紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法
【專利摘要】紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法：⑴.含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建；將人皮膚成纖維細(xì)胞重懸于膠原蛋白溶液滴加至細(xì)胞培養(yǎng)孔板培養(yǎng)；細(xì)胞完全展開滴加人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液至膠原凝膠表面繼續(xù)培養(yǎng)；凝膠表面人角質(zhì)形成細(xì)胞完全鋪滿時(shí)進(jìn)行氣液面培養(yǎng)；角質(zhì)層分化至5-8層停止培養(yǎng)；⑵.紅色毛癬菌的人工感染；⑶.角蛋白酶活性的測(cè)定。本發(fā)明構(gòu)建的人工皮膚成為角蛋白酶產(chǎn)生的天然誘導(dǎo)劑；具有以下優(yōu)點(diǎn)：一、人工皮膚含有真皮層、表皮層及5-8層的角質(zhì)層，結(jié)構(gòu)和功能更接近人體皮膚；二、表皮層角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的角蛋白作為天然底物誘導(dǎo)角蛋白酶的產(chǎn)生；三、由天然底物角蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的角蛋白酶，其活性測(cè)定更準(zhǔn)確、更真實(shí)、更穩(wěn)定。
【專利說明】 紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法，屬于真菌微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]皮膚癬菌是指能入侵角質(zhì)層和角質(zhì)組織，引起人和動(dòng)物皮膚、毛發(fā)和甲感染的真菌。目前發(fā)現(xiàn)大約有40余種皮膚癬菌，其中的30余種有致病性。常引起感染的皮膚癬菌主要有紅色毛癬菌，須癬毛癬菌，犬小孢子菌，石膏小孢子菌和絮狀表皮癬菌。紅色毛癬菌是引起皮膚癬菌病最常見的致病菌，據(jù)統(tǒng)計(jì)可導(dǎo)致皮膚癬菌病90%的慢性難治性感染。
[0003]與其他感染性疾病相同，皮膚癬菌病的發(fā)病是真菌毒力因子與宿主屏障結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)果。通常認(rèn)為與角蛋白降解有關(guān)的酶是皮膚癬菌病致病菌的重要毒力因子。
[0004]但是，角蛋白酶的產(chǎn)生需要底物的誘導(dǎo)，現(xiàn)有研究及相關(guān)的技術(shù)體系需要采用特殊培養(yǎng)基，如沙堡培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基、含皮屑培養(yǎng)基、含甲培養(yǎng)基等誘導(dǎo)角蛋白酶的產(chǎn)生。臨床上紅色毛癬菌感染人體時(shí)并不存在上述誘導(dǎo)物，以誘導(dǎo)產(chǎn)生的方式研究紅色毛癬菌重要的毒力因子角蛋白酶致病機(jī)理可能存在嚴(yán)重偏差。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法。該方法是為了模擬人體皮膚的組織結(jié)構(gòu)與基本功能且反映紅色毛廯菌臨床上粘附、感染并致病的大體過程，從而構(gòu)建了含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，該人工皮膚含有分化良好的角質(zhì)層，成為角蛋白酶產(chǎn)生的天然誘導(dǎo)劑。為今后揭示紅色毛廯菌導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病的機(jī)理提供更真實(shí)、更準(zhǔn)確的方法。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟:(1).含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建；⑵.紅色毛癬菌的人工感染；⑶.角蛋白酶活性的測(cè)定。
[0007]以上所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法，具體操作步驟是:
(1).含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建:
a.無菌操作條件下，將人皮膚成纖維細(xì)胞重懸于膠原蛋白溶液，滴加至細(xì)胞培養(yǎng)孔板，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
b.顯微鏡下觀察到細(xì)胞完全展開，滴加人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液至膠原凝膠表面，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
c.顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質(zhì)形成細(xì)胞完全鋪滿時(shí)，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)；
d.之后每天進(jìn)行冷凍切片HE染色，當(dāng)角質(zhì)層分化至5-8層時(shí)，停止培養(yǎng)；即得含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚；
⑵.紅色毛癬菌的人工感染:將培養(yǎng)的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調(diào)整為I個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?16個(gè)孢子/ml)，滴加5μ I至步驟⑴制備的含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，繼續(xù)培養(yǎng)48h ；HE染色驗(yàn)證紅色毛癬菌是否成功感染人工皮膚；
(3).角蛋白酶活性的測(cè)定:收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養(yǎng)液，以天青角蛋白為底物，按照試劑盒說明書操作測(cè)定角蛋白酶的活性。
[0008]為了模擬人體皮膚的組織結(jié)構(gòu)與基本功能且反映紅色毛廯菌臨床上粘附、感染并致病的大體過程，本發(fā)明構(gòu)建了含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，該人工皮膚含有分化良好的角質(zhì)層，成為角蛋白酶產(chǎn)生的天然誘導(dǎo)劑。
[0009]本發(fā)明的核心創(chuàng)新在于:創(chuàng)造性的引入人體角蛋白作為角蛋白酶的誘導(dǎo)底物，而角蛋白哪里來的呢？是通過我們構(gòu)建人工皮膚時(shí)自然產(chǎn)生的。這一核心創(chuàng)新點(diǎn)，與目前所有研究均不同，以前的研究集中在動(dòng)物模型或者是用培養(yǎng)基誘導(dǎo)角蛋白酶的產(chǎn)生。
[0010]本發(fā)明的核心是模擬一種更準(zhǔn)確、更真實(shí)模擬紅色毛廯菌感染人體皮膚的過程，即用來自人體細(xì)胞且與人體皮膚有同樣結(jié)構(gòu)的角蛋白作為角蛋白酶的誘導(dǎo)底物。
[0011]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):一、人工皮膚含有真皮層、表皮層，特別是5-8層的角質(zhì)層，在結(jié)構(gòu)和功能上更接近人體皮膚；二、表皮層角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的角蛋白作為天然底物誘導(dǎo)角蛋白酶的產(chǎn)生；三、由天然底物角蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的角蛋白酶，其活性的測(cè)定更準(zhǔn)確、更真實(shí)、更穩(wěn)定。例如，在實(shí)施例中，A595 nm較陰性對(duì)照每改變0.01相當(dāng)于IU角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13 U。

【具體實(shí)施方式】
[0012]為進(jìn)一步說明本發(fā)明，結(jié)合一下實(shí)施例具體闡述。
[0013]實(shí)施例1:
無菌操作條件下，將16個(gè)人皮膚成纖維細(xì)胞重懸于2ml膠原蛋白溶液，滴加至細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，放置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3d后顯微鏡下觀察到細(xì)胞完全展開，滴加16個(gè)人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液至膠原凝膠表面，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5d后顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質(zhì)形成細(xì)胞完全鋪滿時(shí)，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)。之后每天進(jìn)行冷凍切片HE染色，1d后角質(zhì)層分化至5-8層時(shí)，停止培養(yǎng)。即得含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚(見圖1)。
[0014]實(shí)施例2:
將培養(yǎng)的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調(diào)整為I個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?16個(gè)孢子/ml)，滴加5μ I至步驟⑴制備的含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，繼續(xù)培養(yǎng)48h。HE染色驗(yàn)證紅色毛癬菌成功感染人工皮膚(見圖2)。
[0015]實(shí)施例3:
收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養(yǎng)液約4ml，4000 rpm 15 min，吸出上清液3 ml轉(zhuǎn)移入2 ml含5 mg的keratin-azure的緩沖液,將其放入30°C 200 rpm搖床孵育。用3ml無菌水代替上清液作為陰性對(duì)照。72小時(shí)后，將反應(yīng)上清液置于冰板上，吸取上清液lml，4°C 12000 rpm離心5min。將上清液吸取至96孔板，每孔200 μ 1，重復(fù)3孔，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定Α595 nm的OD值，以無菌水含等量keratin-azure的空白液為陰性對(duì)照。A595 nm較陰性對(duì)照每改變0.01相當(dāng)于IU角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13U。
【權(quán)利要求】
1.一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟:α).含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建；⑵.紅色毛癬菌的人工感染；(3).角蛋白酶活性的測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，具體操作步驟如下: (1).含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建: a.無菌操作條件下，將人皮膚成纖維細(xì)胞重懸于膠原蛋白溶液，滴加至細(xì)胞培養(yǎng)孔板，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)； b.顯微鏡下觀察到細(xì)胞完全展開，滴加人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液至膠原凝膠表面，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)； c.顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質(zhì)形成細(xì)胞完全鋪滿時(shí)，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)； d.每天進(jìn)行冷凍切片HE染色，當(dāng)角質(zhì)層分化至5-8層時(shí)，停止培養(yǎng)；即得含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚； (2).紅色毛癬菌的人工感染:將培養(yǎng)的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調(diào)整為I個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?，滴? μ I至步驟⑴制備的含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，繼續(xù)培養(yǎng)48h ；HE染色驗(yàn)證紅色毛癬菌是否成功感染人工皮膚； (3).角蛋白酶活性的測(cè)定:收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養(yǎng)液，以天青角蛋白為底物，按照試劑盒說明書操作測(cè)定角蛋白酶的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，各步驟的具體操作方法是: ⑴.含表皮、真皮結(jié)構(gòu)人工皮膚的構(gòu)建:a.無菌操作條件下，將16個(gè)人皮膚成纖維細(xì)胞重懸于2ml膠原蛋白溶液，滴加至細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，放置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；b.3d后顯微鏡下觀察到細(xì)胞完全展開，滴加16個(gè)人角質(zhì)形成細(xì)胞懸液至膠原凝膠表面，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；c.5d后顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質(zhì)形成細(xì)胞完全鋪滿時(shí)，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)；d.之后每天進(jìn)行冷凍切片HE染色，1d后角質(zhì)層分化至5-8層時(shí)，停止培養(yǎng)；即得含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚； ⑵.紅色毛癬菌的人工感染:將培養(yǎng)的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調(diào)整為I個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?，滴? μ I至步驟⑴制備的含表皮、真皮結(jié)構(gòu)的人工皮膚，繼續(xù)培養(yǎng)48h ；HE染色驗(yàn)證紅色毛癬菌成功感染人工皮膚； (3).角蛋白酶活性的測(cè)定:收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養(yǎng)液約4ml，4000 rpm 15 min,吸出上清液3 ml轉(zhuǎn)移入2 ml含5 mg的keratin-azure的緩沖液,將其放入30°C 200 rpm搖床孵育；用3ml無菌水代替上清液作為陰性對(duì)照；72小時(shí)后，將反應(yīng)上清液置于冰板上，吸取上清液lml，4°C 12000 rpm離心5min ;將上清液吸取至96孔板，每孔200μ 1，重復(fù)3孔，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定Α595 nm的OD值，以無菌水含等量keratin-azure的空白液為陰性對(duì)照；A595 nm較陰性對(duì)照每改變0.01相當(dāng)于IU角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13 U。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測(cè)定方法，其特征在于，步驟⑴的子步驟a中，是將滴加有人皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)孔板，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK104357542SQ201410657738
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】劉維達(dá), 馬鵬程, 曹玉萍, 沈永年 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所