專利名稱：對蘭類未受粉花進行生長素處理的蘭類單倍體制成方法及蘭類的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過生長素處理蘭類未受粉花，制成單倍體的方法。
背景技術(shù)：
作為觀賞用花，蘭花一直有很高的人氣，近年來，為滿足這種需要，進行了大量的栽培。作為維持這種高人氣的主要原因，順應(yīng)消費者嗜好，正在持續(xù)開發(fā)可以大量栽培經(jīng)濟性高的蘭類品種。這些品種是通過傳統(tǒng)的雜交育種開發(fā)的物質(zhì)，這種雜交育種是指從通過交配得到的幼苗組群中選拔優(yōu)良的個體。得到的優(yōu)良個體必須繁殖達到順應(yīng)大量消費的水平為止。作為大量繁殖法可利用通過組織培養(yǎng)的克隆增殖。
利用組織培養(yǎng)的克隆增殖技術(shù)尚具有不穩(wěn)定、不同品種難易不同、組織培養(yǎng)中的突變等問題。為避免這些問題，采取了進行每個品種的試驗增殖、較低地抑制增殖率等策略，但不論哪個方法，都不能完全抑制突變的發(fā)生，通過組織培養(yǎng)的克隆增殖的蘭類，確認有畸形花的發(fā)生。
這種突變是由組織培養(yǎng)中發(fā)生的并非自然狀態(tài)下的細胞增殖等引起的。與此相比，過去使用的通過植物的自然增殖的株分法等，突變發(fā)生非常少。然而株分法增殖率非常低，難以順應(yīng)近年來的大量消費。
利用一般的種子繁殖，不存在突變等問題，雖然能夠得到很高的增殖率進行繁殖，但由于蘭類植物雜種性高，在種子繁殖組群的均一性是顯著的可見性問題。作為提高這種種子繁殖組群均一性的方法，有利用單倍體植物的方法。
單倍體植物，通過秋水仙堿等處理，可使基因加倍，基因加倍的植物是純系植物。通過這些純系植物的自家交配，得到均一性的種子繁殖組群。此外，純系植物間交配得到的雜種第一代(F1植物)，個體間基因無差別，可得到均一的后代，因此可以得到來自該雜種第一代的并且均一的種子繁殖組群。
這些種子繁殖組群不但具有均一性，而且因為不經(jīng)過組織培養(yǎng)的克隆增殖，突變的危險性低，還期待從雜種第一代得到種子繁殖組群的雜種優(yōu)勢等的優(yōu)選附加特性。而且，在通過組織培養(yǎng)的克隆增殖中，從同一培養(yǎng)組織進行大量增殖，由于培養(yǎng)周期長，突變危險性也高，而種子繁殖組群可在短期間進行大量的繁殖。
作為制作單倍體方法，只對特定植物有效，但應(yīng)先確立花藥培養(yǎng)法或種間雜交法。利用花藥培養(yǎng)法制作單倍體在煙草、水稻、小麥等的育種中利用。用種間雜交法制作單倍體在馬鈴薯、大麥等的育種中利用(小林仁1987，《新植物育種技術(shù)》，養(yǎng)賢堂110-112)，在蘭類植物中，還未知這種單倍體的制作方法。
另一方面，生長素是植物成長調(diào)節(jié)物質(zhì)(植物激素)的一種，其作用之一是促進結(jié)果和果實的肥大成長。已知生長素處理，即使未受精也可以產(chǎn)生果實肥大成長的單性生殖，并持續(xù)生育(倉石晉，1988《植物激素》(第2版)東京大學(xué)出版會，45-46)。在西紅柿栽培中利用這種作用，通過生長素處理西紅柿未受精花，不進行受粉，果實也能生長、肥大。這是通過生長素處理，誘發(fā)無受精生殖，未受精的子房發(fā)育的結(jié)果。不過，高濃度的生長素誘導(dǎo)產(chǎn)生乙烯，促使果實離脫，不適度的處理濃度時，未受精子房脫落，不能得到種子。
蘭的一種“白及”與蝦脊蘭或蘭類的花粉交配，容易得到多量的種子。但試驗播種這些種子時，從其發(fā)芽、苗的性狀來看，單性生殖的可能性是極大的。據(jù)認為是通過花粉的激素刺激，子房發(fā)達，通過卵細胞的倍數(shù)性單性生殖或通過來自胎座等母體營養(yǎng)組織中的胚的無交配生殖，形成種子(伊藤五彥唐澤耕司。1969，《蝦脊蘭及其組群》，誠文堂新光社，206-207)。
此外，報道表明蘭的一種軛瓣蘭的柱頭給予生長素之一的萘乙酸，能誘導(dǎo)單性生殖(森源次郎，山岡浩一，今日英雄，1989，《關(guān)于多種蘭中的單性生殖產(chǎn)生的種子》，園藝學(xué)會雜志，58卷增刊2；森源次郎，山岡浩一，今日英雄，1991，《關(guān)于Zygopetalum mackayi通過單性生殖的種子形成》，園藝學(xué)會雜志，60卷增刊2，466-467)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于，通過生長素處理蘭類未受精花，在發(fā)生無受精的基礎(chǔ)上形成種子，從這種種子中得到單倍體植物和純系植物。
首先，為實現(xiàn)未受精花的種子形成，進行生長素處理，優(yōu)選開花日開始到開花30日后的期間內(nèi)進行處理。
作為處理部位，在合蕊柱或含有合蕊柱的部分噴灑、涂布或滴加生長素水溶液。圖1表示一般的蘭花形態(tài)圖(自內(nèi)田一仁，1982，洋蘭The Orchid，講談社，99)。
根據(jù)蘭類的種類或開花狀況，花往往是向下，為防止生長素水溶液由于重力落下，通過在水溶液中混入瓊脂或淀粉等、加熱而提高粘性，或者通過羊毛脂懸濁糊化等，使生長素留在處理部位也非常有效。
生長素水溶液的生長素濃度為0.1～5.0％。
作為生長素，可以利用吲哚乙酸(IAA)、4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、2，6-二氯苯甲酸、吲哚丁酸(IBA)、4-氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯、2，4，5-三氯苯氧乙酸。
一處理之后就開始看見花被片枯萎，確認在一周左右子房肥大。
子房的發(fā)育和種子形成，根據(jù)蘭類植物種類而異，處理后2個月到6個月，可觀察到種子成熟。這期間，必須充分注意種子的掉落。此外，與通常的交配、結(jié)實相比，種子有時早熟1個月到2個月左右。
采集成熟的種子，進行無菌狀態(tài)下的播種。播種按照常規(guī)方法進行。種子的發(fā)芽率比通常的交配種子低。
一見到發(fā)芽、生育到一定大時，迅速確認是否為單倍體植物，單倍體植物確認，是取出發(fā)芽個體的組織的一部分，測定染色體數(shù)或DNA含量，可通過將這些值和來自自花受粉的植物進行比較來進行，發(fā)芽開始經(jīng)過一定期間后，因為單倍體植物有染色體自然加倍的可能性，單倍體植物的確認必須在發(fā)芽開始的1～5個月內(nèi)進行。


圖1表示一般的蘭花形態(tài)。
圖2表示通過流式細胞計的分析結(jié)果。
圖3表示通過顯微鏡觀察染色體的結(jié)果。
具體實施例方式
以下，作為本發(fā)明的實施形態(tài)，說明一實施例作為實施例，用了白及Bletilla brigantes“H5-11”，供試株用常規(guī)方法培養(yǎng)，確認開花，除去花粉，用點滴器將2％α-萘乙酸的加溫的羊毛脂糊10μl滴落在合蕊柱進行處理，因為同一個體生有多個花，每個個體反復(fù)上述處理5次以上。
子房肥大的物質(zhì)從完全成熟開始(從處理開始6～7個月后)采取，0.5％次氯酸溶液表面殺菌5分鐘，在無菌容器中播種促進發(fā)芽。
播種后，觀察播種的種子數(shù)和有胚種子數(shù)，相對共播種種子數(shù)7037，確認有胚種子數(shù)11個。
表1表示播種時使用的培養(yǎng)基的組成[表1]在實施例中無菌播種使用的培養(yǎng)基成分表

播種2周后，從這些有胚種子中確認生長素處理過的植物8個個體發(fā)芽。
生長素處理過的植物在生育到適當大后采樣(發(fā)芽開始1～2個月后)，用流式細胞計測定這些生長素處理過的植物的DNA含量，同時觀察染色體，檢測染色體數(shù)。
檢測采取幼苗的幼葉來進行，將通過本發(fā)明α-萘乙酸處理過的植物，對比來自自花受粉的植物來實施。圖2表示通過流式細胞計的分析結(jié)果，圖3表示通過顯微鏡觀察染色體的結(jié)果。如圖2所示，在用流式細胞計檢測DNA含量時，相對于來自自花受粉的植物所見的峰，發(fā)現(xiàn)生長素處理過的植物的峰約在一半的位置。
在染色體觀察中，如圖3所示，生長素處理過的植物的染色體觀察為16條，確認是白及的染色體數(shù)32條的一半。
發(fā)芽開始5～6個月后，再次用流式細胞計測定生長素處理過的植物的DNA含量，確認這個峰與來自自花受粉的植物的峰位置大致相同，因此確認發(fā)芽2～5個月后的期間內(nèi)生長素處理過的植物的染色體數(shù)自然加倍。
從這些觀察結(jié)果確認生長素處理過的植物是單倍體。此外，同時觀察到這些生長素處理過的植物隨著其后的時間變化，染色體數(shù)自然加倍。必須從發(fā)芽開始后2個月以內(nèi)確認染色體數(shù)。
如上所述，通過本發(fā)明的蘭類的單倍體的培養(yǎng)，可以提供制成蘭類的種子繁殖品種所必需的純系植物，由此，突變等的危險性降低，有可能長期提供穩(wěn)定而優(yōu)良的品種。
權(quán)利要求
1.蘭類的單倍體的制作方法，其特征在于，將生長素水溶液滴加在蘭類未受粉花，在單性生殖基礎(chǔ)上形成種子，使該種子發(fā)芽生育，得到單倍體植物的蘭類。
2.如權(quán)利要求1所述的蘭類的單倍體的制作方法，其特征在于，將生長素水溶液滴加在蘭類未受粉花的期間為蘭類的開花日開始到開花30日后。
3.如權(quán)利要求1所述的蘭類的單倍體的制作方法，其特征在于，將生長素溶液滴加在未受粉花的合蕊柱或含有合蕊柱的部位。
4.如權(quán)利要求1所述的蘭類的單倍體的制作方法，生長素溶液濃度為0.1％～5.0％。
5.如權(quán)利要求1所述的蘭類的單倍體的制作方法，生長素溶液為選自吲哚乙酸(IAA)、4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、2，6-二氯苯甲酸、吲哚丁酸(IBA)、4-氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯和2，4，5-三氯苯氧乙酸的水溶液。
6.制作蘭類種子繁殖品種的蘭類的種子繁殖品種的制作方法，將生長素水溶液滴落在蘭類未受粉花上，在單性生殖基礎(chǔ)上形成種子，從來自該種子發(fā)芽、培養(yǎng)的蘭類植物中判別出單倍體植物，將判別為單倍體的植物發(fā)芽、育成種子。
7.如權(quán)利要求6所述的制成蘭類的種子繁殖品種的蘭類種子繁殖品種的制作方法。其特征在于，單倍體植物的判別通過測定在發(fā)芽后1～5個月期間采集的試樣的DNA含量或染色體數(shù)來進行。
全文摘要
本發(fā)明提供制作蘭類種子繁殖品種所必要的純系植物。將生長素水溶液滴落在蘭類未受粉花上，在單性生殖的基礎(chǔ)上形成種子，判別該種子發(fā)芽而育成的蘭類植物中的單倍體植物，將判別為單倍體植物的發(fā)芽的種子進行培育，形成染色體加倍的純系植物，制成蘭類的種子繁殖品種。
文檔編號A01G1/00GK1697605SQ0381988
公開日2005年11月16日 申請日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月23日
發(fā)明者市橋正一 申請人:日本札幌啤酒株式會社