專利名稱：：短葉蘇木酚的新用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及以石榴葉為原料提取的短葉蘇木酚在醫(yī)藥方面的新用途，屬于中藥
技術領域：
。技術背景石榴葉系石榴科石榴尸"加'cagr朋af鵬L.的葉，石榴為落葉灌木或喬木，高通常為2-5米，樹皮青灰色。幼枝近圓形或微呈四棱形，枝頂通常成刺狀，無毛。葉對生或簇生；葉片倒卵形至長橢圓形，長2.5-6cm，寬l-1.8cra。先端尖或微凹，基部漸狹，全緣，上面有光澤，無毛，下面有隆起的主脈，具短柄。石榴是一種常見果樹，我國南北都有栽培，以江蘇、河南等地種植面積較大。從面積和產(chǎn)量上而論，陜西臨潼、山東棗莊、安徽懷遠、四川(會理等攀西地區(qū))和云南(蒙自等地區(qū))是我國最有影響的五大產(chǎn)區(qū)。石榴葉多在秋季采集。除去雜質(zhì)后，陰干。含有鞣花酸(ellagicacid)，短葉蘇木酚(brevifolin)等成分。以石榴葉為原料提取的短葉蘇木酚(C,2H705)的結(jié)構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其物理化學特征黃色粉末(MeOH)，卿〉300°C(dec.),TLC檢查紫外燈365皿下顯亮白色熒光。EI-MS歷/k248(M+),231，214.IR(KBr)cm-1:3400，1705(00)，1670，1600,1520,1410'1390,1100。UV(MeOH)咖276，352。'HNMR(DMS0-d6)S:2.5(2H，m，H-2)，3.2(2H，m,H-3)，7.3(IH，s，H-7)。13C腿(DMS0-cUS:23.7(C-3)，32.9(C-2)，107.8(C-7)，113.1(C-6)，115.4(C-4)，140.0(C—5)，141.4(C—9),144.1(C—8),144.9(C-10)，149.1(C-12),160.5(C-11),195.5(C-1)。關于石榴葉的藥用記載最早見于唐.陳藏器的《本草拾遺》。其有關記載見于宋.唐慎微《經(jīng)史證類備急本草》(簡稱證類本草)。該書中引陳藏器曰石榴花葉干之為末，和鐵丹服之，一年變毛發(fā)色黑如漆。明.李時珍《本草綱目》記載治九窮出血，石榴花塞之取效，葉亦可。唐.孟詵《食療本草》記載石榴其花葉陰干，搗為末，和鐵丹服之，一年白發(fā)盡，益面紅色。明.蘭茂《滇南本草》中記載石榴葉治跌打損傷，敷患處。近人.經(jīng)利彬《滇南本草圖譜》記載石榴葉煎洗，療痘風瘡及風癩?！度珖胁菟巺R編》《中藥大辭典》記載石榴果皮治虛寒久瀉，腸炎，痢疾，便血，脫肛，血崩，絳蟲病和蛔蟲病，外用治稻田皮炎?；ㄓ弥瓮卵汪?，外用治中耳炎。葉治急性腸炎。近年來對石榴葉報道不斷增加，概括起來有以下內(nèi)容石榴葉內(nèi)服用治急性胃腸炎寒瀉證，常與生姜配伍。外用清熱消腫治療皮膚紅腫潰爛；將石榴葉烘炒炮制做成保健茶供人們使用，可神清目爽，健胃生津，去火療渴，消積化食，促進新陳代謝。藥理研究表明，石榴葉水浸劑顯著提高胃蛋白酶活性，增強膽汁分泌和增強小腸運動。明顯降低血清TC，TG，升高HDL。體外實驗能夠明顯抑制氧自由基的產(chǎn)生。石榴葉靜脈注射能顯著提高大鼠腦膜血流量。石榴葉作為防治肥胖癥藥用的記載比較少見，尤其未見報道短葉蘇木酚在制備治療前脂肪細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化，以及脂肪細胞胞內(nèi)脂質(zhì)堆積所引起疾病(如肥胖癥)的藥物中的應用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種短葉蘇木酚在醫(yī)藥方面的新用途，該用途為短葉蘇木酚在制備預防和治療前脂肪細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化時胞內(nèi)甘油三酯聚集所引起疾病的藥物中的應用。短葉蘇木酚在制備預防和治療前脂肪細胞分化末期胞內(nèi)3—磷酸甘油脫氫酶活性升高所引起疾病的藥物中的應用。短葉蘇木酚在制備治療脂肪細胞胞內(nèi)甘油三酯聚集時脂蛋白脂酶活性升高所引起疾病的藥物中的應用。短葉蘇木酚在制備預防和治療體內(nèi)前脂肪細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化所引起的肥胖癥的藥物中的應用。短葉蘇木酚在制備治療體內(nèi)脂肪細胞脂質(zhì)堆積引起的肥胖癥的藥物中的應用。本發(fā)明所述的短葉蘇木酚采用以下方法得到首先將藥材重量的515倍60%95%乙醇回流提取，提取次數(shù)一般為13次，每次13小時。將提取液在常壓或減壓，溫度在309CTC濃縮，回收乙醇。加甲醇溶解，用大孔樹脂AB-8拌樣，裝柱，然后分別用48倍柱體積的水和3090%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液部分。將收集的洗脫液在308(TC溫度下減壓濃縮，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取部分，常壓濃縮至干，再將其用甲醇溶解，上凝膠柱(S印hadexLH-20)，用甲醇洗脫，收集第一色譜條帶部分，減壓濃縮，干燥，得到短葉蘇木酚。將上述方法制得的短葉蘇木酚采用高效液相色譜法在波長276mn處進行測定，短葉蘇木酚(C顛)含量在8098%之間。在治療前脂肪細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化時胞內(nèi)甘油三酯聚集、前脂肪細胞分化末期胞內(nèi)3—磷酸甘油脫氫酶活性升高和脂肪細胞胞內(nèi)甘油三酯聚集時脂蛋白脂酶活性升高及其由此引起的疾病時，以短葉蘇木酚為活性成分，以常規(guī)的制劑工藝，單獨使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物。如散劑、丸劑、膠囊劑、片劑、微囊劑、軟膠囊劑、膜劑、栓劑、注射劑、膏劑、酊劑、散劑、沖劑、氣霧劑或各種外用制劑等。本發(fā)明的藥理實驗結(jié)果表明，短葉蘇木酚在其無毒劑量對脂肪細胞胞內(nèi)脂質(zhì)聚集有顯著的抑制作用，對脂肪細胞中脂蛋白酯酶(LPL)的表達有顯著的抑制作用，對前脂肪細胞誘導分化過程中關鍵酶3—磷酸甘油脫氫酶(GPDH)有明顯的抑制作用。圖1為短葉蘇木酚的化學結(jié)構式。圖2為脂肪細胞培養(yǎng)10天時胞內(nèi)脂滴的變化。圖中A為生理鹽水處理的脂肪細胞；B為短葉蘇木酚處理的脂肪細胞。具體實施方式下述的制備方法及藥效實驗資料使本發(fā)明所說的短葉蘇木酚的制備及其用途得以證實，同時又不應將下列實施例看作是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明所述的短葉蘇木酚釆用以下方法得到首先將藥材重量的515倍60%95%乙醇回流提取，提取次數(shù)一般為13次，每次13小時。將提取液在常壓或減壓，溫度在309(TC濃縮，回收乙醇。加甲醇溶解，用大孔樹脂AB-8拌樣，裝柱，然后分別用48倍柱體積的水和3090%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液部分。將收集的洗脫液在308(TC溫度下減壓濃縮，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取部分，常壓濃縮至干，再將其用甲醇溶解，上凝膠柱(S印hadexLH-20),用甲醇洗脫，收集第一色譜條帶部分，減壓濃縮，干燥，得到短葉蘇木酚。實施例1:取石榴葉0.5公斤用其重量6倍的80%乙醇回流提取1次，每次1小時。將提取液減壓，溫度45'C下濃縮，回收乙醇，干燥，稱重。加甲醇溶解，拌入大孔吸附樹脂(AB-8)裝柱，然后分別用4倍柱體積的水和4倍柱體積的90%乙醇洗脫，收集后一部分洗脫液。將收集的洗脫液在3(TC溫度下減壓濃縮，減壓干燥，得到短葉蘇木酚。采用高效液相色譜法進行測定，短葉蘇木酚純度為80%左右。實施例2:取蘇木0.5公斤用藥材重量的15倍80%乙醇回流提取2次，每次3小時。將提取液濃縮回收乙醇，加水，用乙酸乙酯萃取，取萃取液拌聚酰胺(60-80目)裝柱，用6倍柱體積的乙醇-水(50:50)洗脫，收集洗脫液。將收集的洗脫液在6(TC溫度下減壓濃縮，沉淀物常壓干燥，得到短葉蘇木酚。短葉蘇木酚采用高效液相色譜法進行測定，短葉蘇木酚純度為90%左右。實施例3:取蘇木0.5公斤用其重量10倍的95%乙醇回流提取，回流溫度8(TC，提取3次，每次1小時。將提取液在減壓，溫度在5(TC濃縮，回收乙醇，加水，用乙酸乙酯萃取，萃取物常壓濃縮，用甲醇溶解，上凝膠柱(S印hodexLH-20)，用甲醇洗脫，收集洗脫物得到短葉蘇木酚。采用高效液相色譜法進行測定，短葉蘇木酚純度為98%左右。在藥劑應用上就是將短葉蘇木酚單獨地或者加入復方中以常規(guī)的制劑工藝制備成藥劑。其藥劑可以是臨床上能夠使用的各種不同劑型。短葉蘇木酚測定，采用高效液相色譜法對其進行含量測定。1、試藥與儀器Waters高效液相色譜儀，515泵，996型二極管陣列紫外可見光檢測器。紫外可見光分光光度計(TU-誦PC)。1/100000分析天平。短葉蘇木酚(Bravifolin,C義分子量247)對照品清華大學藥物藥理研究室制備(批號040328)，高效液相色譜儀標定，純度98%。其余試劑均為分析純。(1)對照品溶液的制備精密稱取短葉蘇木酚適量，加甲醇制成0.176mg/ml的對照品液。(2)對照品最大吸收峰的確定取對照品液，在高效液相儀進行全波長光譜掃描，掃描范圍為200-600nra，掃描圖譜如附圖2所示。由圖中得知，短葉蘇木酚最大吸收波長為276mn。(3)色譜條件色譜柱HypersilODS，4.6X150mm,i.d.5pm中國科學院大連化學物理研究所)；預柱ODS柱，柱溫30士1。C，流動相乙腈-5mM磷酸二氫鉀溶液(pH2.5)(86:14,v/v);流速lml/min，檢測波長276nm。進樣量10|al。(4)以一定含量短葉蘇木酚對照品對應的峰面積來計算測試樣品中的短葉蘇木酚含量(一點法)。藥效實驗例1:體外對大鼠脂肪細胞胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的作用觀察本發(fā)明對脂肪細胞胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的抑制作用。本發(fā)明所用短葉蘇木酚，批號041211。用時以生理鹽水配制成所需濃度。本發(fā)明所用培養(yǎng)的成熟大鼠白色脂肪細胞來自Wistar雄性成年大鼠，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。本發(fā)明所用試劑DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(杭州江濱生物技術有限公司〉，胰島素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)，地塞米松，TritonX—100(北京化學試劑公司)，甘油三酯試劑盒(北京中生生化試劑公司)。儀器MicroplateReader(Bio—Rad，Model550)，C02Incubator(Sanyo，MCO一15AC)，潔凈工作臺(北京半導體設備l廠)。本發(fā)明所涉及實驗方法如下大鼠前脂肪細胞用誘導培養(yǎng)基(含有10。/。胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，含有0.5U/ml胰島素和10^M地塞米松)培養(yǎng)培養(yǎng)3天后，加入不同濃度的短葉蘇木酚，陽性對照采用異丙腎上腺素lpg/ml，空白對照加入同體積的藥物溶解液。細胞與藥物共培養(yǎng)10d，隔日換培養(yǎng)液，每日加入藥物一次。細胞用KrebsRinger緩沖液沖洗2次，加入2%TritonX-100溶液破細胞膜，5分鐘后加入甘油三酯試劑盒工作液，37'C保溫10分鐘，然后在波長492nm測定吸收度，655nm作為參比波長。每組設四個平行。結(jié)果以OD值表示。本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件處理，F(xiàn)檢驗。實驗數(shù)據(jù)如圖2和表1:圖2是脂肪細胞培養(yǎng)10天時胞內(nèi)脂滴的變化，A:正常脂肪細胞，細胞內(nèi)完全被脂滴充斥，脂滴體積很大；B:短葉蘇木酚(25ng/ml)處理組細胞體積明顯減小，胞內(nèi)脂滴量明顯較少，同時脂滴的體積明顯縮小，具有明顯的逆分化趨勢。Olympus倒置顯微鏡拍攝，放大10X20倍。表1:短葉蘇木酚對脂肪細胞胞內(nèi)甘油三酯聚集的影響(S±S)，n=4分組終濃度mg/mlOD492nm空白對照組0.312±0.046異丙腎上腺素0.0010.137±0.004**短葉蘇木酚0.010.244±0.0263*短葉蘇木酚0.0050.228±0.0153*短葉蘇木酚_0.0025_0.212±0.0190*—%空白對照組相比，*p<0.05,**p<0.01。本實驗結(jié)果顯示短葉蘇木酚在其無毒劑量對脂肪細胞胞內(nèi)脂質(zhì)聚集有顯著的抑制作用，但是抑制活性和劑量沒有相關性，各劑量組之間沒有顯著性差異。藥效實驗例2:藥物對誘導分化的前脂肪細胞LPL活性的影響本發(fā)明所做實驗的目的及實驗原理脂蛋白酯酶(lipoproteinlipase,LPL)是脂肪細胞代謝脂質(zhì)過程中的關鍵酶,脂肪細胞攝取血液中甘油三脂首先是通過脂肪細胞膜上的LPL將血液中的CM,LDL和VLDL中攜帶的甘油三脂分解成為甘油和甘油二脂或單脂酰甘油,通過細胞膜進入脂肪細胞胞漿內(nèi),再通過特定的酶合成甘油三脂儲存在胞內(nèi)。本實驗研究藥物對細胞中LPL表達的影響，研究藥物對脂肪細胞攝取脂質(zhì)和藥物對脂肪細胞分化過程的影響。LPL在體外可以分解脂肪乳中的甘油三脂，使脂肪乳滴的體積和數(shù)量減少，脂肪乳液的濁度下降，在一定時間內(nèi)，濁度的下降程度可以間接反映出LPL活力的大小。因為比濁法試驗操作簡單，所需試劑少，可以使用96孔板在酶標儀上迸行試驗，所以本實驗采用比濁法測定藥物對LPL活性的直接作用和藥物對脂肪細胞分化過程中LPL轉(zhuǎn)錄翻譯的影響。本發(fā)明所用試劑肝素鈉注射劑，DMEM高糖培養(yǎng)基(Giblo),胎牛血清(杭州江濱生物技術有限公司'20030505)，NaCl,KC1,KH2P04,Na2HP04，NaHC03,Tris，HEPES均為分析純試劑。脂肪乳注射劑購自廣州綠十字藥業(yè)有限公司(12B0076SI-2)，反應緩沖液，pH8.3的O.lMTris-HCl緩沖液，藥物的配制TPM-16，SY1,SY2用含DMSO0.5%以下的PBS溶解，對酶活性的直接作用，藥物用含0.5%DMSO的反應緩沖液溶解。KrebesRinger磷酸鹽緩沖液，pH=7.4;細胞LPL釋放液含肝素鈉lU/ml的KrebesRinger磷酸鹽緩沖液；誘導培養(yǎng)基dmem高糖培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，0.5U/ml胰島素和1()Jm地塞米松。本發(fā)明所用儀器MicroplateReader(Bio—Rad，Model550)，C02Incubator(MCO—15AC)，潔凈工作臺(北京半導體設備一廠)本發(fā)明所涉及的實驗方法如下-1)培養(yǎng)前脂肪細胞，用誘導培養(yǎng)基誘導分化，同時加入不同濃度的藥物，細胞與藥物共培養(yǎng)10天，細胞隔日更換培養(yǎng)基并補充加入藥物。2)細胞用KrebsRinger緩沖液沖洗2次后加入LPL釋放液，37°C,C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘，不時振蕩。3)取出上清液，一部分用Bradford法測蛋白含量，另一部分加入預冷的脂肪乳溶液，內(nèi)含lMNaCl，405nm處用酶標儀記錄0分鐘和10分鐘的OD值，溶液中LPL活性用OD5—OD15表示。本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件處理，F(xiàn)檢驗。實驗數(shù)據(jù)如表2:表2:短葉蘇木酚對細胞中LPL活性的作用(X土s).n=4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與脂肪細胞組相比，*p<0.05;**p<0.01。^本實驗結(jié)果顯示短葉蘇木酚對前脂肪細胞分化中LPL表達有顯著的抑制作用。對胰島素誘導的前脂肪細胞向脂肪細胞分化有較強的抑制作用。藥效實驗例3:藥物對前脂肪細胞誘導分化過程中關鍵酶GPDH活性的影響本發(fā)明所涉及的實驗原理脂肪細胞中脂肪的合成原料是3—磷酸甘油和脂肪酸。3—磷酸甘油可以通過甘油激酶催化消化吸收的甘油獲得，這主要在肝臟和腎臟中進行，但是脂肪細胞中缺乏甘油激酶，不能將甘油直接催化成3-磷酸甘油，所以利于GPDH(3—磷酸甘油脫氫酶)還原糖代謝中間產(chǎn)物磷酸二羥丙酮生成3—磷酸甘油，其中由NADH提供氫離子，以供合成甘油三酯。大鼠皮下前脂肪細胞在胰島素和地塞米松等誘導條件下，發(fā)生分化，伴隨有胞內(nèi)一系列的基因和蛋白的表達的改變。其中作為終末表達信號的GPDH是細胞發(fā)生分化的標志性酶，其表達量增多是胞內(nèi)進行脂質(zhì)合成的信號。GPDH在前脂肪細胞分化末期大量表達，是脂肪細胞分化的標志酶。如果藥物可以抑制脂肪細胞的分化，胞內(nèi)GPDH含量將不會升高。本發(fā)明所用試劑考馬斯亮藍G250(sigma)，NADH2Na(sigma)，DHAP(DihydroxyacetonePhosphateDilithiumSalt,sigma)，Tris，EDTA，P-巰基乙醇，牛血清白蛋白，三乙醇胺，所有試劑均為分析純。破膜液包括20mMTris，lmMEDTA，lmM]3-巰基乙醇，pH為7.3;酶反應液100mM三乙醇胺，2.5mMEDTA,0.1mMP-巰基乙醇，334uMNADH2Na，調(diào)pH為7.7;DHAP(磷酸二羥丙酮)用蒸餾水配成4mM溶液；牛血清白蛋白用生理鹽水配成不同濃度的標準溶液。本發(fā)明所使用的實驗儀器Micr叩lateReader(Bio-Rad，Model550)，C02Incubator(MCO—15AC)，潔凈工作臺(北京半導體設備l廠)本發(fā)明所涉及的實驗步驟.-1)組織塊培養(yǎng)法獲得的前脂肪細胞，以10S個/ml接種于96孔板，加入誘導劑胰島素0.5U/ml，同時加入不同濃度的藥物。藥物用DMSO助溶，最大DMSO濃度為0.1%，空白對照也加入0.1XDMSO。細胞隔日換液，共培養(yǎng)10天。隔日補充加入不同濃度的藥物。2)細胞用PBS清洗2次后加入110ul/孔破膜液，一20'C冰箱中反復凍融2次。3)檢測時，總反應體系包括100ul細胞破膜液，300ul酶反應液，最后加入10ulDHAP啟動反應。用半自動生化儀在340nm記錄每分鐘吸光度的變化。酶反應溫度為37'C。4)取5ul細胞破膜液，用Bradford法測蛋白含量。蛋白用ug/ml表示5)結(jié)果計算GPDH活力單位1U^lnMNADH變化/min;GPDH比活-GPDH活力/ug蛋白。因為所用樣品在測量時方法一致，本試驗結(jié)果表示方法簡化為GPDH比活=AOD(min)/OD蛋白本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件處理，F(xiàn)檢驗。實驗數(shù)據(jù)如下1)Bradford法測蛋白含量中標準蛋白曲線用不同濃度的牛血清白蛋白標準溶液測定考馬斯亮藍標準曲線為y=U962x+0.0228(r2=0.9998,n=3),其中y表示溶液在655nm處吸光度，x表示蛋白含量，以ug表示，線性范圍為0.1lug。2)藥物對脂肪細胞分化過程中GPDH活性的作用如表3:表3:不同濃度的短葉蘇木酚對GPDH活性的影響(X土S)，n二4藥物名稱藥物濃度(mg/ml)GPDH比活脂肪細胞0.421±0.028短葉蘇木酚0.0050.303±0.022**短葉蘇木酚0.0020.2681±0.056*短葉蘇木酚0細0.4082±0.165與脂肪細胞組相比，*p<0.05,**pO.01.本發(fā)明所顯示的結(jié)果表明短葉蘇木酚在濃度為0.0050.002mg/ml顯示了顯著的抑制活性，抑制率最大達到30%左右[(0.421-0.2681)/0.421><100%]。本發(fā)明所涉及的藥物是前月l肪細胞分化的有效的抑制劑。權利要求1.短葉蘇木酚在制備預防和治療前脂肪細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化時胞內(nèi)甘油三酯聚集所引起疾病的藥物中的應用。2.短葉蘇木酚在制備預防和治療前脂肪細胞分化末期胞內(nèi)3—磷酸甘油脫氫酶活性升高所引起疾病的藥物中的應用。3.短葉蘇木酚在制備治療脂肪細胞胞內(nèi)甘油三酯聚集時脂蛋白脂酶活性升高所引起疾病的藥物中的應用。4.短葉蘇木酚在制備預防和治療體內(nèi)前脂肪細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化所引起的肥胖癥的藥物中的應用。5.短葉蘇木酚在制備治療體內(nèi)脂肪細胞脂質(zhì)堆積引起的肥胖癥的藥物中的應用。全文摘要短葉蘇木酚的新用途，涉及一種以石榴葉為原料制備的短葉蘇木酚在醫(yī)藥方面的新用途。具體地說，短葉蘇木酚在制備預防和治療體內(nèi)前脂肪細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化和由此引起的疾病的藥物中的應用。經(jīng)實驗研究表明，短葉蘇木酚具有抑制前脂肪細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化時胞內(nèi)甘油三酯聚集、抑制前脂肪細胞分化末期胞內(nèi)3-磷酸甘油脫氫酶活性升高、抑制脂肪細胞胞內(nèi)甘油三酯聚集時脂蛋白脂酶活性升高的作用，因此可用于預防和治療肥胖癥。在治療上述疾病時，以短葉蘇木酚為活性成分，單獨使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物。文檔編號A61K31/352GK101278930SQ20071006519公開日2008年10月8日申請日期2007年4月6日優(yōu)先權日2007年4月6日發(fā)明者張曉娜,杜力軍,晗林,偉王,慧蘇,邢東明,帆雷申請人:清華大學