專利名稱：：黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明專利屬于生物技術(shù)工程領(lǐng)域，特別是涉及一種植物病毒黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cwcw附6ermoW/e附(wa/cv/nw，CGMMV)的'決速檢領(lǐng)!l方法。
背景技術(shù)：
：黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cwcww6ermoW/emo抑/cv/n/s，CGMMV)是一種正單鏈RNA病毒，屬煙草花葉病毒屬(7b6a/nov/n^),主要分布在羅馬尼亞、波蘭、丹麥、英國、芬蘭、德國、前蘇聯(lián)、希臘克里特島、中國臺灣、日本、韓國、印度、伊朗、沙特阿拉伯、以色列、巴西等地。在自然界該病毒主要侵染葫蘆科作物，引起葉片斑駁、灼泡狀和畸形，并伴隨植株生長矮化，是葫蘆科作物上最具威脅的植物病毒病害。CGMMV侵染黃瓜引起葉片斑駁、水泡及變形，植株矮化、結(jié)果延時甚至導(dǎo)致不孕，果實(shí)大部分黃化或變白并產(chǎn)生黑綠色水皰狀的壞死斑，產(chǎn)量損失達(dá)15%以上；在前蘇聯(lián)的Georgia地區(qū)，黃瓜發(fā)病率達(dá)80100%。CGMMV早期侵染的西瓜(Citrullusvulgaris)植株生長緩慢，出現(xiàn)花葉，果實(shí)中嚴(yán)重變色或果實(shí)內(nèi)部造成腐爛，果肉纖維化，果實(shí)產(chǎn)量下將30%。在中國，2002年首次從日本引進(jìn)的種苗中截獲CGMMV，2004年廈門動植物檢疫局又從日本進(jìn)口的南瓜種子上檢測到CGMMV。2005年遼寧省蓋州市感染CGMMV的西瓜面積達(dá)333hm2，絕收的13hm2。2006年12月21日農(nóng)業(yè)部發(fā)布788號公告，將黃瓜綠斑駁花葉病毒確定為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物，屬國家三類檢疫性病害。CGMMV可經(jīng)多種途徑傳播，以種子傳播和接觸性傳染為主要傳播途徑。隨著種子運(yùn)輸，病毒可長距離傳播到新的地區(qū)或國家，給當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來很大的威脅，如日本從印度進(jìn)口帶毒的葫戶種子，導(dǎo)致該病毒在日本定殖擴(kuò)散，給日本的葫蘆科作物的生產(chǎn)帶來毀滅性的打擊。因此，加強(qiáng)種子帶毒檢測，建立CGMMV的快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測方法，對于防止該病毒進(jìn)一步擴(kuò)散，保護(hù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，具有十分重要的意義。目前傳統(tǒng)的生物學(xué)、血清學(xué)、電子顯微鏡技術(shù)和反轉(zhuǎn)錄PCR等檢測方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。反轉(zhuǎn)錄PCR作為一種比血清學(xué)更加靈敏的技術(shù)，可以對CGMMV進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是近年新發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測技術(shù)，是反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的延伸，它通過監(jiān)測每個擴(kuò)增循環(huán)中所收集的熒光信號，可以實(shí)時的、定量的檢測目的基因，該方法在病毒的定量評估研究中顯示了巨大的潛力，在植物病毒檢測領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用。因此，本發(fā)明利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，建立一套快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的CGMMV定量檢測方法，并應(yīng)用此方法對西瓜種子攜帶的CGMMV進(jìn)行了檢測。
發(fā)明內(nèi)容基于上述研究領(lǐng)域中的空白，本發(fā)明提供了西瓜種子攜帶的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測技術(shù)，為植物病毒檢測提供了一種新方法。黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，采用一步實(shí)時定量RT-PCR反應(yīng)，其特征在于耙基因?yàn)镃GMMV分離物CP基因。所述RT-PCR反應(yīng)體系中的引物對和探針為引物對CGMMV-F:CCAGACTCAAGCGGGAAGAG，CGMMV-R:TCTACGACAGACGAGGGTAACG，探針CGMMV-T:5、FAMTTCTTTCCGCGAGTCCCTGTBHQ-13、。所述RT-PCR反應(yīng)體系為2倍反應(yīng)緩沖液1ExTaq聚合酶(5U4U)0牟預(yù)制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液0牟上游引物(l(HiM)0.2^1下游引物(10pM)0，探針(10nM)0.2pl總RNA2(xl水6牟總體積20^1所述RT-PCR反應(yīng)條件為42'C反轉(zhuǎn)錄5min;95'C變性5s;95°C10s，60°Clmin，45個循環(huán)。所述黃瓜綠斑駁花葉病毒為西瓜種子攜帶的黃瓜綠斑駁花葉病毒。本發(fā)明選用CGMMV分離物CP基因作為靶基因，利用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增方法，在同一反應(yīng)體系中加入引物對CGMMV-F、CGMMV-R和探針CGMMV-T進(jìn)行實(shí)時熒光定量檢測。本發(fā)明方法快速，準(zhǔn)確，可靠，對于防止種子病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散，有很重要的意義。圖1CGMMVCP擴(kuò)增電泳圖，其中泳道l:DL2000;泳道2，3:CGMMVCP基因的擴(kuò)增產(chǎn)物圖2引物和探針濃度的優(yōu)化，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)；縱坐標(biāo)PCR反應(yīng)熒光信號相對強(qiáng)度，其中令引物和探針濃度均為0.2nmol/L;T:引物濃度0.2pmol/L,探針濃度0.4pmol/L，■:引物濃度0.1nmol/L，探針濃度0.1nmol/L。圖3CGMMVCP標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增圖橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)；縱坐標(biāo)PCR反應(yīng)熒光信號相對強(qiáng)度曲線自左至右模板中CGMMVCP拷貝數(shù)依次為500000，50000，5000，500,50。圖4CGMMVCP標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)拷貝數(shù)LOG對應(yīng)數(shù)值；縱坐標(biāo)Ct值。圖5CGMMV標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增圖，橫坐標(biāo)PCR循環(huán)數(shù)；縱坐標(biāo)PCR反應(yīng)熒光信號相對強(qiáng)度。圖6CGMMV標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)拷貝數(shù)LOG對應(yīng)數(shù)值；縱坐標(biāo)Ct值。圖7CGMMV分離物CP基因比對序列具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。下述實(shí)施例中所用方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。1.實(shí)驗(yàn)選用的材料1.1供試樣品CGMMV種子標(biāo)樣為本組保存的各地區(qū)植保站送檢的西瓜種子，健康對照為健康植株的種子。1.2主要試劑RNAisoPlus購自TaKaRa公司。限制性內(nèi)切酶S>na/，￡co//，5am/f/購自NewEnglandBiolabs公司。IPTG、X-Gal、氨芐青霉素、B型小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒及A型質(zhì)粒大量快速提取試劑盒均為博大泰恒公司產(chǎn)品。AxyPrepPCR清潔試劑盒購自Axygen公司。ExTaqDNA聚合酶、dNTP、RNase、RNAisoReagent(總RNA提取試劑)、TranscriptRNACleanUpKit、DL2000DNAMarker、RNAMarkerRLIOOOO、RNAMarkerRLIOOO、EASYDilution,OneStepPrimeScriptRT-PCRKit為TaKaRa公司產(chǎn)品。M-MLVReverseTranscriptase、pGEM-TEasyVectorSystemI，RiboMAXLargeScaleRNAProductionSystem-T7購自Progenia公司。硝基苯磷酸鈉購自Sigma公司。電泳用瓊脂糖為西班牙進(jìn)口產(chǎn)品。其他常用化學(xué)試劑購自北京試劑公司。2.本發(fā)明設(shè)計(jì)和引用的引物與探針在熒光定量檢測中，靶基因的選擇很重要。本發(fā)明在本實(shí)驗(yàn)室近兩年對全國不同地區(qū)CGMMV分離物CP基因序列分析的基礎(chǔ)上，選定了序列比較保守的CP基因作為熒光定量檢測的靶基因。并通過對NCBI上登陸的所有CGMMV分離物CP基因序列進(jìn)行比對(見圖7,同源性達(dá)97.7%),找到序列保守區(qū)域。然后利用Primerexpress2.0進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)。將候選的幾組組合分別于所有CGMMV分離物CP基因序列進(jìn)行比對，篩選出最合適的一組。設(shè)計(jì)的探針5'端用FAM(6-carboxyfluorescein)熒光素標(biāo)記作為報(bào)告基因，3，端用BHQ-1(BlackHoleQuencher1)作為淬滅基團(tuán)。引物探針均由北京英俊基因技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)合成標(biāo)記，設(shè)計(jì)的引物序列見表l。表1CGMMV的引物和探針編號用途位置序列及熒光標(biāo)記基團(tuán)CGMMV-CP-FCGMMV克隆片段的檢測引上游ATGGCTTACAATCCGATCACACC物CGMMV-CP-RCGMMV克隆片段的檢測引下游CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC物CGMMV-SCGMMV克隆片段的檢測引下游CCCGGGCTAAGCTTTCGAGGTG物CGMMV-FCGMMV實(shí)時定量PCR檢測上游CCAGACTCAAGCGGGAAGAG引物CGMMV-RCGMMV實(shí)時定量PCR檢測下游TCTACGACAGACGAGGGTAACG引物CGMMV-TCGMMV實(shí)時定量PCR檢測探針5'(FAM)探針TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT(BHQ-1)3、3西瓜種子總RNA的提取種子樣品總RNA的提取是定量檢測中關(guān)鍵的一步，其純度、質(zhì)量直接影響定量檢測結(jié)果，而西瓜種子含有大量多糖，提取純度較高的總RNA難度很大。本發(fā)明在植物葉組織RNA提取的基礎(chǔ)，建立了一套用于西瓜種子總RNA提取的方法。通過該方法可以抽提得到適合定量檢測的西瓜種子總RNA。在種子RNA抽提過程中，適當(dāng)?shù)募尤敫啕}溶液處理多糖多酚，在RNA溶解后，再次低溫離心，進(jìn)一步剔除多糖。RNA純化的具體步驟如下取單粒西瓜種子，加液氮研磨，加入1ml的RNAisoplus(TaKaRaBiotechnology)進(jìn)一步研磨并移至離心管中。12000rpm，4'C離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管；在上清中加入O.lml5MNaCl和0.3ml氯仿，振蕩混勻，12000rpm，4'C離心15min;將上清再轉(zhuǎn)移至新管，加入1/2體積的異丙醇和1/2體積的高鹽溶液，室溫靜置10min;12000rpm，4'C離心10min，75%乙醇洗滌沉淀物；12000rpm，4"離心5min，棄上清，將沉淀物干燥并溶于50pl的DEPC處理的TE中，1%普通凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。4.CGMMVCP基因的擴(kuò)增、克隆和測序以上述西瓜種子總RNA為模板，CGMMV-CP-F/CGMMV-CP-R為引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到約500bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過PCR產(chǎn)物的純化、與pGEM-TEasy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(JM10)、以及陽性克隆的篩選、鑒定，得到了陽性克隆。序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物長度為486bp。與GenBank中搜索到的CGMMV韓國甜瓜分離物(登陸號AF417243)、CGMMV韓國西瓜分離物(登陸號AF417242)、CGMMVSH分離物(登陸號D12505)和W分離物(登陸號AB015146)，以及本實(shí)驗(yàn)室測定的CGMMV中國遼寧分離物(登陸號EU352259)序列比較分析結(jié)果表明本發(fā)明測定的分離物和上述分離物CP基因核苷酸序列一致性在96.1%左右，說明我們得到了正確的CGMMVCP基因序列。5.CGMMVCP基因的體外轉(zhuǎn)錄和RNA的純化5.1帶酶切位點(diǎn)的CGMMVCP基因的擴(kuò)增、克隆片段正向插入的重組質(zhì)粒的構(gòu)建以上述含有正確序列的重組質(zhì)粒為模板，以CGMMV-CP-F/CGMMV-S為引物對，PCR擴(kuò)增3'末端帶有SmaI酶切位點(diǎn)的CGMMVCP基因?；厥占兓?86bp的PCR產(chǎn)物，與pGEM-TEasy載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JMllO、以及陽性克隆的篩選、鑒定、序列分析，得到了CP基因片段正向插入克隆載體的重組質(zhì)粒，命名為pT-CP500，該重組質(zhì)粒經(jīng)過線性化處理后可用于后期體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。5.2重組質(zhì)粒的大量制備將上述含有目的片段正向插入的重組質(zhì)粒pT-CP500重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMllO、涂平板培養(yǎng)、挑取單菌落，進(jìn)行質(zhì)粒的大量擴(kuò)繁，利用博大泰恒公司的A型質(zhì)粒大量快速提取試劑盒純化質(zhì)粒，操作參照試劑盒說明，并通過凝膠電泳檢測質(zhì)粒質(zhì)量。5.3重組質(zhì)粒的線性化、脫鹽純化及定量重組質(zhì)粒線性化處理:重組質(zhì)粒pT-CP500在25°C條件下，Smal酶切16小時，待完全酶切線性化后65'C溫育10min中止反應(yīng)。酶切體系如下反應(yīng)緩沖液5|ilSmal內(nèi)切酶lpl載體DNA2嗎加水至50nl線性化的質(zhì)粒作為體外轉(zhuǎn)錄的模板之前是必須進(jìn)行脫鹽濃縮處理的，以保證體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)能夠順利充分的進(jìn)行。酶切反應(yīng)產(chǎn)物采用Axygen公司的AxyPrepPCR清潔試劑盒進(jìn)行脫鹽濃縮，具體步驟參照試劑盒進(jìn)行。經(jīng)純化的酶切產(chǎn)物，用H20或TE適當(dāng)稀釋后，用NanoDropND-1000核酸蛋白測定儀(NanoDropTechnologies,USA)測定260nm與280nm處的光吸收值，A260/A280值應(yīng)在1.82.0之間。根據(jù)A260值，以A26(M時，雙鏈DNA濃度為50ug/mL標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算DNA樣品的濃度。后述體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)要求線性化質(zhì)粒脫鹽濃縮后，質(zhì)粒濃度應(yīng)大于0.5mg/ml。5.4體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)要求模板的A260/A280必須在1.8-2.0之間，質(zhì)粒序列的3'端用合適的平末端限制性內(nèi)切酶切斷質(zhì)粒，否則T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄RNA的效率非常低。本發(fā)明中以純化的線性質(zhì)粒作為模板，在T7RNA聚合酶作用下，采用Promega公司的RiboMAXLargeScaleRNAProducitonSystems-T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄生成RNA。標(biāo)準(zhǔn)的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為100ul，室溫下順序加樣制備下列反應(yīng)體系，混勻后，37'C恒溫反應(yīng)24h。隨后，采用TaKaRa公司的TranscriptRNACleanUpKit對體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作步驟參照試劑盒說明，并電泳檢測體外轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)量。體外轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系T7體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液20^1rNTPs(25mMATP,CTP，GTP，UTP)30nl線形化DNA(510ug)40nlT7體外轉(zhuǎn)錄酶10^1總體積lOOpl6.CGMMV—步實(shí)時定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作6.1CGMMV—步實(shí)時RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化為了盡量避免試劑配制中污染和誤差，CGMMV實(shí)時PCR反應(yīng)采用TaKaRa公司的OneStepPrimeScriptRT-PCRKit。一步法RT-PCR比較兩步法RT-PCR更能保證定量檢測樣品間的穩(wěn)定性，而采用預(yù)混試劑可以簡化實(shí)驗(yàn)操作并減少污染。本發(fā)明對OneStepRealTimeRT-PCR反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，引物和探針濃度的組合如下ABC2倍反應(yīng)緩沖液軍，1ExTaq聚合酶(5U/pl)O牟0.4nl預(yù)制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液0.4^10.4^10.4nl上游引物(lOpM)O.化lO.化l0.2nl下游引物(10nM)O牟0.4^10.2pl探針(10nM)0.8^10.4pl0.2^1總RNA2^12pl2pl水5.6^16pl總體積20^120^120[il反應(yīng)參數(shù)42。C反轉(zhuǎn)錄5min;95'C變性5s;95°C10s，60°Clmin，45個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)果表明引物和探針的濃度均為0.2pmol/L時擴(kuò)增信號最強(qiáng)，當(dāng)探針濃度提高至0.4timol/L時信號反而降低，而引物和探針的濃度分別為0.1nmol/L;0.1nmol/L時擴(kuò)增信號最弱。(圖2)6.2CGMMV—步實(shí)時定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作本發(fā)明配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線是從500000~50拷貝的ssRNA片段序列，其目的片段550bp，RNA的濃度是1.5ng/nl，PCR反應(yīng)中所用的RNA體積是用2pl/管。以ssRNA為模板，進(jìn)行一步法實(shí)時RT-PCR擴(kuò)增，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)，以EASYDilution作為模板定義為空白對照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。結(jié)果顯示，模板中ssRNA拷貝數(shù)從50到500000，均得到了成功的擴(kuò)增，而且具有良好的重復(fù)性(表2)，達(dá)到了制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。這說明本發(fā)明采用的檢測體系，只要在2ul的模板中有50拷貝的靶基因時就能檢測到，并可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行CGMMVCPRNA的定量。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以Ct值為縱坐標(biāo)，基因拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，二者的回歸方程為Y=-3.232X+41.030，R=1.000,PCR擴(kuò)增效率為103.9%，Ct值從22.52到35.76個循環(huán)(圖4)。一般情況下斜率只要在-3.0-3.6即可滿足RealTimePCR對擴(kuò)增效率的要求，-3.3時最理想。本發(fā)明制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.232，完全符合實(shí)驗(yàn)要求，表明該反應(yīng)體系是可行的。本發(fā)明建立的針對CGMMVCPRNA的一步法實(shí)時定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線定量范圍是從50拷貝到500000拷貝。曲線斜率均在-3.0-3.6之間，這表明所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線是可靠的。在實(shí)際檢測定量過程中，可以根據(jù)未知樣品的大體濃度范圍，適當(dāng)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍。7.—步實(shí)時定量RT-PC方法檢測種子攜帶CGMMV以單粒西瓜種子總RNA為模板，應(yīng)用本發(fā)明建立的一步實(shí)時定量RT-PC方法對未知濃度樣品(本實(shí)驗(yàn)室保存的CGMMV侵染的西瓜種子標(biāo)樣)中CGMMVCPRNA進(jìn)行了定量分析，擴(kuò)增圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5，圖6。本次制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品拷貝數(shù)分別為200，500，5000，50000，500000，成功的進(jìn)行了擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-3.265x+38.464，r=0.991，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合實(shí)驗(yàn)要求，另外，經(jīng)稀釋的未知濃度的樣品也全部落在了標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)(見圖6)，因此可直接通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定未知樣品中CGMMVCPRNA的數(shù)量。本發(fā)明對10個種子標(biāo)樣進(jìn)行了檢測，根據(jù)Ct值(表3)可以看出IO個種子樣品全部檢測到CGMMVCPRNA，且含量較高，檢出率為100%。但常規(guī)的RT-PCR僅檢測到6個陽性樣品，檢出率為60%。這說明本發(fā)明建立的檢測技術(shù)叫常規(guī)的RT-PCR靈敏。表3種子中CGMMVCPRNA的定量Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>附錄引物對CGMMV墨F:5，-CCAGACTCAAGCGGGAAGAG-3，CGMMV-R:5，-TCTACGACAGACGAGGGTAACG-3'探針CGMMV-T:5，-(FAM)TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT(BHQ－l)-3,權(quán)利要求1.黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)的快速檢測方法，采用一步實(shí)時定量RT-PCR反應(yīng)，其特征在于靶基因?yàn)镃GMMV分離物CP基因。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，RT-PCR反應(yīng)體系中的引物對和探針為引物對CGMMV-F:5，-CCAGACTCAAGCGGGAAGAG-3，CGMMV-R:5，-TCTACGACAGACGAGGGTAACG-3'探針CGMMV-T:5，-(FAM)TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT(BHQ-1)-3，。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，所述RT-PCR反應(yīng)體系為:2倍反應(yīng)緩沖液ExTaq聚合酶(5U4d)o牟預(yù)制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液0.4^1上游引物(lOpM)0.2^1下游引物(l(HiM)0.2^1探針(10^iM)0.2pl總RNA2(xl水6.6^1總體積20^14、根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，所述RT-PCR反應(yīng)條件為42。C反轉(zhuǎn)錄5min;95。C變性5s;95。C10s，60°Clmin，45個循環(huán)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，所述黃瓜綠斑駁花葉病毒為西瓜種子攜帶的黃瓜綠斑駁花葉病毒。全文摘要本發(fā)明涉及“黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法”，屬于生物技術(shù)工程領(lǐng)域。黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，采用一步實(shí)時定量RT-PCR反應(yīng)，其特征在于靶基因?yàn)镃GMMV分離物CP基因。同時本發(fā)明對RT-PCR的反應(yīng)體系和條件作了優(yōu)化。本發(fā)明方法快速，準(zhǔn)確，可靠，對于防止種子病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散，有很重要的意義。文檔編號C12Q1/70GK101368217SQ20081022239公開日2009年2月18日申請日期2008年9月18日優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日發(fā)明者艷劉,周廣和,珣張,莉李,王錫鋒申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所