專利名稱：半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外檢測(cè)方法，尤其涉及一種類風(fēng)濕因子的半定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是最常見的風(fēng)濕性疾病之一。不 同國(guó)家和地區(qū)的患病率略有差異。全球RA患病率平均為0.5-1%。在我國(guó)，RA患病率為 0.45%，患病總?cè)藬?shù)約為400萬(wàn)左右。RA并不是一種良性病變(benign disease)，與同齡 人相比，RA患者平均壽命可縮短10-15年。RA同時(shí)是致殘率最高的關(guān)節(jié)炎之一，未經(jīng)治療 的患者，其2年和3年的致殘率可達(dá)50 %和70%。RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的全身 性慢性自身免疫性疾病，其臨床特點(diǎn)為累及外周關(guān)節(jié)的侵蝕性滑膜炎，同時(shí)具有類似于“局 限性惡性腫瘤”的增生性和破壞性的性質(zhì)，病程為進(jìn)行性，自行緩解罕見。晚期RA患者由于 其關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞，而導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。此病發(fā)病機(jī)制迄今未能完全闡明，且 無(wú)特效治療。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，采用模仿治療惡性腫瘤的聯(lián)合化學(xué)療法，是該病治療 的一大突破。類風(fēng)濕因子是由于感染因子(細(xì)菌、病毒等)引起體內(nèi)產(chǎn)生的以變性IgG(—種抗 體)為抗原的一種抗體，故又稱抗抗體。常見的類風(fēng)濕因子有IgM型、IgG型IgA型和IgE 型。人體內(nèi)普遍存在著類風(fēng)濕因子，并起著一定的生理作用。近年來(lái)對(duì)IgM型類風(fēng)濕因子 的生物作用已有所了解，這些生物作用包括1、調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)；2、激活補(bǔ)體，加快清除 微生物感染；3、清除免疫復(fù)合物使機(jī)體免受循環(huán)復(fù)合物的損傷。只有類風(fēng)濕因子的量超過 一定的滴度時(shí)稱類風(fēng)濕因子陽(yáng)性。由于IgM型類風(fēng)濕因子是類風(fēng)濕因子的主要類型，而且 具有高凝集的特點(diǎn)，易于沉淀，故臨床上主要測(cè)定IgM型類風(fēng)濕因子，測(cè)定方法為乳膠凝集 法和酶聯(lián)免疫吸附法。類風(fēng)濕因子(RF)是在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)病人血清中發(fā)現(xiàn)，是一 種以變性IgG為靶抗原的自身抗體，主要存在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)液中， 它是一種抗變性IgG的抗體，屬IgM型?？膳cIgGFc段結(jié)合。RA病人和約50%的健康人體 內(nèi)都存在有產(chǎn)生RF的B細(xì)胞克隆，在變性IgG (或與抗原結(jié)合的IgG)或EB病毒直接作用 下，可大量合成RF。健康人產(chǎn)生RF的細(xì)胞克隆較少，且單核細(xì)胞分泌的可溶性因子可抑制 RF的產(chǎn)產(chǎn)生，故一般不易測(cè)出。目前對(duì)于類風(fēng)濕因子(RF)的檢測(cè)主要是RF體外診斷，而RF體外診斷主要技術(shù)有 RF乳膠凝集玻片檢測(cè)法(上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司)。因?yàn)轭愶L(fēng)濕因子(RF)是一種主 要發(fā)生于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的抗人變性IgG自身抗體，可與IgG的Fc段結(jié)合并呈特異 性凝集反應(yīng)。具體方法是用生理鹽水將血清稀釋1 20后，取0.05ml和1滴膠乳試劑于玻璃 板的小方格內(nèi)，立即持續(xù)轉(zhuǎn)搖均勻。在1-3分鐘內(nèi)出現(xiàn)均勻凝集顆粒者為陽(yáng)性，無(wú)凝集者為 陰性。該方法只能定性的檢測(cè)類風(fēng)濕因子(RF)，而且檢測(cè)靈敏度不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法，以丙種球蛋白通過物理吸 附原理致敏在載體膠乳顆粒上，快速檢測(cè)時(shí)用不同稀釋度的待測(cè)血清與致敏膠乳顆粒起凝 集反應(yīng)，測(cè)出RF相對(duì)含量。本發(fā)明所述的半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法，步驟如下1)將待測(cè)血清先于40_56°C溫度下，滅能10分鐘到1小時(shí)后，將甘氨酸緩沖液按 1 20對(duì)血清進(jìn)行稀釋，所得1 20的稀釋血清；2)取出所述的稀釋血清用甘氨酸緩沖液逐次對(duì)倍稀釋成9種不同濃度，依次為 1 40、1 80、1 160、1 320、1 640、1 1280、1 2560、1 5120 和 1 10240;3)分別取出相同體積的所述10種濃度的稀釋血清，分別加入等體積的結(jié)合有人 血丙種球蛋白的聚苯乙烯膠乳，使得血清稀釋度分別為1 40、1 80,1 160,1 320、 1 640、1 1280、1 2560、1 5120、1 10240 和 1 20480，即得 10 種稀釋血清 1 ；4)將所述的10種稀釋血清1稀釋于試管中混勻后在40_56°C溫度下，置于1_2小 時(shí)，取出冷卻，并于0-20°C溫度下過夜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法，其特征是人血丙種球蛋白 的聚苯乙烯膠乳的制備方法為1) 930ml的將所述的甘氨酸緩沖液中加入空白聚苯乙烯膠乳液IOml和0. 5%人血 丙種球蛋白60ml，混勻后，放置于37°C 1小時(shí)，并不時(shí)攪拌混勻，得到制備液；2)取出步驟一所述的制備液，以2，000-5000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心30分鐘到1個(gè)小時(shí)；3)棄去離心上清液，沉淀物用IOOOml所述的甘氨酸緩沖液攪拌均勻后，再次以 2，000-5000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心30分鐘到1個(gè)小時(shí)；4)再棄去離心上清液，沉淀物中加入含有0.3%牛血清白蛋白的甘氨酸緩沖液 1000ml。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法，其特征是所述的甘氨酸緩 沖液為每IOOOml水中加入15g甘氨酸、17g氯化鈉和0. 5g氫氧化鈉。每批配置好的致敏乳膠液先要用已知滴度的標(biāo)本做對(duì)照檢測(cè)，如結(jié)果一致證明致 敏乳膠合格，所述的甘氨酸緩沖液為每IOOOml水中加入15g甘氨酸、17g氯化鈉和0. 5g氫 氧化鈉。對(duì)本發(fā)明所述的類風(fēng)濕因子進(jìn)行了臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)，設(shè)立正常健康人組390例 ’類 風(fēng)關(guān)組500例；其它風(fēng)濕病組122例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)凝集出現(xiàn)在1 40稀釋度以下者為 陰性，凝集顯現(xiàn)在1 40稀釋度以上者判為陽(yáng)性，類風(fēng)關(guān)組靈敏度為80.7%，其中早期類風(fēng) 關(guān)滴度范圍大多在1 40至1 160;中期類風(fēng)關(guān)其滴度在1 320至1 1280 ；晚期類 風(fēng)關(guān)滴度在1 1280以上，此外還發(fā)現(xiàn)患者類風(fēng)濕因子滴度變化與類風(fēng)關(guān)疾病活動(dòng)或緩解 有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)0. 69，其它風(fēng)濕病組陽(yáng)性率為27 %，特異性為73 %。本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果本發(fā)明所述的半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法與各種快速RF乳膠凝集技術(shù)(如玻片 法)相比，在標(biāo)本預(yù)處理、反應(yīng)載體、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等試驗(yàn)條件和環(huán)境方面有較大不 同，在56°C的溫度下滅能效果最好，其檢測(cè)靈敏度更高，最高滴度者可達(dá)1 20480，而其它 RF乳膠凝集技術(shù)陽(yáng)性滴度一般只能達(dá)到一比數(shù)千。另外在結(jié)果的穩(wěn)定性、重復(fù)性方面也有很好的特點(diǎn)，與酶標(biāo)、比濁等定量法相比，其試劑成本極為低廉，無(wú)需專門分析設(shè)備。本發(fā)明所述的半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法使用試管作為試驗(yàn)反應(yīng)載體，陰性和陽(yáng) 性非常清楚，陽(yáng)性呈顆粒狀沉淀，陰性呈均勻乳白色，分散分布。通過本發(fā)明所述的方法，根 據(jù)不同的檢測(cè)結(jié)果，為判斷患者的病程提供了參考依據(jù)，具有半定量作用。


圖1為凝集出現(xiàn)在1 40稀釋度以下的陰性對(duì)照；圖2為滴度為1 640的中期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測(cè)結(jié)果；圖3為滴度為1 10240的晚期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例本發(fā)明實(shí)施例的各項(xiàng)檢測(cè)方法如下吸取患者血清0. 05ml放入56°C水箱中滅能30分鐘，加pH 8. 2甘氨酸緩沖液 0.95ml，血清按1 20被稀釋。取出稀釋后的血清0. 25ml用甘氨酸緩沖液逐次對(duì)倍稀釋 成9種不同濃度。接著分別取出0.25ml的10種稀釋血清，加入0.25ml結(jié)合有人血丙種 球蛋白的聚苯乙烯膠乳，使得血清稀釋度分別1 40、1 80,1 160,1 320,1 640、 1 1280、1 2560、1 5120、1 10240 和 1 20480，于試管中混勻后置于 56°C 1 小時(shí)， 取出冷卻，并于4°C過夜。(見表1)表110種稀釋血清
權(quán)利要求
1.一種半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法，其特征如下1)將待測(cè)血清先于40-56°C溫度下，滅能10分鐘到1小時(shí)后，將甘氨酸緩沖液按1 20 對(duì)血清進(jìn)行稀釋，所得1 20的稀釋血清；2)取出所述的稀釋血清用甘氨酸緩沖液逐次對(duì)倍稀釋成9種不同濃度，依次為 1 40、1 80、1 160、1 320、1 640、1 1280、1 2560、1 5120 和 1 10240;3)分別取出相同體積的所述10種濃度的稀釋血清，分別加入等體積的結(jié)合有人血 丙種球蛋白的聚苯乙烯膠乳，使得血清稀釋度分別為1 40、1 80,1 160,1 320、 1 640、1 1280、1 2560、1 5120、1 10240 和 1 20480，即得 10 種稀釋血清 1 ；4)將所述的10種稀釋血清1稀釋于試管中混勻后在40-56°C溫度下，置于1-2小時(shí)， 取出冷卻，并于0-20°C溫度下過夜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法，其特征是人血丙種球蛋白的聚 苯乙烯膠乳的制備方法為1)930ml的將所述的甘氨酸緩沖液中加入空白聚苯乙烯膠乳液IOml和0.5%人血丙種 球蛋白60ml，混勻后，放置于37°C 1小時(shí)，并不時(shí)攪拌混勻，得到制備液；2)取出步驟一所述的制備液，以2，000-5000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心30分鐘到1個(gè)小時(shí)；3)棄去離心上清液，沉淀物用IOOOml所述的甘氨酸緩沖液攪拌均勻后，再次以 2，000-5000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心30分鐘到1個(gè)小時(shí)；4)再棄去離心上清液，沉淀物中加入含有0.3 %牛血清白蛋白的甘氨酸緩沖液 1000ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法，其特征是所述的甘氨酸緩沖液 為每IOOOml水中加入15g甘氨酸、17g氯化鈉和0. 5g氫氧化鈉。
全文摘要
一種半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法，待測(cè)的血清先經(jīng)40-56℃滅能后，按1∶20對(duì)血清進(jìn)行稀釋，然后取出稀釋后的血清再對(duì)倍稀釋成9種不同濃度，依次為1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120和1∶10240，接著分別取出相同體積的10種稀釋血清，加入等體積的致敏聚苯乙烯膠乳，于試管中混勻后置于40-56℃下1-2小時(shí)，取出冷卻，并于0-20℃溫度下。與玻片法相比，本方法檢測(cè)靈敏度更高，最高滴度者可達(dá)1∶20480。以試管作為反應(yīng)載體，陰性和陽(yáng)性非常清楚，陽(yáng)性呈顆粒狀沉淀，陰性乳白色，分散分布，具有半定量效果。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102004153SQ200910194749
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者周麗萍, 許榮, 鐘麗民, 馬海龍 申請(qǐng)人:上海市長(zhǎng)寧區(qū)光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院