤部位高效殺傷腫瘤，進(jìn)而達(dá)到治療腫瘤的目