專利名稱：檢測(cè)中期因子濃度的elisa試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)檢測(cè)方法， 具體為一種檢測(cè)樣本中中期因子濃度的ELISA方法。
背景技術(shù)：
中期因子(midkine， MK)是一個(gè)由121個(gè)氨基酸組成的分子量約為14kDa的堿性蛋白 質(zhì)，屬于肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族，最初是從胚胎癌細(xì)胞中篩選而得。對(duì)它的深入研究發(fā)現(xiàn)， 中期因子一般在人胚胎中期的肝、腎和大腦中高表達(dá)，在健康成人體內(nèi)表達(dá)極微弱，但在各 類癌癥患者包括食管癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等多種病變組織中又 可檢測(cè)到中期因子的強(qiáng)烈表達(dá)。此外，在很多類型的癌癥患者血液及尿液中也發(fā)現(xiàn)中期因子 的濃度升高，而且具有非常高的敏感性和特異性。中期因子在很多方面表現(xiàn)出與腫瘤發(fā)生相 關(guān)的活性，包括促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞增殖，促血管生成，抗腫瘤細(xì)胞凋亡和藥物作用等。 利用反義寡核苷酸鏈抑制它的表達(dá)能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這些研究結(jié)果表明中期因子在 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和惡化過程中扮演著極為重要的角色。
ELISA已經(jīng)成為一種成熟的免疫分析方法，具有特異、靈敏和快速的特點(diǎn)，在臨床醫(yī)學(xué) 中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。因此，建立檢測(cè)中期因子的ELISA方法，在基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué) 檢測(cè)方面都有重要的應(yīng)用價(jià)值。
國(guó)內(nèi)目前尚無任何有關(guān)檢測(cè)中期因子濃度的方法或相關(guān)報(bào)道，更無相關(guān)專利。國(guó)外有兩 家公司生產(chǎn)檢測(cè)中期因子濃度的ELISA試劑盒產(chǎn)品，但成本都很高且操作繁瑣、費(fèi)時(shí)。國(guó)外 的試劑盒采用的方法如下兔抗人中期因子的多抗包被微孔板，加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與包被的 抗體孵育2小時(shí)，洗滌數(shù)次之后加入生物素標(biāo)記的抗人中期因子抗體，孵育l小時(shí)之后洗滌 數(shù)次，再加入鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP (辣根過氧化物酶)孵育1小時(shí)，再經(jīng)過洗滌之后加入 底物顯色。也就是每加入一種樣品或抗體都要經(jīng)過1~2小時(shí)孵育并洗滌，過程比較繁瑣、費(fèi) 時(shí)，而且價(jià)格很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)程序簡(jiǎn)便的檢測(cè)樣本中中期因子濃度的ELISA試劑盒及其 制備方法。
本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的首先構(gòu)建中期因子的原核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行中期因子 蛋白的表達(dá)和純化。用純化的中期因子蛋白免疫新西蘭大白兔制備兔抗人中期因子的多克隆 抗體。用商品化的鼠抗人中期因子單克隆抗體(上海我武生物技術(shù)有限公司，Mab-M052)包 被酶標(biāo)板，封閉后加入待檢樣品、兔抗人中期因子多抗與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗共孵育。
經(jīng)過徹底洗滌后加入底物TMB溶液反應(yīng)顯色，最后用硫酸終止反應(yīng)并在450nm處檢測(cè)吸光 度值。通過標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度和相應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，待檢樣品中中期因子的濃度就可 以通過它的吸光值并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到。
本發(fā)明檢測(cè)中期因子濃度的ELISA試劑盒包括以下組成
1、 包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液PBS，其成分為140mMNaCl， 2.7mMKCl， 10mMNa2HPO4， 1.8 mM KH2P04， pH值為7.4;
2、 洗滌液為含l%Tween-20的PBS，稱為PBST，其成分為PBS， l%Tween-20;
3、 封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS， 1%BSA;
4、 加樣緩沖液的成分為50mMTris-HCl， 0.5MKC1， 1%BSA， 0.05%Tween-20， pH值為8.4;
5、 反應(yīng)終止液成分為2MH2S04。
6、 包被到酶標(biāo)板上的抗體是鼠抗人MK單克隆抗體，其母液濃度為0.5 mg/ml，工作濃度為 5pg/ml，即稀釋100倍使用；
7、 兔抗人MK多克隆抗體，其母液濃度為1 mg/ml，工作濃度為10 ng/ml，即最終稀釋倍數(shù) 為100倍；
8、 辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體，其母液濃度為0.5 mg/ml，工 作濃度為0.5 pg/ml，即最終稀釋倍數(shù)為1000倍；
9、 大腸桿菌￡.c0//中原核表達(dá)并通過親和純化的His-MK， N端帶有6個(gè)His標(biāo)簽，其母液 濃度為400 ng/ml，可經(jīng)過不同倍數(shù)的稀釋而得到所需的不同濃度的MK標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明檢測(cè)中期因子濃度的ELISA試劑盒的使用步驟如下
1、 在酶標(biāo)板中加入PBS稀釋IOO倍的鼠抗人MK單克隆抗體，每孔100W， 4 'C包被24h;
2、 棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌2次，每次5min;
3、 每孔加入200W封閉液，37 。C封閉2h;
4、 重復(fù)步驟2);
5、 準(zhǔn)備樣品(標(biāo)準(zhǔn)品和未知濃度樣品如血清和尿液等，可作適當(dāng)稀釋)、兔抗人MK多抗 (最終稀釋度為100倍)和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(最終稀釋度為1000倍)的混合液，
稀釋于加樣緩沖液中，每孔加入10014， 37度2h;
6、 同步驟2)，洗滌6次；
7、 每孔加入100W TMB室溫反應(yīng)10-30min;
8、 每孔加入50W2MH2SO4終止反應(yīng)； 9 、在酶標(biāo)儀中測(cè)定OD45()值；
10、 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制四參數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線；
11、 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知濃度樣品的OD值就可計(jì)算出未知樣品中中期因子的濃度。 本試劑盒采用的是ELISA方法中檢測(cè)蛋白抗原比較常用的雙抗體夾心法，并對(duì)它進(jìn)行了
改良。以往常規(guī)的方法是加入樣品后經(jīng)過孵育再洗滌，再加入兔抗人MK多抗孵育、洗滌， 之后再加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗孵育、洗滌，這樣便要分別經(jīng)過三次的孵育與洗滌，使檢測(cè) 時(shí)間大大加長(zhǎng)。而在上面的步驟中不難看出在對(duì)傳統(tǒng)的方法進(jìn)行改良之后，其中最主要的特 別之處是將樣品、兔抗人MK多抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗按一定比例混合，共同與包被在 酶標(biāo)板孔中的鼠抗人MK單抗孵育，這樣將三步并作一步，節(jié)省了大量的時(shí)間，但這個(gè)步驟 的實(shí)現(xiàn)是需要對(duì)三者的最終使用濃度和比例進(jìn)行配比和優(yōu)化的，過多或過少的使用比例都有 可能導(dǎo)致得不到理想的結(jié)果。通過對(duì)不同濃度條件的摸索，在本試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0~20 ng/ml，兔抗人MK多抗工作濃度為10 pg/ml， HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗工作濃度為0.5 pg/ml， 在這個(gè)條件下，能夠在保證靈敏度的前提下達(dá)到將三步并作一步的目的，還能有效降低背景 值而得到較理想的結(jié)果。
本發(fā)明具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，與已有技術(shù)相比操作時(shí)間短，成本低。 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗 原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。 在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗 滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗 原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一 定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì) 的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地 放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。其中雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原的最 常用的方法。


圖1為中期因子ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中的一些術(shù)語(yǔ)與縮寫mAb:單克隆抗體，monoclonal antibody; pAb:多克隆抗 體，polyclonal antibody; BSA:牛血清白蛋白；Tween-20:吐溫20; IgG:免疫球蛋白G;
TMB:四甲基聯(lián)苯胺；OD:吸光度。
試劑配方-
1.緩沖液
包被緩沖液PBS (PH=7.4)
洗滌液PBST (含l%Tween-20的PBS)
封閉液為含1XBSA的PBS
加樣緩沖液(50 mM Tris-HCL+0.5 M KCL PH=8.4)+1 %BSA+0.05%Tween-20
反應(yīng)終止液2MH2S04。2. 抗體
鼠抗人MK單抗(0.5mg/ml) 兔抗人MK多抗(1 mg/ml) 羊抗兔IgGHRP (0.5 mg/ml)
3. 抗原
原核表達(dá)純化的His-MK， N端帶有6個(gè)His標(biāo)簽。
4. 酶標(biāo)板
Constar 8聯(lián)孔酶標(biāo)條
以下是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步描述。
1. 首先表達(dá)純化獲得中期因子蛋白，分別制備鼠抗人MK單抗和兔抗人MK多抗。
2. 然后對(duì)本發(fā)明的工作條件進(jìn)行優(yōu)化
1) 包被單抗母液濃度為0.5 mg/ml，工作濃度為5Pg/ml，即稀釋100倍；
2) 標(biāo)準(zhǔn)品為His-MK蛋白，標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液為PBS，標(biāo)準(zhǔn)品母液濃度為400 ng/ml， 標(biāo)準(zhǔn)品最高工作濃度為20 ng/ml，并從16 ng/ml開始做倍比稀釋至0.5 ng/ml做 標(biāo)準(zhǔn)曲線；
3) 兔抗人MK多抗母液濃度為1 mg/ml，工作濃度為10Pg/ml，即稀釋100倍；羊 抗兔IgG 二抗母液濃度為0.5 mg/ml，工作濃度為0.5化/ml，即稀釋1000倍；
3. 本發(fā)明實(shí)施的具體步驟如下
1) 在酶標(biāo)板中加入PBS稀釋IOO倍的鼠抗人MK單克隆抗體，每孔100W， 4 °C 包被24 h;
2) 棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌2次，每次5min;
3) 每孔加入20014封閉液，37'C封閉2h;
4) 棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌2次，每次5min;
5) 準(zhǔn)備樣品(標(biāo)準(zhǔn)品和未知濃度樣品如血清和尿液等，可作適當(dāng)稀釋)、兔抗人 MK多抗(最終稀釋度為100倍)和羊抗兔HRP二抗(最終稀釋度為1000倍) 的混合液，稀釋于加樣緩沖液中，每孔加入100W， 37度2h;
6) 棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌6次，每次5min;
7) 每孔加入100 Ml TMB室溫反應(yīng)10-30min;
8) 每孔加入50 14 2 M H2S04終止反應(yīng)；
9) 在酶標(biāo)儀中測(cè)定OD450值；
10) 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制四參數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖1);
11) 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知濃度樣品的OD值就可計(jì)算出未知樣品中中期因子的濃度。
權(quán)利要求
1、檢測(cè)中期因子濃度的ELISA試劑盒，其特征在于包括以下組成(1)包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，其成分為140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH值為7.4；(2)洗滌液為含1％Tween-20的PBS，其成分為PBS，1％Tween-20；(3)封閉液為含1％BSA的PBS，其成分為PBS，1％BSA；(4)加樣緩沖液的成分為50mM Tris-HCl，0.5 M KCl，1％BSA，0.05％Tween-20，pH值為8.4；(5)反應(yīng)終止液成分為2 M H2SO4；(6)包被到酶標(biāo)板上的鼠抗人MK單克隆抗體母液，濃度為0.5mg/ml；(7)兔抗人MK多克隆抗體母液，濃度為1mg/ml；(8)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體母液，濃度為0.5mg/ml；(9)大腸桿菌E.coli中原核表達(dá)并通過親和純化的His-MK，N端帶有6個(gè)His標(biāo)簽，其母液濃度為400ng/ml。
2、如權(quán)利要求1所述檢測(cè)中期因子濃度的ELISA試劑盒的使用方法，其特征在于以下步驟(1) 在酶標(biāo)板中加入PBS稀釋IOO倍的鼠抗人MK單克隆抗體，每孔100W，4 'C包被24小 時(shí)；(2) 棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌2次，每次5分鐘；(3) 每孔加入200 14封閉液，37 'C封閉2小時(shí)；(4) 棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌2次，每次5分鐘；(5) 將待檢樣品、100倍稀釋的兔抗人MK多抗和1000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗的 混合液，每孔加入100 14，置于37。C濕盒中孵育2小時(shí)；(6) 棄去孔中液體，在干凈的吸水紙上拍干，并用洗滌液洗滌6次，每次5分鐘；(7) 每孔加入100 W TMB室溫反應(yīng)10-30分鐘；(8) 每孔加入50 W2MH2S04終止反應(yīng)；(9) 在酶標(biāo)儀中測(cè)定OD450值；(10) 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件根據(jù)測(cè)定的值繪制四參數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線；(11) 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知濃度樣品的OD值計(jì)算待檢樣品中中期因子的濃度。
全文摘要
檢測(cè)中期因子濃度的ELISA試劑盒及其使用方法。試劑盒包括包被到酶標(biāo)板上的鼠抗人MK單克隆抗體；兔抗人MK多克隆抗體；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體；大腸桿菌E.coli中原核表達(dá)并通過親和純化的His-MK，N端帶有6個(gè)His標(biāo)簽。其使用包括用商品化的鼠抗人中期因子單克隆抗體包被酶標(biāo)板，封閉后加入待檢樣品、兔抗人中期因子多抗與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗共孵育；經(jīng)過徹底洗滌后加入底物TMB溶液反應(yīng)顯色，最后用硫酸終止反應(yīng)并在450nm處檢測(cè)吸光度值。通過標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度和相應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，待檢樣品中中期因子的濃度就可以通過它的吸光值并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101201359SQ20071016037
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月18日
發(fā)明者董豪杰, 虞潤(rùn)六, 許正平 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)