專利名稱：：白果酚在抗腫瘤中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及白果酚在抗腫瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：銀杏(G/"紐oMoML.)是我國(guó)特有的古老樹(shù)種，銀杏的葉、果均可入藥，據(jù)"本草"記載，銀杏作為藥用已有六百多年的歷史，二十世紀(jì)六十年代以來(lái)，銀杏黃酮、內(nèi)酯兩大成分獨(dú)特的藥理作用和臨床效果得到肯定，使銀杏產(chǎn)首先在歐洲被廣泛接受，目前以銀杏黃酮、內(nèi)酯為藥效成分的銀杏葉提取物(ExtractofGinkgobiloba，EGb)是公認(rèn)的預(yù)防、治療心腦血管疾病的天然植物藥。銀杏酚酸是存在于銀杏中的另一大類活性成分，銀杏中的烷基酚酸類物質(zhì)包括白果酚(ginkgols)、銀杏酸(ginkgolicacids)和白果二酚(bilobols),三者的結(jié)構(gòu)式如下其中銀杏酸的含量約占銀杏葉干重的1%，外種皮干重的5%。由于銀杏酸可疑的致敏作用，長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是EGb中的有毒成分，要求其在EGb761中的含量必須在5ppm以下；而白果酚沒(méi)有銀杏酸所具有的致敏作用，因此在銀杏葉提取物中對(duì)其沒(méi)有限量要求。隨著人們對(duì)銀杏葉及其提取物中的酚酸類物質(zhì)的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)銀杏酸除了可疑的致敏作用外還具有許多生物活性已有的研究表明銀杏酸對(duì)多種G+菌有良好的抑制作用，能抑制部分人致病真菌及農(nóng)業(yè)病源菌的生長(zhǎng)。銀杏酸對(duì)多種肺癌細(xì)胞株、淋巴瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)有很好的抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用較??；作者研究了銀杏酸對(duì)淋巴瘤U937細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)銀杏酸能誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，說(shuō)明銀杏酸的抗腫瘤作用與誘導(dǎo)腫瘤凋亡有關(guān)。銀杏酸還具有良好的殺滅釘螺作用，是銀杏外種皮中的主要滅螺活性成分，相關(guān)工作作者已申請(qǐng)了相關(guān)專利(一種植物殺釘螺劑及其制備方法與使用方法),并獲得授權(quán)(專利號(hào)ZL200510122657.6)。有關(guān)銀杏酸的提取、制備、分析及活性已有多篇文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)1.仰榴青，吳向陽(yáng)，陳釣.高效液相色譜法測(cè)定銀杏外種皮中的銀杏酸.分析化學(xué)，2002,30(8):卯l德.2.VanBeekT.A.ChemicalanalysisofGinkgobilobaleavesandextracts.J.ChromatographyA,2002,967:21-55.3.H.Jaggy,E.Koch.ChemistryandBiologyofAlkyphenolsfromGinkgobilobaL..Pharmazie，1997,52:735-738.4.楊小明，朱偉，陳鈞，等.銀杏酸單體的抗菌活性研究.中藥材，2004，27(9):661-663.5.楊小明；錢(qián)之玉；陳鈞.銀杏外種皮中銀杏酸的體外抗腫瘤活性研究.中藥材，2004，27(1):40-42.6.吳向陽(yáng)，仰榴青，陳鉤.銀杏酸單體的制備及抗菌作用研究.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2003，發(fā)明人在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)銀杏酸結(jié)構(gòu)中的羧基對(duì)熱具有不穩(wěn)定性，在加熱的過(guò)程中容易脫羧而轉(zhuǎn)化成白果酚；作者通過(guò)生物活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)白果酚的抗腫瘤活性比銀杏酸更強(qiáng)，因此白果酚可以作為一種比銀杏酸具有更強(qiáng)抗腫瘤效果、而無(wú)致敏作用的活性物質(zhì)進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究，有關(guān)白果酚抗腫瘤藥物的研究對(duì)研發(fā)新型腫瘤治療藥物、對(duì)銀杏資源的充分開(kāi)發(fā)利用，將產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。由于白果酚在銀杏葉、果及外種皮中的含量顯著低于銀杏酸，因此，除了直接從銀杏中制備白果酚外，利用銀杏酸容易脫羧的特點(diǎn)，通過(guò)銀杏酸脫羧制備白果酚不失為一種更經(jīng)濟(jì)的白果酚制備方法。有關(guān)利用銀杏酸脫羧制備白果酚的方法，及白果酚的抗腫瘤活性目前均尚未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗腫瘤活性的化合物——白果酚的制備方法及其抗腫瘤的用途。本發(fā)明所涉及的白果酚為烷基或烯基苯酚類化合物，具有通式(I)的結(jié)構(gòu)。其中，R鏈為垸基或烯基，是抗腫瘤的主要活性成分，主要存在于銀杏(G&紐oW/o6aL.)的葉、果和外種皮中，或漆樹(shù)科漆樹(shù)屬植物的葉、果及樹(shù)皮中。其R基上的碳原子數(shù)為10~19，雙鍵數(shù)0~3。其R基上碳原子可被其它原子，如O、S、N或鹵素原子取代。(I)本發(fā)明所述白果酚可以采用以下方式制備以銀杏酸為原料，采用加熱方法脫除銀杏酸苯環(huán)上的羧基，轉(zhuǎn)化成白果酚，具體如下1、將銀杏酸與堿金屬、堿土金屬或過(guò)渡金屬氫氧化物按100:1~10:1的比例(g/g)混合后，在80°C~10(TC加熱、攪拌條件下進(jìn)行1~4小時(shí)，脫去羧基得到白果酚粗品；2、在白果酚粗品中加入210倍量(g/ml)的有機(jī)溶劑溶解，過(guò)濾，濃縮得到粗產(chǎn)物；3、將粗產(chǎn)物用硅膠柱層析純化，得到純度不小于96%的白果酚同系物。上述制備方法中，堿金屬氫氧化物為氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀；上述制備方法中，堿土金屬氫氧化物為氫氧化鈹、氫氧化鎂或氫氧化鋇；上述制備方法中，過(guò)渡金屬氫氧化物為氫氧化銅、氫氧化鐵或氫氧化鋅，但不限于這三種過(guò)渡元素氫氧化物；上述制備方法中，有機(jī)溶劑為丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯或氯仿；上述制備方法中，所述硅膠柱層析純化為梯度洗脫，洗脫液為氯仿和氯仿-甲醇混合溶液，氯仿-甲醇混合溶液比例從9:1(V/V)逐漸變?yōu)?:5(V/V)，但不限于這一洗脫劑組合體系。所述的銀杏酸通過(guò)化學(xué)分離方法，從銀杏的葉、果、外種皮的提取物中得到；或?qū)︺y杏葉提取物在提取加工過(guò)程中剩余的肥料中重新回收；或從其它植物含有本類化合物的各部分提取物中獲得。包含本發(fā)明化合物的藥物可以是來(lái)源于銀杏的葉、果和外種皮的提取物，也可以是來(lái)源于其它植物含有本類化合物的各部分提取物。本發(fā)明要求保護(hù)該化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，酯，溶劑化物，結(jié)晶形態(tài)的物質(zhì)。包含本發(fā)明化合物的藥物可以單獨(dú)作為抗腫瘤劑使用，也可與其它抗腫瘤劑聯(lián)合使用，以降低抗腫瘤效果或降低其毒副作用。包含本發(fā)明化合物的藥物組合物含有藥物可以接受的載體;所述的組合物可以是注射液或口服藥物制劑。從植物中尋找抗腫瘤藥物，在國(guó)內(nèi)外均為抗癌藥物研究的重點(diǎn)，有效地抗腫瘤化合物具有重要的臨床價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。我國(guó)有著豐富的銀杏資源，每年隨著白果的生產(chǎn)，大量的銀杏外種皮被作為廢棄物浪費(fèi)掉，利用銀杏外種皮中含量豐富的銀杏酸為原料，制備具有顯著抗腫瘤活性的白果酚化合物，對(duì)于新型抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)，對(duì)于銀杏資源的充分利用都具有重要意義。具體實(shí)施方法實(shí)施例l:白果酚同系物的制備(1)銀杏酸的提取將100g干燥、粉碎的銀杏外種皮，按l:5的比例加入石油醚(沸程6090。C)超聲萃取lh，過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并提取，揮去石油醚得外種皮提取浸膏。將浸膏分次用少量石油醚溶解加樣于硅膠柱上(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的玻璃柱，濕法裝柱)，用石油醚乙醚甲酸=89:11:1(V/V/V)洗脫，以薄層層析在254nm處出現(xiàn)熒光為檢測(cè)，收集銀杏酸組分，濃縮至干；重復(fù)過(guò)柱一次，得到的銀杏酸組分水洗至中性，濃縮至干，或用無(wú)水NaS04干燥后，得銀杏酸混合物。(2)白果酚的制備取1.0g銀杏酸和0.02gNaOH混于一個(gè)50ml的單頸燒瓶中，浸入IO(TC的水浴，磁力攪拌l小時(shí)，混合物冷卻至室溫，得到0.9g的白果酚，然后用3.0mL乙醇萃取。過(guò)濾，濃縮得到一黑褐色油狀物。該產(chǎn)物以乙醇溶解后，上樣于硅膠柱(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的玻璃柱，濕法裝柱)，分別采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例從9:1逐漸變?yōu)?:5，V/V)洗脫，以薄層層析在254nm處出現(xiàn)熒光為檢測(cè)，收集白果酚組分，濃縮至干；重復(fù)過(guò)柱一次，得到的白果酚同系混合物。(3)白果酚的鑒定制備得到的白果酚同系物為淺棕色液體，其甲醇溶液紫外吸收峰分別為201，275nm;紅外光譜(KBr壓片)上3340cm"處有寬的vo-h振動(dòng)，1260cm"處vc《和1370cm"處的So-h(面內(nèi))均可證實(shí)為烷基取代苯酚。LC-ESI-MS(ThermoelectronCroporation)分析安捷倫TC18柱(150x4.6mm，5nm)，流動(dòng)相甲醇一3。/。HAc溶液(90:10,v/v)，測(cè)得白果酚5個(gè)同系物的質(zhì)量分別為276，304，302，330，328，分別對(duì)應(yīng)于銀杏酸C13:0，C15:0，C15:1,C17:1和C17:2。實(shí)施例2:白果酚同系物的制備(4)銀杏酸的提取將100g干燥、粉碎的銀杏外種皮，按1:5的比例加入石油醚(沸程609(TC)超聲萃取lh，過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并提取，揮去石油醚得外種皮提取浸膏。將浸膏分次用少量石油醚溶解加樣于硅膠柱上(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的玻璃柱，濕法裝柱)，用石油醚乙醚甲酸=89:11:1(V/V/V)洗脫，以薄層層析在254nm處出現(xiàn)熒光為檢測(cè)，收集銀杏酸組分，濃縮至干；重復(fù)過(guò)柱一次，得到的銀杏酸組分水洗至中性，濃縮至干，或用無(wú)水NaS04干燥后，得銀杏酸混合物。(5)白果酚的制備取1.0g銀杏酸和0.01gMg(OH)2混于一個(gè)50ml的單頸燒瓶中，浸入9(TC的水浴，磁力攪拌l小時(shí)，混合物冷卻至室溫，得到0.9g的白果酚，然后用8.5mL乙酸乙酯萃取。過(guò)濾，濃縮得到一黑褐色油狀物。該產(chǎn)物以乙醇溶解后，上樣于硅膠柱(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的玻璃柱，濕法裝柱)，分別采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例從9:1逐漸變?yōu)?:5，V/V)洗脫，以薄層層析在254nm處出現(xiàn)熒光為檢測(cè)，收集白果酚組分，濃縮至干；重復(fù)過(guò)柱一次，得到的白果酚同系混合物。(6)白果酚的鑒定'制備得到的白果酚同系物為淺棕色液體，其甲醇溶液紫外吸收峰分別為201，275nm;紅外光譜(KBr壓片)上3340cm"處有寬的vo.H振動(dòng)，1260cm"處vc-o和1370cm"處的So-H(面內(nèi))均可證實(shí)為垸基取代苯酚。LC-ESI-MS(ThermoelectronCroporation)分析安捷倫TC18柱(150x4.6mm，5iim)，流動(dòng)相甲醇一3MHAc溶液(卯:10，v/v)，測(cè)得白果酚5個(gè)同系物的質(zhì)量分別為276，304，302,330,328，分別對(duì)應(yīng)于銀杏酸C13:0，C15:0,C15:1,C17:1和C17:2。實(shí)施例3:白果酚同系物的制備及抗腫瘤活性(1)銀杏酸的提取將100g干燥、粉碎的銀杏外種皮，按1:5的比例加入石油醚(沸程6090。C)超聲萃取lh，過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并提取，揮去石油醚得外種皮提取浸膏。將浸膏分次用少量石油醚溶解加樣于硅膠柱上(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的玻璃柱，濕法裝柱)，用石油醚乙醚甲酸=89:11:1(V/V/V)洗脫，以薄層層析在254nm處出現(xiàn)熒光為檢測(cè)，收集銀杏酸組分，濃縮至干；重復(fù)過(guò)柱一次，得到的銀杏酸組分水洗至中性，濃縮至干，或用無(wú)水NaS04干燥后，得銀杏酸混合物。(2)白果酚的制備取1.0g銀杏酸和0.08gCu(OH)2混于一個(gè)50ml的單頸燒瓶中，浸入80°C的水浴，磁力攪拌4小時(shí)，混合物冷卻至室溫，然后用5.0mL丙酮萃取。過(guò)濾，濃縮得到一黑褐色油狀物。該產(chǎn)物以氯仿溶解后，上樣于硅膠柱(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的玻璃柱，濕法裝柱)，分別采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例從9:1逐漸變?yōu)?:5，V/V)洗脫，以薄層層析在254nm處出現(xiàn)熒光為檢測(cè)，收集白果酚組分，濃縮至干；重復(fù)過(guò)柱一次，得到的白果酚同系混合物。(3)白果酚的鑒定7制備得到的白果酚同系物為淺棕色液體，其甲醇溶液紫外吸收峰分別為201，275nm;紅外光譜(KBr壓片)上3340cm-1處有寬的vo-H振動(dòng)，1260cm4處vc.o和1370cm"處的So-H(面內(nèi))均可證實(shí)為垸基取代苯酚。LC-ESI陽(yáng)MS(ThermoelectronCroporation)分析安捷倫TC18柱(150x4.6讓，5pm)，流動(dòng)相甲醇一3%HAc溶液(卯:10,v/v)，測(cè)得白果酚5個(gè)同系物的質(zhì)量分別為276，304，302，330,328，分別對(duì)應(yīng)于銀杏酸C13:0,C15:0,C15:1,C17:1和C17:2。(4)白果酚同系物的抗腫瘤活性采用MTT法，白果酚以DMSO溶解，再用DMEM培養(yǎng)液稀釋成需要濃度；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成5xl04個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔200nL于37'C，5%(302的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，將不同濃度的藥液加入上述培養(yǎng)孔內(nèi)，設(shè)5個(gè)平行孔，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，順鉑為陽(yáng)性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48h，中止前4h加入5mg/mlMTT溶液20nL，培養(yǎng)4h后吸出培養(yǎng)液，加入DMSO200pL，震蕩均勻，在4卯nm處測(cè)定光密度(OD值)，按公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率(％)=1-(OD實(shí)驗(yàn)-OD空白)/(OD對(duì)照-OD加)X100%。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。試驗(yàn)了白果酚對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721、人白血病細(xì)胞株K562和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的細(xì)胞毒性，結(jié)果見(jiàn)表l。表l、銀杏酸、白果酚對(duì)人腫瘤細(xì)胞的抑制作用LDso(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、白果酚在抗腫瘤中的應(yīng)用。2、白果酚在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。3、白果酚藥學(xué)上可接受的鹽，酯，溶劑化物，結(jié)晶形態(tài)的物質(zhì)。4、包含白果酚的藥物單獨(dú)作為抗腫瘤劑使用，或與其它抗腫瘤劑聯(lián)合使用。5、包含白果酚的藥物組合物含有藥物接受的載體；所述的組合物是注射液或口服藥物制劑。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及白果酚在抗腫瘤中的應(yīng)用。所述白果酚是用包括如下步驟的方法制備的從銀杏(葉、果及外種皮)中制備得到銀杏酸，將銀杏酸加熱處理脫羧，經(jīng)純化制得白果酚。本發(fā)明所制備的白果酚可有效地抑制人腫瘤細(xì)胞增殖，其對(duì)人腫瘤細(xì)胞的抑制作用均優(yōu)于銀杏酸。文檔編號(hào)A61P35/00GK101513398SQ200810234280公開(kāi)日2009年8月26日申請(qǐng)日期2008年11月28日優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日發(fā)明者方劉,楊小明,龔愛(ài)華申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)