專利名稱：利用合成基因在酵母菌中生產草魚生長激素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及養(yǎng)魚業(yè)，特別涉及利用酵母菌大量生產淡水魚生長激素和將其用于魚類養(yǎng)殖的方法。
淡水養(yǎng)殖在我國水產業(yè)中占有重要位置。以配合飼料進行集約化養(yǎng)殖代替自然放養(yǎng)已獲得明顯的經濟效益，并已成為水產養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢。為提高養(yǎng)殖魚類的生長速度和產量，高蛋白含量的魚粉、動物血粉、植物蛋白等已廣泛用于配合飼料生產，而類固醇類激素也已用于飼料添加劑以促進魚類生長(美國專利#4,210,634,1980)。但由于類固醇類激素在魚代謝中不易被降解，可能在被食用后引入人體，因而引起人們憂慮。
多肽生長激素具有調節(jié)和促進生長的作用，是脊椎動物(包括魚類)體內固有的成分，并可在動物體內自動降解而不影響人類食用。多種有經濟價值的海魚生長激素基因已被克隆，我們克隆了生長最快的淡水養(yǎng)殖魚草魚的生長激素基因(Zhu et al,1992.Eur.J.Biochem.206.643-648)。已有報道，用含有虹鱒生長激素的酵母飼喂幼魚后，幼魚生長加快，無論體重和體長都大于對照魚(Tsai et al,1994.The Prgressive Fish-culturist,56,7-12)。我們的初步研究發(fā)現(xiàn)，用草魚生長激素直接浸泡魚苗，亦可促進其生長。但至今尚未有用酵母生產淡水魚類生長激素和將其用于魚類養(yǎng)殖的報道和專利。
南韓Lucky Ltd公司Cho等人的專利(美國的專利#5,270,180,1993)敘述了用合成基因在酵母中生產鮭魚生長激素，鮭魚生長激素含量可達50mg/l培養(yǎng)物，(OD550=15)，比相應DNA重組基因在酵母中的表達水平明顯提高。但由于鮭魚生長激素分子與淡水魚的差異較大，影響在淡水魚養(yǎng)殖上的應用。
本發(fā)明的目的是合成草魚生長激素基因，并在酵母菌中高效表達，大量生產草魚生長激素，以用于淡水漁業(yè)和提高其生產效益。
技術方案根據天然草魚生長激素多肽的氨基酸順序，設計適合在酵母菌表達的該基因的DNA編碼順序。為此，首先合成一系列的寡聚脫氧核糖核酸，采用多聚酶鏈式反應(PCR)技術進行草魚生長激素基因人工合成。在此基礎上，將此基因克隆在酵母基因表達系統(tǒng)，使之與酵母染色質DAN整合，并篩選高基因拷貝和高表達的酵母株。提取其總蛋白，經聚丙烯酰胺凝膠電泳和染色掃描后，分析草魚生長激素占酵母細胞總蛋白的量。經氨基酸順序分析，測酵母菌株生產的草魚生長激素多肽與天然多肽的一致性。經多代培養(yǎng)鑒定，測該基因表達水平的穩(wěn)定性。
有益效果1、草魚生長激素基因表達產物占酵母菌總蛋白的12％，其中50-60為水溶性蛋白；2、酵母菌生產的草魚生長激素多肽與天然多肽相同；3、經50代培養(yǎng)鑒定，該基因表達水平持續(xù)穩(wěn)定；4、將含有合成草魚生長激素的酵母作魚飼料添加劑喂幼魚，或用其它方法處理魚苗，能促進其生長，提高水產養(yǎng)殖效益。
附

圖1根據天然草魚生長激素基因氨基酸順序，合成16個寡聚脫氧核糖核酸；附圖216個寡聚脫氧核糖核酸在合成基因中的位置及兩端的EcoRl酶切位點；附圖3合成的草魚生長激素基因DNA順序及相應氨基酸順序；附圖4用于在酵母表達的草魚生長激素基因重組質粒pGGH。PGAP為Glyceroldehyde-3-phosphate dehydrogenase基因啟動子，GH為草魚生長激素合成基因；附圖5草魚生長激素合成基因表達產物的SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳?！?”和“4”為蛋白分子量，“2”為未克隆基因的載體質粒轉化酵母的蛋白提取物，“3”為合成基因重組質粒轉化酵母的蛋白提取物，箭頭標示生長激素區(qū)帶。
方法與步驟1、根據天然草魚生長激素合成的16個寡聚脫氧核糖核酸的順序見圖1。其中8個為正向順序，另8個為“搭橋”反向順序，該基因5’端和3’端分別附有EcoR1酶切位點，見圖2。
2、進行PCR反應的100μ1溶液中含上述16個寡聚脫氧核糖核酸各5μmol,dATP,dCTP,dGTP和dTTPg各0.5μmol,Tris-HCl(pH9.3)25μmol,KCl50μmol,MgCl22μmol,β-巰基乙醇1μmol,Taq DNA聚合酶2.5單位。PCR反應在Perkin-Elmer2400型反應器進行，反應為30周期，每周期程序是95℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，74℃1分鐘。PCR產物克隆在pGEM-T載體上，并測定合成基因的DNA順序，見圖3。
3、合成生長激素基因DNA經EcoR1消化后，與預先經EcoR1消化的表達載體pGAPZA(Invitrogen Inc.)DNA連接(14℃16h)。連接后的DNA轉化大腸桿菌，并大量制備重組基因pGGH DNA，見圖4。
4、用Invitrogen Inc.Ⅱ型電脈沖儀將pGGH DNA導入酵母宿主細胞，用含Zeocin的YPD培養(yǎng)基篩選，獲得高拷貝轉化株。YPD培養(yǎng)基組成為1％酵母提取物，2％水解干酪素，2％D-葡萄糖。Zeocin為Invitrogen Inc.產品，篩選使用濃度為100、500、1000、2000和3000μg/ml。
5、含拷貝pGGH基因酵母轉化株經Southerm blot,Northerm blot鑒定后，在YD培養(yǎng)基(1％酵母提取物，0.5％D-葡萄糖)、30℃震蕩培養(yǎng)，并于24、48、72和96小時取樣檢查草魚生長激素表達產物的產量。
6、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白質區(qū)帶轉移技術，以兔抗草魚生長激素IgG鑒定表達產物。結果表明，草魚生長激素基因表達產物占酵母菌總蛋白的12％左右，其中50-60-為水溶性蛋白，見圖5。
權利要求
1.一種利用合成基因在酵母菌中生產草魚生長激素的方法，其特征是A、16個寡聚脫氧核糖核酸的順序，其中8個為正向順序，另8個為“搭橋”反向順序，該基因5’端和3’端分別附有EcoR1酶切位點；B、人工合成的草魚生長激素基因克隆在表達載體pGAPZA中，構成重組質粒pGGH DNA；C、用電脈沖方法將pGGH DNA導入酵母宿主細胞并使之與染色質整合；D、篩選高拷貝整合和高表達的酵母菌轉化株。
全文摘要
根據天然草魚生長激素多肽的氨基酸順序,設計了適合其在酵母表達的DNA編碼順序,采用PCR技術完成了草魚生長激素基因人工合成。在此基礎上,將此基因克隆在酵母基因表達系統(tǒng),使之與酵母染色質DNA整合,并篩選高基因拷貝和高表達的酵母株。該菌株表達的草魚生長激素占酵母細胞總蛋白的12%,經氨基酸順序分析表明酵母所生產的草魚生長激素多肽與天然多肽相同,該基因表達水平持續(xù)穩(wěn)定,可應用于漁業(yè)和提高水產養(yǎng)殖效益。
文檔編號C12N15/81GK1216320SQ9710929
公開日1999年5月12日 申請日期1997年11月5日 優(yōu)先權日1997年11月5日
發(fā)明者朱作言, 吳石君, 汪亞平, 劉漢勤 申請人:中國科學院水生生物研究所, 吳石君