專利名稱：戊型肝炎病毒中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于血清(漿)抗體的ELISA檢測(cè)方法的血清(漿)中戊型肝炎病毒中和抗體檢測(cè)方法，尤其涉及戊型肝炎病毒中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)是無(wú)包膜的單正鏈RNA病毒，經(jīng)糞口途徑傳播，引起的急性戊型肝炎(hepatitis E，HE)，多表現(xiàn)為急性黃疸型肝炎，易發(fā)展為亞急性重癥肝炎或淤膽肝炎。根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部27種法定報(bào)告?zhèn)魅静∫咔閳?bào)告統(tǒng)計(jì)，HE發(fā)病率高，死亡率高，近年來(lái)呈逐年上升趨勢(shì)。2002年～2005年11月HE平均病死率約為0.37％，遠(yuǎn)較同樣經(jīng)糞口途徑傳播的甲型肝炎(0.06％)為高，在病毒性肝炎中高居首位，尤其是孕婦患病，病死率高達(dá)20％甚至35％，且易感人群多為15～59歲的青壯年，危害嚴(yán)重。目前HE尚無(wú)特異的治療方法，也無(wú)主動(dòng)和被動(dòng)免疫制劑可供預(yù)防。國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于戊型肝炎病毒疫苗的研究。疫苗的有效性在于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，與病毒結(jié)構(gòu)蛋白上的中和抗原表位結(jié)合，阻斷該表位與敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，從而阻止該病毒入侵敏感細(xì)胞，發(fā)揮疫苗的保護(hù)作用。而衡量疫苗是否有效的標(biāo)準(zhǔn)，就是疫苗能否誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，以及誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的能力，傳統(tǒng)采用體內(nèi)和(或)體外中和試驗(yàn)鑒定疫苗的有效性。目前對(duì)戊型肝炎病毒敏感的動(dòng)物只有非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，然而非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染戊型肝炎病毒后多為亞臨床型感染，難以獲得滿意的動(dòng)物模型，而且使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物建立動(dòng)物模型，價(jià)格昂貴，方法繁瑣，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，動(dòng)物飼養(yǎng)要求高，耗費(fèi)大量的人力物力，難以在基層廣泛使用。另外，由于戊型肝炎病毒缺乏有效的組織培養(yǎng)體系，傳統(tǒng)的體外中和試驗(yàn)鑒定難以進(jìn)行，1998年孟繼鴻等發(fā)明了基于PCR和細(xì)胞培養(yǎng)的體外中和試驗(yàn)用以評(píng)價(jià)戊型肝炎病毒疫苗的有效性，但該體外中和試驗(yàn)需要細(xì)胞培養(yǎng)及RT-PCR技術(shù)，方法繁瑣，價(jià)格也較昂貴，也難以普遍推廣應(yīng)用。因而開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)戊型肝炎病毒中和抗體的方法，是為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研制出戊型肝炎病毒中和抗體競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，代替戊型肝炎病毒體內(nèi)和(或)體外中和試驗(yàn)，克服體內(nèi)和(或)中和試驗(yàn)方法繁瑣、昂貴、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的缺點(diǎn)，評(píng)價(jià)疫苗的有效性。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種戊型肝炎病毒中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法血清(漿)或其他生物學(xué)樣本中的抗戊型肝炎病毒中和抗體與酶標(biāo)記戊型肝炎病毒中和性單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被抗原上的中和抗原表位，根據(jù)酶作用底物顯色反應(yīng)減弱的程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物學(xué)樣本中的戊型肝炎病毒中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
上述包被抗原為不同基因型和亞型的戊型肝炎病毒開(kāi)放讀碼框架2或其片段編碼的重組蛋白或多肽，可單獨(dú)或組合形成包被抗原。
本發(fā)明的積極效果一、簡(jiǎn)便快速應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA檢測(cè)戊型肝炎病毒中和抗體，簡(jiǎn)便易行，可隨時(shí)隨地進(jìn)行，克服了體內(nèi)和(或)體外中和試驗(yàn)方法繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，可用于科研院所開(kāi)發(fā)疫苗的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，也可在基層推廣應(yīng)用。二、特異性強(qiáng)由于應(yīng)用戊型肝炎病毒中和性單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，能與其產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)的僅有戊型肝炎病毒中和抗體，因而具有高度的特異性。三、成本低、安全性好由于使用ELISA方法，實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用試劑生產(chǎn)操作成本低，克服了體內(nèi)中和試驗(yàn)使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，價(jià)格昂貴、耗時(shí)、耗力的缺點(diǎn)，且不須接觸感染性的病毒顆?；虿《竞怂?，不會(huì)對(duì)任何環(huán)境造成污染，安全性好。四、社會(huì)效益好戊型肝炎病毒感染呈逐年上升趨勢(shì)，HE病死率高，青壯年易感，危害嚴(yán)重，疫苗的應(yīng)用是預(yù)防傳染病的重要措施，建立簡(jiǎn)便有效的疫苗評(píng)價(jià)方法，可以對(duì)疫苗的有效性進(jìn)行較好的評(píng)價(jià)，降低社會(huì)防治成本，具有良好的社會(huì)效益。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例所采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)戊型肝炎病毒疫苗免疫恒河猴血清抗-戊型肝炎病毒中和抗體的結(jié)果圖。
圖2是本發(fā)明戊型肝炎病毒中和抗體競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例詳述本發(fā)明1、包被抗原的獲得包被抗原來(lái)自不同基因型和亞型的戊型肝炎病毒開(kāi)放讀碼框架2或其片段編碼的重組蛋白或多肽，可單獨(dú)或組合形成包被抗原。下面以具有代表性的7株戊型肝炎病毒為例詳述包被抗原的獲得。
7株戊型肝炎病毒分別為來(lái)自第I基因型Ia亞型的戊型肝炎病毒緬甸株(M73218)、Ib亞型的戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)、Ic亞型的戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)，來(lái)自第II基因型的戊型肝炎病毒墨西哥株(M74506)，來(lái)自第III基因型的戊型肝炎病毒美國(guó)株(AF060668)和戊型肝炎病毒新西蘭豬株(AF082843)，以及來(lái)自第IV基因型的戊型肝炎病毒中國(guó)株(AJ272108)。
7株戊型肝炎病毒ORF2編碼核苷酸序列分別為戊型肝炎病毒緬甸株(M 73218)ORF2Atgcgccctcggcctattttgttgctgctcctcatgtttttgcctatgctgcccgcgccaccgcccggtcagccgtctggccgccgtcgtgggcggcgcagcggcggttccggcggtggtttctggggtgaccgggttgattctcagcccttcgcaatcccctatattcatccaaccaaccccttcgcccccgatgtcaccgctgcggccggggctggacctcgtgttcgccaacccgcccgaccactcggctccgcttggcgtgaccaggcccagcgccccgccgttgcctcacgtcgtagacctaccacagctggggccgcgccgctaaccgcggtcgctccggcccatgacaccccgccagtgcctgatgtcgactcccgcggcgccatcttgcgccggcagtataacctatcaacatctccccttacctcttccgtggccaccggcactaacctggttctttatgccgcccctcttagtccgcttttaccccttcaggacggcaccaatacccatataatggccacggaagcttctaattatgcccagtaccgggttgcccgtgccacaatccgttaccgcccgctggtccccaatgctgtcggcggttacgccatctccatctcattctggccacagaccaccaccaccccgacgtccgttgatatgaattcaataacctcgacggatgttcgtattttagtccagcccggcatagcctctgagcttgtgatcccaagtgagcgcctacactatcgtaaccaaggctggcgctccgtcgagacctctggggtggctgaggaggaggctacctctggtcttgttatgctttgcatacatggctcactcgtaaattcctatactaatacaccctataccggtgccctcgggctgttggactttgcccttgagcttgagtttcgcaaccttacccccggtaacaccaatacgcgggtctcccgttattccagcactgctcgccaccgccttcgtcgcggtgcggacgggactgccgagctcaccaccacggctgctacccgctttatgaaggacctctattttactagtactaatggtgtcggtgagatcggccgcgggatagccctcaccctgttcaaccttgctgacactctgcttggcggcctgccgacagaattgatttcgtcggctggtggccagctgttctactcccgtcccgttgtctcagccaatggcgagccgactgttaagttgtatacatctgtagagaatgctcagcaggataagggtattgcaatcccgcatgacattgacctcggagaatctcgtgtggttattcaggattatgataaccaacatgaacaagatcggccgacgccttctccagccccatcgcgccctttctctgtccttcgagctaatgatgtgctttggctctctctcaccgctgccgagtatgaccagtccacttatggctcttcgactggcccagtttatgtttctgactctgtgaccttggttaatgttgcgaccggcgcgcaggccgttgcccggtcgctcgattggaccaaggtcacacttgacggtcgccccctctccaccatccagcagtactcgaagaccttctttgtcctgccgctccgcggtaagctctctttctgggaggcaggcacaactaaagccgggtacccttataattataacaccactgctagcgaccaactgcttgtcgagaatgccgccgggcaccgggtcgctatttccacttacaccactagcctgggtgctggtcccgtctccatttctgcggttgccgttttagccccccactctgcgctagcattgcttgaggataccttggactaccctgcccgcgcccatacttttgatgatttctgcccagagtgccgcccccttggccttcagggctgcgctttccagtctactgtcgctgagcttcagcgccttaagatgaaggtgggaaatcgggagttgtag戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)ORF2Atgcgccctcggcctattttgctgttgctcctcatgtttctgcctatgctgcccgcgccaccgcccggtcagccgtctggccgccgtcgtgggcggcgcagcggcggttccggcggtggtttctggggtgaccgggttgattctcagcccttcgcaatcccctatattcatccaaccaaccccttcgcccccgatgtcaccgctgcggccggggctggacctcgtgttcgccaacccgcccgaccactcggctccgcttggcgtgaccaggcccagcgccccgccgctgcctcacgtcgtagacctaccacagctggggccgcgccgctaaccgcggtcgctccggcccatgacaccccgccagtgcctgatgttgactcccgcggcgccatcctgcgccggcagtataacctatcaacatctcccctcacctcttccgtggccaccggcaaatttggttctttacgccgctcctcttagcccgcttctacccctccaggacggcaccaatactcatataatggctacagaagcttctaattatgcccagtaccgggttgctcgtgccacaattcgctaccgcccgctggtccccaacgctgttggtggctacgctatctccatttcgttctggccacagaccaccaccaccccgacgtccgttgacatgaattcaataacctcgacggatgtccgtattttagtccagcccggcatagcctccgagcttgttattccaagtgagcgcctacactatcgcaaccaaggttggcgctctgttgagacctccggggtggcggaggaggaggccacctctggtcttgtcatgctctgcatacatggctcacctgtaaattcttatactaatacaccctataccggtgccctcgggctgttggactttgccctcgaacttgagttccgcaacctcacccccggtaataccaatacgcgggtctcgcgttactccagcactgcccgtcaccgccttcgtcgcggtgcagatgggactgccgagctcaccaccacggctgctactcgcttcatgaaggacctctattttactagtactaatggtgttggtgagatcggccgcgggatagcgcttaccctgtttaaccttgctgacaccctgcttggcggtctaccgacagaattgatttcgtcggctggtggccagctgttctactctcgccccgtcgtctcagccaatggcgagccgactgttaagctgtatacatctgtggagaatgctcagcaggataagggtattgcaatcccgcatgacatcgacctcggggaatcccgtgtagttattcaggattatgacaaccaacatgagcaggaccgaccgacaccttccccagccccatcgcgtcctttttctgtcctccgagctaacgatgtgctttggctttctctcaccgctgccgagtatgaccagtccacttacggctcttcgaccggcccagtctatgtctctgactctgtgaccttggttaatgttgcgaccggcgcgcaggccgttgcccggtcactcgactggaccaaggtcacacttgatggtcgccccctttccaccatccagcagtattcaaagaccttctttgtcctgccgctccgcggtaagctctccttttgggaggcaggaactactaaagccgggtacccttataattataacaccactgctagtgaccaactgctcgttgagaatgccgctgggcatcgggttgctatttccacctacactactagcctgggtgctggccccgtctctatttccgcggttgctgttttagccccccactctgtgctagcattgcttgaggataccatggactaccctgcccgcgcccatactttcgatgacttctgcccggagtgccgcccccttggcctccagggttgtgcttttcagtctactgtcgctgagcttcagcgccttaagatgaaggtgggtaaaactcgggagttatag戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)ORF2Atgcgccctcggcctattttgttgctgttcctcatgtttctgcctatgttgcccgcgccaccgtccggtcagccgtctggccgccgtcgtgggcggcgcagcggcggttccggcggtggtttctggggtgaccgggttgattctcagcccttcgcaatcccctatattcatccaaccaaccccttcgcccccgatgtcaccgctgcggccggggctggacctcgtgttcgccaacccgcccgaccactcggctccgcttggcgtgaccaggcccagcgccccgccgctgcctcacgtcgtagacctaccacagctggggccgcgccgctgactgcggttgctccggcccatgataccccgcctgtgcccgatgttgattctcgcggcgctatcttgcgccggcagtataatctttcaacatcccctcttacctcctccgtggccactggcaccaatttggtcctttatgctgcccctcttagcccgcttttgccccttcaggacggcaccaatactcatataatggccacggaggcttccaattatgcccagtaccgagttgcccgcgccacaatccgctaccgccctctggttcccaatgctgttggtggctatgctatctctatatcgttctggccgcagaccactaccaccccgacgtccgtcgacatgaattctataacctcgacggatgttcgtattctcgtccagcccggtattgcctcagagcttgtgattccaagtgaacgcctgcattatcgcaaccagggttggcgctctgttgaaacctccggggtggcggaggaggaggccacctctggccttgtcatgctttgtatacatggctcacctgtgaactcttatactaacacaccttacactggtgccctcgggttgttggattttgctctcgagcttgagttccgcaacctcacccctggtaacaccaatacacgggtttcccgctactctagcaccgccc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73218)pORF2MRPRPILLLLLMFLPMLPAPPPGQPSGRRRGRRSGGSGGGFWGDRVDSQPFAIPYIHPTNPFAPDVTAAAGAGPRVRQPARPLGSAWRDQAQRPAVASRRRPTTAGAAPLTAVAPAHDTPPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVATGTNLVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVARATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSLVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLYFTSTNGVGEIGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSALALLEDTLDYPARAHTFDDFCPECRPLGLQGCAFQSTVAELQRLKMKVGKTREL.
戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)pORF2MRPRPILLLLLMFLPMLPAPPPGQPSGRRRGRRSGGSGGGFWGDRVDSQPFAIPYIHPTNPFAPDVTAAAGAGPRVRQPARPLGSAWRDQAQRPAAASRRRPTTAGAAPLTAVAPAHDTPPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVATGTNLVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVARATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLYFTSTNGVGEIGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSVLALLEDTMDYPARAHTFDDFCPECRPLGLQGCAFQSTVAELQRLKMKVGKTREL.
戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)pORF2MRPRPILLLFLMFLPMLPAPPSGQPSGRRRGRRSGGSGGGFWGDRVDSQPFAIPYIHPTNPFAPDVTAAAGAGPRVRQPARPLGSAWRDQAQRPAAASRRRPTTAGAAPLTAVAPAHDTPPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVATGTNLVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVARATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLYFSSTNGVGEIGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSALALLEDTLDYPARAHTFDDFCPECRPLGLQGCAFQSTVAELQRLKMKVGKTREL.
戊型肝炎病毒墨西哥株(M74506)pORF2MRPRPLLLLFLLFLPMLPAPPTGQPSGRRRGRRSGGTGGGFWGDRVDSQPFAIPYIHPTNPFAPDVAAASGSGPRLRQPARPLGSTWRDQAQRPSAASRRRPATAGAAALTAVAPAHDTSPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVASGTNLVLYAAPLNPPLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVARATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTTCNTNTRVSRYSSTARHSARGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGLNGVGEVGRGIALTLLNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGVAIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYISDSVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLPTVEQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTRLGAGPVAISAAAVLAPRSALALLEDTFDYPGRAHTFDDFCPECRALGLQGCAFQSTVAELQRLKVKVGKTREL.
戊型肝炎病毒美國(guó)株(AF060668)pORF2MRPRAVLLLFLMFLPMLPAPPAGQPSGRRRGRRSGGAGGGFWSDRVDSQPFALPYIHPTNPFAADVVSQPGAGTRPRQPPRPLGSAWRDQSKRPSVAPRRRSTPAGAAPLTAISPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVASGTNLVLYAAPLNPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETTGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGITIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYXQTTYGSSTNPMYVSDTVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKKFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPTSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYPARAHTFDDFCPECRTLGLQGCAFQSTIAELQRLKMKVGKTRES.
戊型肝炎病毒新西蘭豬株(AF082843)pORF2MRPRAVLLLLFVLLPMLPAPPAGQPSGRRCGRRNGGAGGGFWGDRVDSQPFALPYIHPTNPFAADVVSQPGAGVRPRQPPRPLGSAWRDQSQRPSTAPRRRSAPAGAAPLTAVSPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVAAGTNLVLYAAPLNPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRWRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETTGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGITIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPTSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYPARAHTFDDFCPECRTLGLQGCAFQSTIAELQRLKMKVGKTRES.
戊型肝炎病毒中國(guó)株(AJ272108)pORF2MNNMFFCSVHGDATMRSRALLFLLFVLLPMLPAPPAGQPSGRRRGQAGCGGGFWGDRVDSQPFALPYIHPTNPFASDIPAAAGTGARPRQPIRPLGSAWRDQSQRPAASTRRRPAPAGASPLTAVAPAPDTAPVPDADSRGAILRRQYNLSTSPLTSTIATGTNFVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVTPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSSARHKLRRGPDGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGELTVKLYTSVENAQQDKGVAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSVSAVGVLAPHSALAALEDTADYPARAHTFDDFCPECRALGLQGCAFQSTVGELQRLKMKVGKTREY.
抗原蛋白選擇戊型肝炎病毒ORF2或其片段編碼的重組蛋白或多肽，優(yōu)選戊型肝炎病毒ORF2編碼第452～617位氨基酸之間166個(gè)氨基酸的重組蛋白，命名為p166，氨基酸序列如下戊型肝炎病毒緬甸株(M 73218)p166BurTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSALALLEDTLDYP戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)p166SarPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSVLALLEDTMDYP戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)p166MorPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSALALLEDTLDYP戊型肝炎病毒墨西哥株(M74506)p166MexPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYISDSVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLPTVEQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTRLGAGPVAISAAAVLAPRSALALLEDTFDYP戊型肝炎病毒美國(guó)株(AF060668)p166UsPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYXQTTYGSSTNPMYVSDTVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKKFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPTSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYP戊型肝炎病毒新西蘭豬株(AF082843)p166NzPSPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSVSAVGVLAPHSALAILEDTVDYS戊型肝炎病毒中國(guó)株(AJ272108)p166ChnPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYP(1)根據(jù)序列合成特異性引物，以上述7株戊型肝炎病毒基因組序列為模板，分別擴(kuò)增上述7株戊型肝炎病毒編碼ORF2C端452～617位氨基酸的基因片段。PCR條件為94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化，克隆入質(zhì)粒載體pGEX-4T-2載體(Pharmacia產(chǎn)品)。
引物序列為戊型肝炎病毒緬甸株(M 73218)p166Bur引物B1CCC GGA TTC CCG ACGCCT TCT CCA GCC CCA TC，引物B2CCC CTC GAG TCA AGG GTA GTCCAA GGT ATC CTC AA；戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)p166Sar引物S1CCC GGA TTC CCG ACCCCT TCT CCT GCC CCA TC，引物S2CCC CTC GAG TCA AGG GTA GTC CATGGT ATC CTC AA；戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)p166Mor引物Mo1CCC GGA TTC CCGACC CCT TCT CCT GCC CCA TC，引物Mo2CCC CTC GAG TCA AGG GTAATC CAG GGT ATC CTC AA戊型肝炎病毒墨西哥株(M74506)p166Mex引物Me1CCC GGA TTC CCG ACCCCT TCT CCT GCC CCA TC，引物Me2CCC CTC GAG TCA CGG ATA ATCAAA AGT ATC CTC CA；戊型肝炎病毒美國(guó)株(AF060668)p166Us引物U1CCC GGA TTC CCG ACCCCT TCT CCT GCC CCATC，引物U2CCC CTC GAG TCA TCC TAT TAG TTGTCA TAG GAG C戊型肝炎病毒新西蘭豬株(AF082843)p166Nz引物N1CCC GGA TTC CCGACC CCT TCT CCT GCC CCA TC，引物N2CCC CTC GAG TCA CGA ATA ATCAAC AGT ATC TTC AA；戊型肝炎病毒中國(guó)株(AJ272108)p166Chn引物C1CCC GGA TTC CCG ACCCCT TCT CCT GCC CCA TC，引物C2CCC CTC GAG TCA AGG GTA ATC AACAGT GTC CTC CA。
(2)將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coli JM109菌株(Promega產(chǎn)品)中，挑取單菌落，用含有50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD550＝0.6～0.8，用終濃度為0.2～1.0mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為37℃，搖床搖速為200rpm，3-4小時(shí)后離心收集菌體，用細(xì)胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.2，300mM NaCl)懸浮菌體沉淀，凍融6次后超聲破碎菌體，離心收集上清液，經(jīng)GST-Sepharose4B(Pharmacia產(chǎn)品)親和層析純化，得到7種代表戊型肝炎病毒不同基因型和亞型的重組蛋白即抗原，分別命名為p166Bur、p166Pak、p166Mor、p166Mex、p166Us、p166Nz和p166Chn。最后使用UV280、SDS-PAGE等方法進(jìn)行檢測(cè)、定量。
2、中和性單克隆抗體的制備和鑒定(1)動(dòng)物免疫采用常規(guī)方法分別以代表4種主要基因型戊型肝炎病毒的重組蛋白p166Bur、p166Mex、p166US和p166Chn各50μg與福氏佐劑混合腹腔注射免疫6-8周齡雌性Balb/c小鼠，共3次，間隔2周至1月。
(2)雜交瘤細(xì)胞株的建立用所免疫的p166Bur、p166Mex、p166US和p166Chn重組蛋白包被酶標(biāo)反應(yīng)板，GST包被酶標(biāo)反應(yīng)板作為對(duì)照孔。采用間接ELISA法篩選，凡p166Bur、p166Mex、p166US和p166Chn陽(yáng)性，同時(shí)GST陰性者，為單克隆抗體陽(yáng)性孔。經(jīng)3次亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株分別對(duì)應(yīng)為4G5、8G10、3D4和5G5。
(3)單克隆抗體的大量制備和鑒定采用制備腹水和培養(yǎng)瓶直立培養(yǎng)法大量制備單克隆抗體。以HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG亞類抗體及兔抗鼠IgM抗體為二抗，采用間接ELISA法檢測(cè)鑒定單克隆抗體免疫球蛋白類型和亞類。所收集的培養(yǎng)上清或腹水經(jīng)倍比稀釋后用ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)。
表1.戊型肝炎病毒單克隆抗體的免疫球蛋白類型和亞類及其抗體效價(jià)

(4)單克隆抗體特異性鑒定采用間接ELISA法和Western-blot法鑒定所獲得的單克隆抗體s與7種不同戊型肝炎病毒基因型和亞型的p166重組蛋白(p166Bur、p166Pak、p166Mor、p166Mex、p166Us、p166Nz和p166Chn)的反應(yīng)性。
表2.戊型肝炎病毒單克隆抗體與不同基因型和亞型p166重組蛋白的反應(yīng)性

(5)單克隆抗體的體外中和試驗(yàn)鑒定1)培養(yǎng)PLC/PRF/5細(xì)胞生長(zhǎng)至單層；2)將倍比稀釋的單克隆抗體腹水100ul與含100TCID50/100ul戊肝病毒懸液混合，37℃共同孵育2小時(shí)后接種PLC/PRF/5細(xì)胞；3)37℃共同孵育2小時(shí)后，洗去未吸附的病毒，使用Trizol法提取核酸，以引物3(5’-CCG ACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCGGCC AAT GGC GAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGCCA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCG TAC TC-3’)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR檢測(cè)戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR條件為第一輪94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35個(gè)循環(huán)，引物為引物3和引物6；第二輪94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30個(gè)循環(huán)，引物為引物4和引物5；4)RT-PCR陰性判為中和試驗(yàn)陽(yáng)性，最后將能中和病毒的單克隆抗體4G5、8G10、3D4和5G5判為戊型肝炎病毒中和性單克隆抗體。
(6)單克隆抗體的純化1)單克隆抗體離心去除沉淀，濾紙過(guò)濾去除脂質(zhì)，加入1/10體積的1M Tris.HCl，PH 8.0，調(diào)節(jié)PH至中性；2)用10倍體積的1MTris.HCl，PH 8.0平衡Pierce公司生產(chǎn)的Protein G瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱；3)上樣取1ml預(yù)處理的單克隆抗體腹水上柱，室溫孵育10min；4)洗柱加入10倍體積的(0.1M Tris.HCl，PH 8.0)洗柱，洗去未結(jié)合之蛋白，檢測(cè)A280，至A值降至基線；5)洗脫每次加入1倍柱體積的洗脫緩沖液0.05M Gly.HCl，PH 2.5-3.0洗脫結(jié)合在純化柱上的單克隆抗體，收集、混合，測(cè)定A280值定量，分裝后-20℃保存。
3、酶標(biāo)記單克隆抗體的制備本實(shí)施例以辣根過(guò)氧化物酶為例詳述酶標(biāo)記單克隆抗體的制備。
1)稱取辣根過(guò)氧化物酶5mg，溶解于0.2ml去離子水中，滴加新鮮配制的0.1mol/L高碘酸鈉(NaIO4)溶液0.04ml，室溫?cái)嚢?0分鐘；2)將醛化的辣根過(guò)氧化物酶裝入透析袋，對(duì)1mmol/L醋酸緩沖液(PH4.4)透析過(guò)夜；3)加入0.2mol/L碳酸鹽緩沖液(PH9.5)調(diào)整辣根過(guò)氧化物酶溶液PH值為9.0～9.5，立即加入戊型肝炎病毒中和性單克隆抗體(PH9.0～9.5)；4)加入新鮮配制的硼氫化鈉溶液(4mg/ml)0.02ml，4℃靜止2小時(shí)；5)加入等量的飽和硫酸鈉溶液，4℃靜止30分鐘，5000rpm離心30分鐘，去上清；6)沉淀以適量PBS溶解，裝入透析袋，對(duì)PBS透析48小時(shí)，即為辣根共氧化物酶標(biāo)記的戊型肝炎病毒中和性單克隆抗體，加入1％牛血清白蛋白，再加入等體積甘油，-20℃保存。
4、戊型肝炎病毒中和抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立以戊型肝炎病毒ORF2或其片段編碼的重組蛋白或多肽作為包被抗原，可單獨(dú)或組合形成包被抗原，下面以p166重組蛋白為例詳述戊型肝炎病毒中和抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立。
(1)包被抗原1)包被抗原可以這樣選擇上述7株戊型肝炎病毒ORF2C端編碼452～617位氨基酸的重組蛋白p166Bur、p166Pak、p166Mor、p166Mex、p166Us、p166Nz和p166Chn可分別形成包被抗原，用PH9.50.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋至10～2000ng/ml，100μl/孔加入酶標(biāo)反應(yīng)板，4℃包被過(guò)夜。
2)包被抗原也可以這樣選擇上述7株戊型肝炎病毒ORF2C端編碼452～617位氨基酸的重組蛋白p166Bur、p166Pak、p166Mor、p166Mex、p166Us、p166Nz和p166Chn可以1∶1比例等濃度混合，再用PH9.50.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋至10～2000ng/ml，100μl/孔加入酶標(biāo)反應(yīng)板，4℃包被過(guò)夜。
(2)洗滌包被第二天，以洗滌液(PH7.00.01mol/L PBS，0.05％tween-20)洗板3次；(3)檢測(cè)取包被反應(yīng)板，在檢測(cè)孔中加入待測(cè)樣本50μl、陽(yáng)性對(duì)照孔加入已知的陽(yáng)性血清50μl、陰性對(duì)照孔中加入已知的陰性血清50μl、參比對(duì)照孔加入PBS(0.05mol/L，PH7.0)50μl，再加入酶標(biāo)戊型肝炎病毒中和性單克隆抗體50μl，37℃共同孵育40分鐘，洗滌液洗板5次，洗去未結(jié)合的抗體；(4)顯色加入酶的底物，該底物可以是辣根過(guò)氧化物酶的底物，室溫下顯色10～15min；(5)終止加入終止液終止顯色反應(yīng)，讀取OD值；(6)結(jié)果判定根據(jù)公式抑制率＝(1-待測(cè)樣品孔OD值/參比對(duì)照孔OD值)×100％，以抑制率大于50％判斷為陽(yáng)性。
5、戊型肝炎病毒中和抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法在戊型肝炎病毒疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用采集本試驗(yàn)室制備的戊型肝炎病毒ORF2重組蛋白疫苗免疫的恒河猴血清，其中10μg組、20μg組各3只，每4周免疫一次，共免疫3次，對(duì)照組恒河猴3只，采用相同方案以PBS(.0.05mol/3，PH7.0)1ml免疫，每4周免疫一次，共免疫3次。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組9只恒河猴以中國(guó)株戊型肝炎病毒病毒懸液1ml(PCR滴度107)攻擊。各組恒河猴從0周開(kāi)始每周采血一次，應(yīng)用本發(fā)明的戊型肝炎病毒中和抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)中和性抗體產(chǎn)生情況，見(jiàn)圖1。從圖中數(shù)據(jù)可見(jiàn)，免疫組自免疫4周開(kāi)始，血清抗-戊型肝炎病毒中和抗體有明顯升高，并于8-9周后達(dá)到高峰，于6周左右開(kāi)始中和抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制率≥50％。對(duì)照組自病毒攻擊4周后血清抗-戊型肝炎病毒中和抗體開(kāi)始升高，并于攻毒9周后達(dá)到高峰。證明我們建立的戊型肝炎病毒中和抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗-戊型肝炎病毒中和抗體行之有效，可用于疫苗的篩選和評(píng)價(jià)。
權(quán)利要求
1.一種戊型肝炎病毒中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于血清(漿)或其他生物學(xué)樣本中的抗戊型肝炎病毒中和抗體與酶標(biāo)記戊型肝炎病毒中和性單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被抗原上的中和抗原表位，根據(jù)酶作用底物顯色反應(yīng)減弱的程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物學(xué)樣本中的戊型肝炎病毒中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的戊型肝炎病毒中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，包被抗原為不同基因型和亞型的戊型肝炎病毒開(kāi)放讀碼框架2或其片段編碼的重組蛋白或多肽，可單獨(dú)或組合形成包被抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種戊型肝炎病毒中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于血清(漿)或其他生物學(xué)樣本中的抗戊型肝炎病毒中和抗體與酶標(biāo)記戊型肝炎病毒中和性單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被抗原上的中和抗原表位，根據(jù)酶作用底物顯色反應(yīng)減弱的程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物學(xué)樣本中的戊型肝炎病毒中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有一、簡(jiǎn)便快速應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA檢測(cè)戊型肝炎病毒中和抗體，簡(jiǎn)便易行。二、特異性強(qiáng)由于應(yīng)用戊型肝炎病毒中和性單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物，能與其產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)的僅有戊型肝炎病毒中和抗體，因而具有高度的特異性。三、成本低、安全性好由于使用ELISA方法，實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用試劑生產(chǎn)操作成本低，且不須接觸感染性的病毒顆?；虿《竞怂幔踩院?。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1793929SQ20061003762
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者孟繼鴻, 戴星, 梁久紅, 田華, 趙宇, 董晨, 汪源, 鄧?yán)? 張紅梅 申請(qǐng)人:東南大學(xué)