專利名稱：：一種耳聾易感基因篩查試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于基因檢測
技術領域：
，特別涉及一種對耳聾易感基因進行篩査的試劑盒。
背景技術：
：人體疾病的控制與預防，關鍵是預知疾病，即知道疾病發(fā)病傾向，然后才能進行針對性的保健。目前疾病的檢查分5個等級組織器官水平、臨床前、細胞水平、蛋白質(zhì)水平、基因水平(分子水平)，由此看出，基因檢測是最早的預警，也是最精確最高水平的診斷?；驒z測是通過對受檢者基因編碼序列的測定和定位分析，精確定格相關器官的生理健康狀態(tài)，探知現(xiàn)在，預示未來。國際標準化操作，結果可隨時與國際接軌。它能使每個受檢者有意識、有針對性地捍衛(wèi)現(xiàn)時健康，調(diào)節(jié)與控制易患疾病因素的"適時"表達。人類目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的單基因遺傳疾病有6000多種，抽取羊水細胞，甚至從母體血中都可獲得胎兒細胞。檢査這些細胞的該基因是否有缺陷，就能確定胎兒是否從親體獲得遺傳性疾病，如是，則可立即終止妊娠。當前更先進的方法是進行體外受精，然后取早期胚胎細胞進行基因檢査，選取正常的早期胚胎植入母體妊娠。通過對病原體DNA的檢查，可以使傳染病的檢出率、檢出速度大大提高。例如對結核桿菌感染的診斷，以前要靠痰、糞便或血液培養(yǎng)，耗時兩周以上，現(xiàn)在用基因診斷的方法，不僅敏感性大大提高，而且在l小時內(nèi)就能得出結果。基因檢査對非感染性疾病的診斷也有幫助。目前基因診斷已擴大到疾病易感性基因的檢查。有些基因改變本身并不致病，但這些基因改變的個體易受某些環(huán)境因素的作用而得某種疾病，例如現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)染色體上的BCR1基因發(fā)生突變的女性易患乳腺癌，據(jù)此可篩選出乳腺癌易感人群，加強預防?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)糖尿病、骨質(zhì)疏松、高血壓、白血病等多種疾病的易感基因。在各種疾病易感基因中，聾病易感基因已受到越來越多的關注。根據(jù)國家衛(wèi)生部和中國殘聯(lián)的統(tǒng)計資料，我國目前有1.2億人存在聽力障礙，其中聽力4語言殘疾者達2780萬人，并以每年3萬聾兒的速度在增長，其中一半以上患者的病因與遺傳因素有關。發(fā)達國家的臨床研究數(shù)據(jù)表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80%，因此近十幾年來，遺傳性耳聾的發(fā)病機制及其分子流行病學的研究成為了聾病研究最重要的內(nèi)容之一。隨著人類基因組計劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進步，聾病的分子遺傳學研究和分子流行病學的數(shù)據(jù)使研究者們逐步認識到聾病易感基因突變在維護聽力健康和發(fā)現(xiàn)聽力異常中的重要性。在目前已經(jīng)定位和克隆的耳聾相關基因中，GJB2是最常見的易感基因，在先天性重度耳聾患者中約占30-50%。目前，在該基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了IOO多種突變類型，然而，不同種族GJB2基因常見的突變形式不同。在中國常見的突變形式為235delC，其在所有致病性突變中約占74.14%，約22.2%的中國耳聾患者與該突變有關。該基因突變者多數(shù)表現(xiàn)為先天性重度耳聾，然而相當一部分GJB2基因突變者在出生時其聽力并無異常，在聽力篩査中被判定為"通過"，使得此型耳聾的發(fā)現(xiàn)被延遲。因此，在新生兒期對GJB2基因突變進行篩査是早期發(fā)現(xiàn)潛在耳聾危機、早期預警和早期干預的重要策略。藥物的耳毒性是導致語前聽力損失的一個重要因素，部分與線粒體12SrRNA基因1555A—G突變有關，該突變可以增加耳蝸對氨基糖甙類藥物的敏感性。在美國，耳毒性藥物相關的聽力損失患者中，10%的具有12SrRNA基因1555A—G突變，美國語前聽力損失患者中，1555A—G突變患者的發(fā)病率約為1/20000-1/40000。在西班牙，12SrRNA基因1555A—G突變與15-20%的家族性非綜合征型聽力損失有關，許多年老的家族成員即使沒有使用氨基糖甙類藥物也可發(fā)生因此突變導致的聽力下降。而在中國，藥物性耳聾的發(fā)病率超出了原有的想象，在一系列的文章報道中，發(fā)現(xiàn)在門診散發(fā)的耳聾患者中的檢測發(fā)現(xiàn)約5%的患者是由于12SrRNA基因1555A—G突變導致的，而在聾啞學校這樣一個特殊群體，則高達12%的患者是由于12SrRNA基因1555A—G突變接觸氨基糖甙類藥物而致聾。同時在中國群體中還發(fā)現(xiàn)了12SrRNA基因1494C—T突變與藥物性耳聾的關系，目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三個大的家系是由于1494C—T突變導致的。1555A—G突變和1494C—T突變者在出生時往往聽力正常，很難通過聽力篩査而被提前發(fā)現(xiàn)和預測，卻存在因耳毒性藥物的使用而發(fā)生聽力損失的隱患。針對線粒體12SrRNA基因1555A—G突變和51494C—T突變的基因檢測可以揭示母系遺傳的特征，并可以進行有效的預警。對Pendred綜合征病人的研究表明，在SLC26A4基因檢測時常帶有兩個突變位點，而61%的單純前庭水管擴大患者僅帶有單個突變，這一點提示在1.7%的SLC26A4基因突變攜帶者中，超過30%的人都可能具有發(fā)病的危險。同時也表明，在這些單純前庭水管擴大患者中，可能存在其他基因的突變與SLC26A4基因的單個突變相互作用。最近的研究顯示，在810名感音神經(jīng)性耳聾的患兒中，20.8%的患兒表現(xiàn)為前庭水管擴大并感音神經(jīng)性聾，理論上講，這些患兒出生后即有癥狀，然而這些癥狀發(fā)現(xiàn)的平均年齡卻為5.8歲?？梢酝茰y，他們之中約7%的患兒表現(xiàn)為語前聽力損失，若當時進行早期基因檢測和干預的話這些患兒會大大受益。趙亞麗等對中國西北地區(qū)101個大前庭水管綜合征的家庭中107名患者和159名重度感音神經(jīng)性耳聾患者進行了系統(tǒng)的研究，初步繪制了前庭水管擴大相關基因SLC26A4在中國人群的突變圖譜，發(fā)現(xiàn)了存在于中國人群突變熱點區(qū)域為內(nèi)含子7的3'端的IVS7-2A>G。SLC26A4與大前庭導水管綜合征密切相關，基因診斷可以對疾病進行早期的預防和預警，有利于明確病因并可以盡可能地防止聽力進行性下降。這些進展為臨床疾病的診斷提供了更為全面的手段，為病人提供了更為有效的咨詢。通過上述三個易感基因與遺傳性耳聾的關系，結合當前施行的聾病治療策略與技術，我們可以設計一套遺傳性耳聾綜合防治的方案1、如果患兒基因診斷結果提示先天性耳聾是由于GJB2基因突變導致的，那么該患兒的耳神經(jīng)傳導通路以及聽覺語言中樞應該是正常的，因此在患兒早期即可進行人工耳蝸移植，使患兒獲得良好的語言發(fā)育。2、如果1555A〉G基因檢査為陽性，那么患兒的母親家族中應該永遠避免應用氨基糖甙類藥物，防止藥物性耳聾發(fā)生。進行產(chǎn)前基因診斷，對于有生育耳聾患兒風險的夫婦意義特別重大。當他們生育一個聾兒后，迫切想知道第二個孩子的情況，這時的基因診斷加上產(chǎn)前診斷，在懷孕10周后即可確認胎兒的耳聾基因狀態(tài)，從而可以提前采取干預措施，避免聾兒出生。3、如果對所有新生兒進行遲發(fā)性聽力損失相關的四個基因突變熱點(GJB2235delC、SLC26A4IVS7-2A—G、12SrRNA1555A—G、12SrRNA1494C—T突變)進行檢測，再加上對巨細胞病毒感染的檢査，那么對于新生兒中具有遲發(fā)性聽力損失的高危兒來說，其中60%可在新生兒期即做到癥狀前診斷，同時在先天性聽力損失患兒中至少40%的可以明確病因。6這是一個令人鼓舞的數(shù)據(jù)和具有很好前景的革命性工作。這些干預措施可以使數(shù)萬孩童及其家庭免除一生的痛苦，更可為國家每年節(jié)省數(shù)百億元的經(jīng)濟損失，其社會意義和經(jīng)濟意義也同樣巨大。為了實現(xiàn)聾病防治工作的"早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預"，我國自2000年開始在全國普及新生兒聽力篩査。目前新生兒的聽力篩查正在不斷擴展，所用的方法是新生兒在出生后三天內(nèi)應用耳聲發(fā)射儀器進行檢測，42天后進行復査。國家衛(wèi)生部以及母嬰保健法要求的新生兒聽力篩查的陽性發(fā)現(xiàn)率為r%。，而實際工作開展至今的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國新生兒重度耳聾的平均發(fā)病率基本符合該比例。但是在對5歲兒童和青春期14歲人群的研究結果中，這一比例則分別約為2.53%。和3.54%Q，差別非常之大，研究顯示隨著新生兒的生長發(fā)育，遲發(fā)型耳聾和藥物性耳聾的發(fā)病率迅速提高。這一現(xiàn)象表明，單純新生兒聽力篩査具有很大的局限性，僅就技術策略來說，聽力篩査是無法發(fā)現(xiàn)聽力正常的藥物性耳聾基因攜帶者和遲發(fā)型耳聾患者的，而如果在新生兒聽力篩查中融入聾病易感基因篩査的內(nèi)容將會如何呢？根據(jù)我們前期對10000例新生兒進行易感基因篩査的研究，發(fā)現(xiàn)線粒體12SrRNAA1555G基因篩査陽性者比例約為1%。；12SrRNAC1556T基因篩査陽性者比例約為4.4%。；發(fā)現(xiàn)GJB2致聾基因突變者比例約為12.9%。；SLC26A4致聾基因突變者比例約為12%。。累計聾病基因檢測的陽性發(fā)現(xiàn)率約為30%。，比當前聽力篩查的檢出率高出30倍。以我國每年1800萬新生兒計，通過易感基因篩査，每年將可篩査出54萬名新生兒是致聾基因的攜帶者，并且如前文所述可以通過早期干預和提前預知使其中的5060%免于發(fā)病，這樣就在很大程度上彌補了新生兒聽力篩査的不足。這說明新生兒耳聾易感基因篩査具有重大的社會意義和經(jīng)濟意義。對于耳聾易感基因的檢測，國際及國內(nèi)都已發(fā)展出了多種技術策略及相應的產(chǎn)品。目前市場上現(xiàn)有的聾病易感基因檢測方法及其產(chǎn)品主要有如下幾種1.基因芯片法目前已有的試劑盒采用了基因芯片的原理，可同時檢測4個耳聾相關基因(GJB2,GJB3,SLC26A4和12SrRNA)的IO個突變熱點。該試劑盒的組成包括PCR擴增引物混合物、PCR擴增試劑混合物、雜交試劑、洗滌試劑、芯片和蓋片等。優(yōu)點是快速、高通量篩查，但操作過于復雜，成本太高，不易普及。2.LDR法以連接酶檢測反應(ligasedetectionreaction,LDR)為核心技術，目前有針對藥物性致聾相關基因多態(tài)性位點(SNP)的試劑盒，可以檢測到多個位點的突變，但是需要探針技術、雜交，以及洗脫后進行結果的判讀，操作環(huán)節(jié)較多，需要專業(yè)人員操作。同時雖然該法較芯片技術成本低，但一次檢測操作至少要5小時以上。3.RFLP法以限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)為核心技術，目前已有的該類型試劑盒主要由DNA提取部分、PCR部分、內(nèi)切酶試劑組成，成本比芯片技術及LDR技術相對較低，操作也相對簡單，但是需要模板制備、PCR擴增、酶切和電泳驗證，操作時間長，過程繁鎖，各個環(huán)節(jié)之間關系緊密，一步失誤則下一步無法進行。DNA的提取還需要消耗一定的時間和成本，而且血樣的提取、結果的判讀需要有經(jīng)驗的人員進行專門的培訓后才能勝任，不適合面向基層的普及應用。4.定量PCR法目前有針對藥物性致聾相關基因的試劑盒，配以野生型和突變型兩種特異性引物、基因特異性熒光探針、PCR反應液、耐熱DNA聚合酶、核苷酸單體等成分，用實時熒光定量PCR體外擴增法檢測A1555A>G野生型、A1555A〉G突變型、C1494T野生型，C1494T突變型四種型別。該試劑盒的特異性較好，但對儀器和操作人員技術要求較高，成本較高，對操作人員需要較高的技術要求，因此不適合普及和推廣。如上所述，這些方法普遍存在技術要求高、步驟多、速度慢、成本高等特點，國內(nèi)醫(yī)院的實施難度較大，尤其是很難在基層臨床醫(yī)療機構進行推廣和普及，更無法成為耳聾易感基因篩查的工具。當前，為了從根本上提高國民醫(yī)療水平，國家提出了"戰(zhàn)略前移、重心下移"的疾病防治新戰(zhàn)略，著重強調(diào)以預防為主、以農(nóng)村為主。因此，開發(fā)易操作、成本低、適合基層推廣的技術方法和相應產(chǎn)品成為當務之急，具有重大的醫(yī)療價值和社會意義。四弓l物ARMS-PCR法(Tetrasprimeramplificationrefractorymutationsystem-PCR，TetrasprimerARMS-PCR)屬于等位基因特異PCR技術范疇，其基本原理是由于TaqDNA聚合酶無3'—5'外切酶活性，當引物的3'末端堿基不能與模板互補時，延伸效率明顯降低，當錯配堿基的數(shù)目達到一定程度或者反應條件達到一定的嚴謹程度時，延伸無法繼續(xù)，反應終止，得不到特異長度的擴增條帶。基于此，針對一個SNP位點設計兩個延伸方向相反的內(nèi)側8引物(Innerprimer),這兩個引物的3'末端堿基分別與SNP位點的一個堿基相同(或互補)，然后按正常的方法設計兩個方向相反的外引物(Outerprimer);這四個引物可以組成三個引物對，在同一個擴增體系進行反應，擴增產(chǎn)物用凝膠電泳檢測時，出現(xiàn)兩條帶的是純合基因型，出現(xiàn)三條帶的是雜合基因型。如上所述，四引物ARMS-PCR法的技術實施不需要特殊的設備和復雜的操作步驟，只需要一個PCR反應和一次凝膠電泳就可以明確區(qū)分出三種基因型。因此該技術是一個結果準確可靠、操作簡便高效、使用成本低廉的基因分型方法，自2001年被提出以來即獲得了廣泛的應用，尤其是對于多位點多樣本的檢測，其操作簡捷和成本低廉的特點更是具有當前其它方法所無可比擬的優(yōu)勢。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術方案是通過以下的措施來達到的設計了一種遺傳性耳聾易感基因篩査試劑盒，以12srRNA基因1494位點的C—T突變、12srRNA基因1555位點的A—G突變、SLC26A4基因IVS7(-2)位點的A—G突變、GJB2基因235位點C(±)為檢測對象，根據(jù)四引物擴增受阻突變體系PCR技術原理，針對每個待測位點分別設計和優(yōu)化出一套特異引物，并將成套引物置于同一個反應管中進行擴增，對四個反應管進行一次多重PCR擴增和一次凝膠電泳，即可同時獲得該四個位點的基因型。線粒體基因組12srRNA基因第1555位點A—G突變檢測的上游外引物位于1555位點上游的第1310-1360nt區(qū)域，下游外引物位于1555位點下游的第1640-1690nt區(qū)域，對應突變基因型的內(nèi)引物位于1515-1555nt區(qū)域，對應正?；蛐偷膬?nèi)引物位于1555-1595nt區(qū)域。引物序列及設定名稱如下SEQNO.01:上游外引物5，-TgTAgCCCATgAggTggCAAgAAATg-3，SEQNO.02:下游外引物5，-TTAgCTCAgAgCggTCAAgTTAAgTTgAAA-3，SEQNO.03:突變內(nèi)引物5，-TTTAACTAAAACCCCTACgCATTTATATAgAggAgg-3,SEQNO.04:正常內(nèi)引物5，-CACTTTCCAgTACACTTACCATgTTACgACTTgT-3，線粒體基因組12srRNA基因第1494位點C—T突變檢測的上游外引物位9于1494位點上游的第1200-1250nt區(qū)域，下游外引物位于1494位點下游的第1640-1690nt區(qū)域，對應突變基因型的內(nèi)引物位于1450-1494nt區(qū)域，對應正?；蛐偷膬?nèi)引物位于1494-1534nt區(qū)域。引物序列及設定名稱如下SEQNO.05:上游夕卜弓I物5，-AACCCCgATCAACCTCACCACCT-3，SEQNO.06:下游外引物5'-ggCTAggTTTAgCTCAgAgCggTCAAgT畫3，SEQNO.07:突變內(nèi)引物5'-CgTACACACCgCCCgTCACT-3，SEQNO.08:正常內(nèi)弓|物5，-TTTAgTTAAArgTCCTTTgAAgTATACTTgAggAgg-3，細胞核基因組中SLC26A4基因IVS7(-2)位點A—G突變檢測的上游外引物位于IVS7(-2)位點上游的IVS7的第(-360)—(-310)nt區(qū)域，下游外引物位于IVS7(-2)位點下游的IVS8的第95-135nt區(qū)域，對應突變基因型的內(nèi)引物位于IVS7的第(-40)—(-2)nt區(qū)域，對應正?；蛐偷膬?nèi)引物位于IVS7(-2)—EXON8(40)nt區(qū)域。引物序列及設定名稱如下SEQNO.09:上游外引物5，-CATgTgggAAgATTCATATgAgAATTgATTgT-3，SEQNO.10:下游夕卜引物5，-CCAgATCACACACAAATAggACTATTgAAggAgTAT匿3，SEQNO.ll:突變內(nèi)引物5，-ACCAATggAgTTTTTAACATCTTTTgTTTTATTTCg-3，SEQN0.12:正常內(nèi)引物5，-gCTCCATATgAAATggCAgTAgCAATTATCgTCT陽3'細胞核基因組中GJB2基因第235位點堿基缺失檢測的上游外引物位于該基因5'-UTR區(qū)的第(-110)—(-60)nt區(qū)域，下游外引物位于235位點下游的第450-500nt區(qū)域，對應突變基因型的內(nèi)引物位于190-235nt區(qū)域，對應正?；蛐偷膬?nèi)引物位于235-275nt區(qū)域。引物序列及設定名稱如下SEQNO.13:上游外引物5，-gCTCAggAAgAgATTTAAgCATgCTTgCT-3，SEQNO.14:下游外引物5'-CATggAgAAgCCgTCgTACATgACAT-3，SEQNO,15:突變內(nèi)弓l物ATCTCCCACATCCggCTATgggCCTSEQNO.16:正常內(nèi)引物ggCgTggACACgAAgATCAgCTCCCg為了使篩查工作的實施具有操作簡便、結果準確可靠的特點，本試劑盒分別預制了四種可直接上機使用的多重PCR試劑，其組分分別為101.12srRNA基因1555位點分型的反應試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、引物SEQNO.Ol、SEQN0.02、SEQN0.03、SEQNO龍2.12srRNA基因1494位點分型的反應試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、引物SEQN0.05、SEQN0.06、SEQN0.07、SEQNO.08。3.SLC26A4基因IVS7(-2)位點分型的反應試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、引物SEQN0.09、SEQNO.IO、SEQNO.ll、SEQNCU2。4.GJB2基因第235位點分型的反應試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、引物SEQNO.B、SEQNCU4、SEQNCU5、SEQN0.16。圖l:四引物ARMS-PCR法技術原理示意圖。圖2:1555位點10個樣本擴增產(chǎn)物電泳結果。圖3:1494位點10個樣本擴增產(chǎn)物電泳結果。圖4:SLC位點10個樣本擴增產(chǎn)物電泳結果。圖5:GJB2位點10個樣本擴增產(chǎn)物電泳結果。具體實施例方式借助以下實施例對發(fā)明作進一步描述。下面這些實施例是示范性的，而不是限制性的，可根據(jù)上述技術方案和試劑情況，來確定具體的實施方式。一、待測樣本選擇待測樣本從解放軍總醫(yī)院承辦的中國貧困聾兒救助行動一"華夏萬名新生兒聽力拯救項目"中選擇。該項目中所涉及的所有血樣都使用"DNA提取一PCR擴增一測序"的技術方法對樣本的線粒體12SrRNA基因的1555位點和1494位點、SLC26A4基因的IVS7-2位點、GJB2基因的235位點進行了基因分型。ii本實施例中選擇上述己經(jīng)過基因分型的樣本作為待測樣本，其中各位點分別選擇4個純合陰性基因型樣本、4個雜合基因型樣本、2個純合陽性基因型樣本，各取對應樣本的基因組DNA備用。二、PCR反應體系及反應程序設置1、PCR體系取四種預制的多重PCR試劑，分別加到四個PCR反應管中，在每個管中各加入10nggDNA，混勻后密封，將四個反應管一起放置到PCR儀中。2、擴增程序<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4、瓊脂糖凝膠電泳(1)使用0.5XTBE制備2X瓊脂糖凝膠；(2)從PCR管中吸取擴增產(chǎn)物2pl，與2pl的6XLoadingBuffer混勻后加入凝膠的梳子孔中；(3)200V恒壓電泳90分鐘；(4)電泳結束后取出膠塊置入凝膠成像儀中，紫外燈下顯示電泳條帶并照相。結果如圖2、圖3、如圖4、圖5所示。5、結果分析及基因型判定根據(jù)電泳結果中各泳道的帶型特征，對各樣本的四個位點分別進行基因型判定。結果基因型分型結果與測序法獲得的結果一致。權利要求1、一種遺傳性耳聾易感基因篩查試劑盒，其特征在于，以12srRNA基因1494位點的C→T突變、12srRNA基因1555位點的A→G突變、SLC26A4基因IVS7(-2)位點的A→G突變、GJB2基因235位點C(±)為檢測對象，根據(jù)四引物擴增受阻突變體系PCR技術原理，針對每個待測位點分別設計和優(yōu)化出一套特異引物，并將成套引物置于同一個反應管中進行擴增，對四個反應管進行一次多重PCR擴增和一次凝膠電泳，即可同時獲得四個位點的基因型。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，12srRNA基因1555位點A—G突變檢測的上游外引物位于1555位點上游的第1310-1360nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNO.Ol)，下游外引物位于1555位點下游的第1640-1690nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNO.02),對應突變基因型的內(nèi)引物位于1515-1555nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNO.03),對應正?；蛐偷膬?nèi)引物位于1555-1595nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQN0.04)。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，12srRNA基因1494位點C—T突變檢測的上游外引物位于1494位點上游的第1200-1250nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQN0.05)，下游外引物位于1494位點下游的第1640-1690nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNO.06),對應突變基因型的內(nèi)引物位于1450-1494nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNO.07),對應正?；蛐偷膬?nèi)引物位于1494-1534nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQN0.08)。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，SLC26A4基因IVS7(-2)位點A—G突變檢測的上游外引物位于IVS7(-2)位點上游的IVS7的第(-360)一(-310)nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQN0.09)，下游外引物位于IVS7(-2)位點下游的IVS8的第95-135nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNO.IO)，對應突變基因型的內(nèi)引物位于IVS7的第(-40)—(-2)nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNO.ll)，對應正?；蛐偷膬?nèi)引物位于IVS7(-2)—EXON8(40)nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNCU2)。5、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，GJB2基因第235位點堿基缺失檢測的上游外引物位于該基因5'-UTR區(qū)的第(-110)—(-60)nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQN0.13)，下游外引物位于235位點下游的第450-500nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNO.14),對應突變基因型的內(nèi)引物位于190-235nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNO.15),對應正?；蛐偷膬?nèi)引物位于235-275nt區(qū)域(引物設定名稱為SEQNCU6)。6、如權利要求l、2、3、4、5之一所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括下列內(nèi)容(1)12srRNA基因1555位點分型的反應試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、序列特異的兩種外引物、序列特異的兩種內(nèi)引物。(2)12srRNA基因1494位點分型的反應試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、序列特異的兩種外引物、序列特異的兩種內(nèi)引物。(3)SLC26A4基因IVS7(-2)位點分型的反應試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、序列特異的兩種外引物、序列特異的兩種內(nèi)引物。(4)GJB2基因第235位點分型的反應試劑，包括10XPCRBuffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、序列特異的兩種外引物、序列特異的兩種內(nèi)引物。全文摘要本發(fā)明涉及一種遺傳性耳聾易感基因篩查試劑盒，該試劑盒以12srRNA基因1494位點的C→T突變、12srRNA基因1555位點的A→G突變、SLC26A4基因IVS7(-2)位點的A→G突變、GJB2基因235位點C(±)為檢測對象，根據(jù)四引物擴增受阻突變體系PCR技術原理，針對每個待測位點分別設計和優(yōu)化出一套特異引物，并將成套引物置于同一個反應管中進行擴增，對四個反應管進行一次多重PCR擴增和一次凝膠電泳，即可同時獲得四個位點的基因型。文檔編號C12Q1/68GK101684497SQ20081022274公開日2010年3月31日申請日期2008年9月23日優(yōu)先權日2008年9月23日發(fā)明者王秋菊,魏宏泉申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院