背景技術(shù)：
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白細(xì)胞介素(interleukin，IL)是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子，它和血細(xì)胞生長(zhǎng)因子同屬細(xì)胞因子。兩者相互協(xié)調(diào)，相互作用，共同完成造血和免疫調(diào)節(jié)功能。白細(xì)胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。

白細(xì)胞介素-12(以下簡(jiǎn)稱IL-12)，由抗原提呈細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生，是一種異源二聚體形式的前炎癥細(xì)胞因子，并以這種形式分泌到細(xì)胞外。IL-12能誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，在體內(nèi)免疫應(yīng)答中(特別是在細(xì)菌或寄生蟲感染中)它也是IFN-γ產(chǎn)生所必需。IL-12是一由p35和p40(IL-12β)兩條鏈組成的異源二聚體，兩個(gè)亞單位通過(guò)二硫鍵連接在一起，這種結(jié)構(gòu)在已發(fā)現(xiàn)的IL中所罕見。通常情況下，p40的量遠(yuǎn)超出p70，在鼠中已觀察到p40同源二聚體的產(chǎn)生，是由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分泌的，p40同源二聚體沒(méi)有生物學(xué)活性，但它能和IL-12Rβ結(jié)合，與p70競(jìng)爭(zhēng)性爭(zhēng)奪IL-12受體(IL-12R)而拮抗其生物學(xué)作用。單獨(dú)的p35不具有生物學(xué)活性，但卻是合成p70的限速因子。

根據(jù)p35，p40兩個(gè)亞基表達(dá)效率不同，前人研究CN200610123433.1曾將p35，p40基因插入不同效率表達(dá)載體來(lái)解決這個(gè)技術(shù)問(wèn)題。然而其操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)化率低，表達(dá)不穩(wěn)定，影響了其在工業(yè)上的應(yīng)用。因此目前亟需獲得一種操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率高，表達(dá)穩(wěn)定的載體來(lái)制備rhIL-12。

有鑒于此，提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明是利用同源性不低于95％的人白細(xì)胞介素12的p35亞基和p40亞基的人工設(shè)計(jì)核苷酸編碼序列，利用基因工程的方法，人工合成表達(dá)人源重組白細(xì)胞介素IL-12的重組基因，將該重組基因序列插入載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)得到p35和p40兩條鏈組成的異源二聚體，兩個(gè)亞單位通過(guò)二硫鍵連接在一起，該異源二聚體有生物學(xué)活性；并得到一種高效表達(dá)人IL-12真核細(xì)胞株。

發(fā)明的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供了一種改造過(guò)的重組人白細(xì)胞介素-12基因，其特征在于：經(jīng)過(guò)優(yōu)化的p35亞基的編碼序列如SEQ ID NO.1所示；經(jīng)過(guò)優(yōu)化的p40亞基的編碼序列如SEQ ID NO.2所示。該基因表達(dá)的rhIL-12蛋白不僅生物活性高于野生型，其在pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和CHO細(xì)胞中表達(dá)量也要更大。

本發(fā)明還提供一種重組人白細(xì)胞介素-12的真核表達(dá)載體，其特征在于：將如權(quán)利要求1所述的兩段基因裝載到該表達(dá)載體上。該載體可以為pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖1所示)，也可以為pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖2所示)。將目的基因裝載到表達(dá)載體的方法為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。例如，如要將SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2連接到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒上，用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Not I對(duì)合成的SEQ ID NO.1基因及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用連接酶將二者連接。用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I對(duì)合成的SEQ ID NO.2基因及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用連接酶將二者連接。

優(yōu)選的，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2基因序列分別由各自的帶有SV40增強(qiáng)子元件的CMV啟動(dòng)子控制。一種可行的方式是，在合成目的基因時(shí)，將帶有SV40增強(qiáng)子元件的CMV啟動(dòng)子這一段基因與目的基因合成在一條鏈上。如合成SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-SEQ ID NO.1或SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-SEQ ID NO.2這樣一段基因。

優(yōu)選的，p35亞基的編碼序列與啟動(dòng)子之間有一段可以增加表達(dá)效率的內(nèi)含子片段。此段內(nèi)含子可以是表達(dá)載體攜帶的(如pCI-neo載體中攜帶的intron元件)，也可以是外源的內(nèi)含子，內(nèi)含子通過(guò)酶切，連接布置在p35亞基的編碼序列與啟動(dòng)子之間，引用外源內(nèi)含子的技術(shù)手段采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。

在構(gòu)建好的表達(dá)載體中，p35表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-可以增加表達(dá)效率的內(nèi)含子片段-SEQ ID NO.1，p40表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-SEQ ID NO.2。

優(yōu)選的，可以增加表達(dá)效率的內(nèi)含子片段為玉米adh1基因內(nèi)含子片段adh1intron。

優(yōu)選的，將如上所述的任一種表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入CHO細(xì)胞系制備獲得，或者所述細(xì)胞用權(quán)利要求1所述的核酸序列轉(zhuǎn)染。

本發(fā)明的技術(shù)效果：1.本發(fā)明所提供的改造過(guò)的rhIL-12基因，其表達(dá)的蛋白，生物活性比野生型更高。2.本發(fā)明提供的構(gòu)建rhIL-12表達(dá)載體的方法，操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化率高。3.本發(fā)明提供的表達(dá)rhIL-12真核細(xì)胞株，表達(dá)量也更高。

附圖說(shuō)明：

圖1為pcDNA3.1(+)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

圖2為pCI-neo質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

具體實(shí)施方式：

實(shí)驗(yàn)例1

將SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2基因片段插入pcDNA3.1(+)載體中，p35表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-SEQ ID NO.1，p40表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-SEQ ID NO.2。構(gòu)建成功表達(dá)rhIL-12的CHO細(xì)胞株應(yīng)用Gibco的CHO-S-SFM II進(jìn)行靜止培養(yǎng)，再應(yīng)用Sartorius BiosSTAT plus細(xì)胞培養(yǎng)罐進(jìn)行批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，采用ELISA法檢測(cè)rhIL-12的含量，靜止培養(yǎng)平均濃度為3.6μg/ml，細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)平均濃度為8.9μg/ml。

將發(fā)酵后的培養(yǎng)液純化后，將產(chǎn)物采用PBMC IFNγ誘生法測(cè)定生物活性。具體為，取健康人新鮮外周血，分離淋巴細(xì)胞。用含10％滅活胎牛血清的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力＞95％)，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液及相應(yīng)稀釋濃度的rhIL-12國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和純化的rhIL-12，空白對(duì)照組加RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照加Anti-human CD3(終濃度0.2μg/ml)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每孔50μl，離心處理后，ELISA法測(cè)定IFNγ含量：在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔吸光度A值，Ascent software version2.6軟件曲線定量計(jì)算IFNγ含量。根據(jù)IFNγ含量來(lái)計(jì)算rhIL-12的生物活性。測(cè)得生物活性為9.7×10⁶IU/mg。

實(shí)驗(yàn)例2

篩選適宜的具有表達(dá)增強(qiáng)作用的內(nèi)含子。構(gòu)建如實(shí)驗(yàn)例1所述的表達(dá)載體。根據(jù)表1所示的引物獲得這三段內(nèi)含子，將此三段內(nèi)含子插入到p35表達(dá)單元中，形成SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-內(nèi)含子-SEQ ID NO.1結(jié)構(gòu)。

構(gòu)建成功表達(dá)rhIL-12的CHO細(xì)胞株應(yīng)用Gibco的CHO-S-SFM II進(jìn)行靜止培養(yǎng)，再應(yīng)用Sartorius BiosSTAT plus細(xì)胞培養(yǎng)罐進(jìn)行批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，采用ELISA法分別檢測(cè)不同表達(dá)載體的rhIL-12含量。檢測(cè)結(jié)果如表2所示，可知，插入adh1內(nèi)含子序列后，rhIL-12的表達(dá)量提高最多。

表1內(nèi)含子及克隆內(nèi)含子所需的引物

表2插入不同內(nèi)含子后rhIL-12的表達(dá)量

對(duì)比例1

將p40cDNA和p35cDNA片段分別插入兩個(gè)效率不同的表達(dá)載體中，p40cDNA插入pcDNA3.1(+)載體；p35cDNA插入pCI-neo載體，并位于其intron元件的下游。然后共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。構(gòu)建成功表達(dá)rhIL-12的CHO細(xì)胞株應(yīng)用Gibco的CHO-S-SFM II進(jìn)行靜止培養(yǎng)，再應(yīng)用Sartorius BiosSTAT plus細(xì)胞培養(yǎng)罐進(jìn)行批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，采用ELISA法檢測(cè)rhIL-12的含量，靜止培養(yǎng)平均濃度為4.2μg/ml，細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)平均濃度為10.4μg/ml。

將發(fā)酵后的培養(yǎng)液純化后，將產(chǎn)物采用PBMC IFNγ誘生法測(cè)定生物活性。具體為，取健康人新鮮外周血，分離淋巴細(xì)胞。用含10％滅活胎牛血清的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力＞95％)，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液及相應(yīng)稀釋濃度的rhIL-12國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和純化的rhIL-12，空白對(duì)照組加RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照加Anti-human CD3(終濃度0.2μg/ml)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每孔50μl，離心處理后，ELISA法測(cè)定IFNγ含量：在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔吸光度A值，Ascent software version2.6軟件曲線定量計(jì)算IFNγ含量。根據(jù)IFNγ含量來(lái)計(jì)算rhIL-12的生物活性。測(cè)得生物活性為8.3×10⁶IU/mg。

對(duì)比例2

將SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2基因片段插入兩個(gè)效率不同的表達(dá)載體中，SEQ ID NO.2片段插入pcDNA3.1(+)載體；SEQ ID NO.1片段插入pCI-neo載體，并位于其intron元件的下游。然后共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。構(gòu)建成功表達(dá)rhIL-12的CHO細(xì)胞株應(yīng)用Gibco的CHO-S-SFM II進(jìn)行靜止培養(yǎng)，再應(yīng)用Sartorius BiosSTAT plus細(xì)胞培養(yǎng)罐進(jìn)行批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，采用ELISA法檢測(cè)rhIL-12的含量，靜止培養(yǎng)平均濃度為4.3μg/ml，細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)平均濃度為10.2μg/ml。

將發(fā)酵后的培養(yǎng)液純化后，將產(chǎn)物采用PBMC IFNγ誘生法測(cè)定生物活性。具體為，取健康人新鮮外周血，分離淋巴細(xì)胞。用含10％滅活胎牛血清的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力＞95％)，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液及相應(yīng)稀釋濃度的rhIL-12國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和純化的rhIL-12，空白對(duì)照組加RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照加Anti-human CD3(終濃度0.2μg/ml)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每孔50μl，離心處理后，ELISA法測(cè)定IFNγ含量：在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔吸光度A值，Ascent software version2.6軟件曲線定量計(jì)算IFNγ含量。根據(jù)IFNγ含量來(lái)計(jì)算rhIL-12的生物活性。測(cè)得生物活性為9.7×10⁶IU/mg。

實(shí)施例1

將p40cDNA和p35cDNA片段插入pcDNA3.1(+)載體中，并將adh1intron基因插入在CMV啟動(dòng)子與p35cDNA之間。p35表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-adh1intron-p35cDNA，p40表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-p40cDNA。構(gòu)建成功表達(dá)rhIL-12的CHO細(xì)胞株應(yīng)用Gibco的CHO-S-SFM II進(jìn)行靜止培養(yǎng)，再應(yīng)用Sartorius BiosSTAT plus細(xì)胞培養(yǎng)罐進(jìn)行批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，采用ELISA法檢測(cè)rhIL-12的含量，靜止培養(yǎng)平均濃度為6.7μg/ml，細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)平均濃度為16.9μg/ml。

將發(fā)酵后的培養(yǎng)液純化后，將產(chǎn)物采用PBMC IFNγ誘生法測(cè)定生物活性。具體為，取健康人新鮮外周血，分離淋巴細(xì)胞。用含10％滅活胎牛血清的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力＞95％)，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液及相應(yīng)稀釋濃度的rhIL-12國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和純化的rhIL-12，空白對(duì)照組加RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照加Anti-human CD3(終濃度0.2μg/ml)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每孔50μl，離心處理后，ELISA法測(cè)定IFNγ含量：在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔吸光度A值，Ascent software version2.6軟件曲線定量計(jì)算IFNγ含量。根據(jù)IFNγ含量來(lái)計(jì)算rhIL-12的生物活性。測(cè)得生物活性為8.3×10⁶IU/mg。

實(shí)施例2

將SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2基因片段插入pcDNA3.1(+)載體中，并將adh1intron基因插入在CMV啟動(dòng)子與SEQ ID NO.1之間。p35表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-adh1intron-SEQ ID NO.1，p40表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-SEQ ID NO.2。構(gòu)建成功表達(dá)rhIL-12的CHO細(xì)胞株應(yīng)用Gibco的CHO-S-SFM II進(jìn)行靜止培養(yǎng)，再應(yīng)用Sartorius BiosSTAT plus細(xì)胞培養(yǎng)罐進(jìn)行批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，采用ELISA法檢測(cè)rhIL-12的含量，靜止培養(yǎng)平均濃度為6.8μg/ml，細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)平均濃度為17.1μg/ml。

將發(fā)酵后的培養(yǎng)液純化后，將產(chǎn)物采用PBMC IFNγ誘生法測(cè)定生物活性。具體為，取健康人新鮮外周血，分離淋巴細(xì)胞。用含10％滅活胎牛血清的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力＞95％)，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液及相應(yīng)稀釋濃度的rhIL-12國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和純化的rhIL-12，空白對(duì)照組加RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照加Anti-human CD3(終濃度0.2μg/ml)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每孔50μl，離心處理后，ELISA法測(cè)定IFNγ含量：在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔吸光度A值，Ascent software version2.6軟件曲線定量計(jì)算IFNγ含量。根據(jù)IFNγ含量來(lái)計(jì)算rhIL-12的生物活性。測(cè)得生物活性為9.7×10⁶IU/mg。

實(shí)施例3

將SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2基因片段插入pCI-neo載體中，并將SEQ ID NO.1連接到intron下游。p35表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-intron-SEQ ID NO.1，p40表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)為：SV40增強(qiáng)子-CMV啟動(dòng)子-SEQ ID NO.2。構(gòu)建成功表達(dá)rhIL-12的CHO細(xì)胞株應(yīng)用Gibco的CHO-S-SFM II進(jìn)行靜止培養(yǎng)，再應(yīng)用Sartorius BiosSTAT plus細(xì)胞培養(yǎng)罐進(jìn)行批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)，采用ELISA法檢測(cè)rhIL-12的含量，靜止培養(yǎng)平均濃度為6.0μg/ml，細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)平均濃度為16.2μg/ml。

將發(fā)酵后的培養(yǎng)液純化后，將產(chǎn)物采用PBMC IFNγ誘生法測(cè)定生物活性。具體為，取健康人新鮮外周血，分離淋巴細(xì)胞。用含10％滅活胎牛血清的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力＞95％)，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液及相應(yīng)稀釋濃度的rhIL-12國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和純化的rhIL-12，空白對(duì)照組加RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照加Anti-human CD3(終濃度0.2μg/ml)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每孔50μl，離心處理后，ELISA法測(cè)定IFNγ含量：在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔吸光度A值，Ascent software version2.6軟件曲線定量計(jì)算IFNγ含量。根據(jù)IFNγ含量來(lái)計(jì)算rhIL-12的生物活性。測(cè)得生物活性為9.7×10⁶IU/mg。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)例1將改造后的基因插入pEGFP-N1載體中，在p35表達(dá)單元的結(jié)構(gòu)中沒(méi)有插入具有表達(dá)增強(qiáng)作用的內(nèi)含子，導(dǎo)致其培養(yǎng)后細(xì)胞液濃度相比實(shí)施例2有著顯著的下降。對(duì)比例1及實(shí)施例1均為野生型rhIL-12表達(dá)載體的構(gòu)建，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，野生型rhIL-12的生物活性(8.3×10⁶IU/mg)要比改造序列后rhIL-12的生物活性(9.7×10⁶IU/mg)低。同時(shí)，對(duì)比例1,2均采用現(xiàn)有技術(shù)的方法構(gòu)建工程菌。實(shí)施例1-3采用本發(fā)明中的方法構(gòu)建工程菌。實(shí)驗(yàn)證明，無(wú)論是構(gòu)建野生型rhIL-12，還是改造后的rhIL-12，采用該方法發(fā)酵的細(xì)胞培養(yǎng)液，其靜止培養(yǎng)濃度，以及細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)培養(yǎng)濃度，都要顯著低于本發(fā)明的構(gòu)建方法。

表3各實(shí)驗(yàn)例、對(duì)比例、實(shí)施例其蛋白發(fā)酵后的濃度及活性