本發(fā)明涉及基因診斷試劑盒領(lǐng)域，尤其涉及一種預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移的基因檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
：癌癥死亡是目前威脅人類生命健康的一大因素，90％以上的癌癥患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥患者生存期一般不超過五年。在我國，胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第二位，死亡率第四位。我國胃癌住院病例中90％以上為進(jìn)展期胃癌，即使施行根治，其五年生存率仍徘徊在30％左右，影響胃癌預(yù)后的主要原因是轉(zhuǎn)移。胃癌轉(zhuǎn)移多發(fā)生在患者中晚期，僅有少部分發(fā)生在胃癌的早期，給患者帶來了極大的痛苦，因此腫瘤轉(zhuǎn)移的早期檢測顯得尤為關(guān)鍵。胃癌常見轉(zhuǎn)移部位有肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移及腦轉(zhuǎn)移等，其轉(zhuǎn)移途徑主要有：1、直接播散：浸潤型胃癌可沿粘膜或漿膜直接向胃壁內(nèi)、食管或十二指腸發(fā)展。癌腫一旦侵及漿膜，即容易向周圍鄰近器官或組織如肝、胰、脾、橫結(jié)腸、空腸、膈肌、大網(wǎng)膜及腹壁等浸潤。癌細(xì)胞脫落時也可種植于腹腔、盆腔、卵巢與直腸膀胱陷窩等處。2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：占胃癌轉(zhuǎn)移的70％，胃下部癌腫常轉(zhuǎn)移至幽門下、胃下及腹腔動脈旁等淋巴結(jié)，而上部癌腫常轉(zhuǎn)移至胰旁、賁門旁、胃上等淋巴結(jié)。晚期癌可能轉(zhuǎn)移至主動脈周圍及膈上淋巴結(jié)。由于腹腔淋巴結(jié)與胸導(dǎo)管直接交通，故可轉(zhuǎn)移至左鎖骨上淋巴結(jié)。3、血行轉(zhuǎn)移：部分患者外周血中可發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，可通過門靜脈轉(zhuǎn)移至肝臟，并可達(dá)肺、骨、腎、腦、腦膜、脾、皮膚等處。目前主要采用醫(yī)學(xué)影像學(xué)進(jìn)行胃癌轉(zhuǎn)移的診斷，以骨轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移為例，目前的診斷方法主要如下：一、胃癌骨轉(zhuǎn)移診斷方法：1)放射性核素骨掃描(ECT)檢查：對胃癌骨轉(zhuǎn)移的診斷率較高，能在X線平片及CT發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移之前數(shù)月檢出轉(zhuǎn)移灶，對于多發(fā)性胃癌骨轉(zhuǎn)移診斷假陽性極少，但對于單發(fā)性胃癌骨轉(zhuǎn)移診斷有一定假陽性；2)X線檢查：可作為胃癌骨轉(zhuǎn)移診斷的基本檢查手段，有助于檢測溶骨性骨轉(zhuǎn)移部位骨髓質(zhì)和骨皮質(zhì)破壞的程度，也可用于證實其他影像學(xué)的發(fā)現(xiàn)，但對于沒有骨破壞的轉(zhuǎn)移灶靈敏度低；3)計算機(jī)斷層掃描(CT)檢查：CT對胃癌骨轉(zhuǎn)移的診斷比X線靈敏。能發(fā)現(xiàn)早期骨質(zhì)破壞，一般無假陽性，但難以發(fā)現(xiàn)跳躍性椎體轉(zhuǎn)移灶；4)核磁共振成像(MRI)檢查：MRI對胃癌骨轉(zhuǎn)移的診斷高度敏感。胃癌疑有骨轉(zhuǎn)移者應(yīng)常規(guī)行骨顯像檢查，對多發(fā)性且明顯放射性濃聚者判斷為骨轉(zhuǎn)移，而對于單發(fā)濃聚者采用X線平片或CT進(jìn)一步證實，而多發(fā)性濃聚不太明顯者采用MRI檢查。二、胃癌的肝轉(zhuǎn)移：1)腹部彩色超聲：為臨床診斷胃癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移及治療后隨診的首選方法。一般1～2cm以上肝轉(zhuǎn)移癌灶均可能顯像，總的臨床診斷準(zhǔn)確率可達(dá)90％。2)腹部計算機(jī)斷層掃描(CT)：目前已成為診斷胃癌肝轉(zhuǎn)移的常規(guī)檢查方法?？蓹z出1～2cm或更小的轉(zhuǎn)移性癌灶，其敏感度可超過90％。3)核磁共振成像(MRI)：胃癌肝轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為邊界清楚，信號強(qiáng)度均勻或強(qiáng)弱不等的多發(fā)或單發(fā)病灶，可呈現(xiàn)“靶征”或“亮環(huán)征”，其敏感性與CT相近。4)選擇性腹腔動脈或肝動脈造影：?？娠@示出1cm或更小的肝轉(zhuǎn)移癌灶。對肝內(nèi)占位性質(zhì)難以確定、病灶較大、邊界欠清、懷疑肝內(nèi)有衛(wèi)星轉(zhuǎn)移癌灶者，可考慮行選擇性動脈造影。5)正電子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像(PET)：PET獲得的斷層圖像主要反映組織/細(xì)胞的代謝信息，可以直接對人體進(jìn)行生理、生化的代謝研究，在腫瘤發(fā)生早期，即在其病理變化之前就可能發(fā)現(xiàn)腫瘤存在。但因其價格昂貴，目前尚不能普遍應(yīng)用，只能作為一種特殊的檢查方法。目前，臨床上主要采用醫(yī)學(xué)影像學(xué)對胃癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行臨床診斷，但是這些方法也存在著一些明顯的不足，主要體現(xiàn)在：指標(biāo)不夠客觀，對于微小轉(zhuǎn)移灶和臨界狀況無法提供明確的判定；能夠明顯識別的轉(zhuǎn)移灶，對于患者已經(jīng)是中晚期了，錯過最佳的治療時機(jī)，不利于患者的治療。隨著二代測序技術(shù)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，液體活檢技術(shù)被越來越多的人所接受應(yīng)用到腫瘤的早期診斷和檢測領(lǐng)域中，主要包括cfDNA(細(xì)胞游離DNA)、ctDNA(循環(huán)腫瘤DNA)和CTC(循環(huán)腫瘤細(xì)胞)等。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移的基因檢測試劑盒及其使用方法，使用本發(fā)明的試劑盒能夠預(yù)測胃癌患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的概率風(fēng)險，通過基因檢測技術(shù)進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移的超早期篩查，提前預(yù)防，贏得診治的最佳治療時間，使患者獲益。在一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移的基因檢測試劑盒，試劑盒中包含DNA建庫試劑盒，DNA建庫試劑盒包含高?；蛱结樅偷臀；蛱结?；-高危基因包括：CDH1、CDH2、SNAIL、SLUG、MUC4、MUC6、PRSS3、USP6、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、TGFBR2、MMP2、MMP9、BRCA1、BRCA2、PALB2、ATM、ATR、MUTYH、EMSY、ERCC4、RAD51、PARP1和XRCC1；-低?；虬ǎ篈TRX、BRIP1、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、FANCO、FANCP、MDM2、MDM4、MLH1、NPM1、PP2R1A、PRKDC、RAD50、STAG2、XRCC5和XRCC6。進(jìn)一步地，DNA建庫試劑盒為二代測序快速DNA建庫試劑盒。進(jìn)一步地，DNA建庫試劑盒中還包括T4DNA連接酶、DNA末端修復(fù)酶、高保真DNA合成酶和酶反應(yīng)緩沖液。其中，酶反應(yīng)緩沖液為現(xiàn)有技術(shù)中DNA建庫試劑盒中常用緩沖液，可通過商業(yè)途徑獲取。進(jìn)一步地，試劑盒中還包括真空采血管。進(jìn)一步地，試劑盒中還包括血液DNA抽提試劑盒。進(jìn)一步地，血液DNA抽提試劑盒中包括異丙醇、RNA酶、蛋白酶K和酶反應(yīng)緩沖液。其中，酶反應(yīng)緩沖液為現(xiàn)有技術(shù)中血液DNA抽提試劑盒中常用緩沖液，可通過商業(yè)途徑獲取。在另一方面，本發(fā)明還提供了一種預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移的基因檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)提取血液樣本中的cfDNA，cfDNA中含有胃癌腫瘤細(xì)胞釋放的DNA，攜帶有腫瘤細(xì)胞特異性的基因突變；(2)采用DNA建庫試劑盒對cfDNA進(jìn)行建庫，然后對DNA進(jìn)行測序，獲得基因全長序列；(3)對步驟(2)的基因全長序列進(jìn)行基因突變分析。進(jìn)一步地，在步驟(1)之前還包括使用真空采血管采集血液樣本的步驟，并在樣本采集72h內(nèi)進(jìn)行cfDNA的提取。進(jìn)一步地，在步驟(2)中，采用Illumina二代測序平臺，對DNA進(jìn)行測序。進(jìn)一步地，在步驟(3)中，基因突變導(dǎo)致胃癌轉(zhuǎn)移的概率依次降低的失活突變、致病性突變、非致病性非同義突變和同義突變，根據(jù)概率對突變按表1設(shè)定分值。表1基因突變評分表失活突變致病性突變非致病性非同義突變同義突變高?；?01820.25低?；?0910.25優(yōu)選地，失活突變?yōu)樘崆敖K止、終止子缺失、移碼突變和第一位甲硫氨酸突變中的一種或幾種；致病性突變?yōu)辄c(diǎn)突變、擴(kuò)增、插入或者缺失中的一種或幾種；非致病性非同義突變?yōu)楦淖儼被岬淖儺?；同義突變?yōu)槲锤淖儼被岬淖儺?。進(jìn)一步地，在步驟(3)中，高?；蚺c低?；虻氖Щ钔蛔儭⒅虏⌒酝蛔?、非致病性非同義突變的得分比為2:1。進(jìn)一步地，在步驟(3)中，高?；蚺c低危基因的同義突變的得分比為1:1。進(jìn)一步地，在步驟(3)中，根據(jù)DNA中基因突變的種類和數(shù)量得到分?jǐn)?shù)，將該分?jǐn)?shù)與總分?jǐn)?shù)對比來判斷胃癌轉(zhuǎn)移的概率。進(jìn)一步地，在步驟(3)中，以總分?jǐn)?shù)的一半作為臨界點(diǎn)來判斷胃癌轉(zhuǎn)移概率。高于臨界點(diǎn)的，預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移的概率較高，需要預(yù)防及提前進(jìn)行治療；低于臨界點(diǎn)的，預(yù)測短時間內(nèi)(1～2年)不會發(fā)生胃癌轉(zhuǎn)移。本發(fā)明提供了一種通過血液細(xì)胞游離DNA檢測的試劑盒，同時提供了一種使用該試劑盒的方法以預(yù)測胃癌患者是否發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，其基本步驟為采集患者的血液，采用二代測序檢測患者血液中cfDNA基因突變情況，通過一套客觀的評分表來預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移的概率。借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明在抽血后72h，即可以提供一份客觀可靠的基因檢測分析報告，評估胃癌患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的概率風(fēng)險，提前預(yù)防，贏得最佳治療時間，使患者獲益；相比于醫(yī)學(xué)影像學(xué)診斷，結(jié)果客觀，重復(fù)性高，能夠輔助患者進(jìn)行早期預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移，爭取到更多的治療時間。具體實施方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1一種預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移的基因檢測試劑盒，試劑盒中包含：-真空采血管；-血液DNA抽提試劑盒，其中包括以下組分：異丙醇、RNA酶、蛋白酶K和各種酶反應(yīng)緩沖液，如10X連接緩沖液、PCR緩沖液。-二代測序快速DNA建庫試劑盒，其中包括預(yù)先設(shè)計好的50個基因探針，具體包括高?；蛱结樅偷臀；蛱结?，其中：-高危基因包括：CDH1、CDH2、SNAIL、SLUG、MUC4、MUC6、PRSS3、USP6、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、TGFBR2、MMP2、MMP9、BRCA1、BRCA2、PALB2、ATM、ATR、MUTYH、EMSY、ERCC4、RAD51、PARP1和XRCC1；-低?；虬ǎ篈TRX、BRIP1、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、FANCO、FANCP、MDM2、MDM4、MLH1、NPM1、PP2R1A、PRKDC、RAD50、STAG2、XRCC5和XRCC6。此外，二代測序快速DNA建庫試劑盒中還包括以下試劑：T4DNA連接酶、DNA末端修復(fù)酶、高保真DNA合成酶和各種酶反應(yīng)緩沖液，如10X連接緩沖液、PCR緩沖液。實施例2實施例1中預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移的基因檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)采血：采集患者的血液5ml，保存于真空采血管中，72小時內(nèi)進(jìn)行cfDNA的抽提；(2)DNA抽提：采用血液DNA提取試劑盒抽提血液中游離的DNA，其中含有少量的胃癌腫瘤細(xì)胞釋放的DNA，包含有腫瘤細(xì)胞特異性的基因突變；(3)建庫：采用二代測序快速DNA建庫試劑盒，對cfDNA進(jìn)行建庫；(4)測序：采用Illumina二代測序平臺，對DNA進(jìn)行測序，獲得50個基因的全長序列；(5)基因突變檢測：測序結(jié)果下機(jī)后，通過生物信息學(xué)，分析基因突變情況；(6)打分機(jī)制：將高?；蚝偷匚换虻耐蛔儼幢?進(jìn)行評分。表1基因突變評分表失活突變致病性突變非致病性非同義突變同義突變高?；?01820.25低?；?0910.25其中，表1中各種突變的定義及打分規(guī)則如下：失活突變?yōu)橐韵?種類型的突變：提前終止、終止子缺失、移碼突變)和第一位甲硫氨酸突變。某個基因如檢測到失活突變，則直接評分，不再參與后續(xù)的打分，例如BRCA1發(fā)生移碼突變，則直接打20分，其它致病性突變，非同義突變和同義突變都不再評分。致病性突變?yōu)镃linvar在線數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中記載為pathogenic的變異(致病性變異)。例如MLH1基因p.P28L,p.A29Lfs,p.E23X等致病性變異。某個基因如未檢測到失活突變，檢測到致病性突變則直接評分，不再參與后續(xù)的打分，例如BRCA1未發(fā)生失活突變，發(fā)生一個致病性突變，則直接打18分，其它非同義突變和同義突變都不再評分。非致病性非同義突變?yōu)楦淖儼被岬淖儺?。同義突變?yōu)槲锤淖儼被岬淖儺?。對于任意一個患者，其測序結(jié)果都可以按以上評分表進(jìn)行打分，總分?jǐn)?shù)為760分，以380分作為臨界判定點(diǎn)。(7)胃癌轉(zhuǎn)移概率：打分系統(tǒng)歸一化為百分比，以50％作為界限，大于50％的，預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移的概率很高，需要預(yù)防及提前進(jìn)行治療，小于50％的，預(yù)測短時間內(nèi)(1～2年)不會發(fā)生胃癌轉(zhuǎn)移。實施例3采用實施例1-2中的試劑盒及方法，對胃癌患者進(jìn)行診斷。胃癌患者1，姓名WLL，男，年齡61歲，臨床診斷為胃癌。經(jīng)本發(fā)明的試劑盒檢測后，總評分為421，概率超過50％，預(yù)測為胃癌轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險，10個月后檢測到胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其檢測到的50個基因的相關(guān)突變以及具體的評分情況如表2-3：表2高危基因突變數(shù)量及評分表3低?；蛲蛔償?shù)量及評分實施例4采用實施例1-2中的試劑盒及方法，對胃癌患者進(jìn)行診斷。胃癌患者2女姓名XYZ，年齡58，臨床診斷為胃腺癌。經(jīng)本發(fā)明的試劑盒檢測后，總評分為301，概率低于50％，預(yù)測為胃癌轉(zhuǎn)移的低風(fēng)險，12個月后仍未檢測到胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其檢測到的50個基因的相關(guān)突變以及具體的評分情況如表4-5：表4高危基因突變數(shù)量及評分表5低?；蛲蛔償?shù)量及評分實施例5另外使用本發(fā)明的試劑盒測試了另外30名胃癌患者，截止目前為止，預(yù)測準(zhǔn)確率為100％?；颊叩幕拘畔⒓按蚍智闆r見表6：表6使用試劑盒診斷結(jié)果患者姓名年齡臨床診斷評分預(yù)測轉(zhuǎn)移風(fēng)險實際轉(zhuǎn)移情況LSY45胃癌530.5高風(fēng)險8個月后檢測到腦轉(zhuǎn)移LMF49胃癌550高風(fēng)險6個月后檢測到局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移WY62胃癌558.5高風(fēng)險7個月后檢測到肝轉(zhuǎn)移DCF48胃癌280低風(fēng)險13個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移JYX50胃癌586.5高風(fēng)險4個月后檢測到骨轉(zhuǎn)移WBM76胃癌628高風(fēng)險3個月后檢測到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移QHZ48胃癌310低風(fēng)險13個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移ZZS43胃癌430高風(fēng)險10個月后檢測到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移WSJ55胃癌450高風(fēng)險12個月后檢測到腦轉(zhuǎn)移KXP62胃癌286低風(fēng)險12個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移SXB44胃癌275低風(fēng)險12個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移WYH61胃癌568高風(fēng)險5個月后檢測到骨轉(zhuǎn)移XXJ52胃癌290低風(fēng)險12個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移CX55胃癌548.5高風(fēng)險5個月后檢測到胃癌轉(zhuǎn)移YXZ48胃癌540.5高風(fēng)險6個月后檢測到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移LGY56胃癌560高風(fēng)險6個月后檢測到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移LYQ48胃癌300.5低風(fēng)險10個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移LGD43胃癌590.5高風(fēng)險4個月后檢測到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CXF86胃癌620.5高風(fēng)險3個月后檢測到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移LBG73胃癌286.5低風(fēng)險11個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移HFW52胃癌300.5低風(fēng)險10個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移WLH50胃癌298.5低風(fēng)險10個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移QHZ48胃癌320.5低風(fēng)險9個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移LJH53胃癌570.5高風(fēng)險5個月后檢測到骨轉(zhuǎn)移XQX49胃癌312.5低風(fēng)險11個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移XBP61胃癌320.5低風(fēng)險8個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移BRX62胃癌308.5低風(fēng)險11個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移DSZ64胃癌600.5高風(fēng)險5個月后檢測到腦轉(zhuǎn)移WH39胃癌325低風(fēng)險10個月后仍未觀察到轉(zhuǎn)移YZZ52胃癌287.5高風(fēng)險6個月后檢測到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3