孔約四個的速率捕獲并且鑒別標(biāo)記物實體。所述納米孔陣列每個通 道每秒讀取約30，000個標(biāo)記物實體，每個通道每分鐘讀取約18，000，000個標(biāo)記物實體，或 每個通道在一小時中讀取約108，000，000個標(biāo)記物實體。
[01化]實施例8:快速分子感測
[0187] 在96孔板上提供珠粒，使得各孔具有捕獲一個標(biāo)記物的珠粒。由一個樣品產(chǎn)生的 標(biāo)記物具有獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)，所述位點(diǎn)允許其結(jié)合于特異性珠粒?？膳渲脴?biāo)記物的混合物， 使得對于各珠粒來說，可結(jié)合八個不同標(biāo)記物。剩余標(biāo)記物具有用于其它珠粒的結(jié)合位點(diǎn)。 產(chǎn)生完整標(biāo)記物混合物，使得僅8個標(biāo)記物被允許用于各不同珠粒。在運(yùn)個實施例中，關(guān)于 各珠粒存在8個標(biāo)記物并且關(guān)于被分成每孔8個一組的768個獨(dú)特標(biāo)記物存在96個珠粒。
[0188] 樣品溶液依序暴露于各孔，在各暴露之后將磁性珠粒吸引至所述孔的底部并且移 動所述樣品溶液至下一孔用于暴露。標(biāo)記物的集合可分開使用此處所述的納米孔檢測技術(shù) 進(jìn)行檢測。可執(zhí)行空間上分開所述珠粒W允許獨(dú)立集合標(biāo)記物的其它方法(例如，珠粒連續(xù) 地暴露于一種含有標(biāo)記物的溶液，或珠粒在空間上定位于納米孔陣列忍片上的已知位置 處)。
[0189] 所述96孔板的各孔中的標(biāo)記物的集合可從珠粒融化掉或留在珠粒上并且流動通 過納米孔檢測器忍片上的通道。所述標(biāo)記物在流槽中檢測之后可從流槽沖走，并且可加載 附接于不同的珠粒的下一個不同的標(biāo)記物集合且檢測或計數(shù)。珠粒和標(biāo)記物的完全沖洗可 由所述珠粒的磁性特性輔助。應(yīng)用磁引力W及液體洗涂力可幫助確保流槽中幾乎所有標(biāo)記 物的完全沖洗。
[0190] 雖然本文已經(jīng)展示并且描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)顯 而易見，所述實施方案僅舉例提供。多種變化、改變和取代現(xiàn)將由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員想 到，而不偏離本發(fā)明。應(yīng)了解，本文所述的本發(fā)明的實施方案的各種替換方式可用于實踐本 發(fā)明。預(yù)期W下權(quán)利要求書界定本發(fā)明的范圍并且由此涵蓋在運(yùn)些權(quán)利要求書和其相等物 的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于分子計數(shù)和/或分選的方法，所述方法包括： a. 提供納米孔的陣列，其中所述陣列的個別納米孔可通過鄰近感測電極單獨(dú)尋址； b. 提供多個各自包含核苷酸的標(biāo)記物，其中所述核苷酸中的至少兩種與核酸樣品雜 交，并且其中所述標(biāo)記物能夠由所述個別納米孔捕獲并且使用所述感測電極鑒別;和 c. 用所述納米孔的陣列以每秒每個納米孔至少約1個標(biāo)記物的速率捕獲并且鑒別所述 標(biāo)記物。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述感測電極以法拉第模式操作。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述感測電極以非法拉第模式操作。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸樣品來源于患者。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記物以每秒每個納米孔至少約四個標(biāo)記物的 速率被捕獲并且鑒別。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多個標(biāo)記物包含至少四種不同標(biāo)記物。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記物包含具有至少四種不同長度的尾端。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記物基于所述標(biāo)記物離開所述納米孔時的電 壓來鑒別。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括從所述納米孔釋放所述被捕獲的標(biāo)記物。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多個標(biāo)記物包含待分選的標(biāo)記物，其中所述待 分選的標(biāo)記物被捕獲、鑒別并且保持于所述納米孔中，并且其中除所述待分選的標(biāo)記物外 的標(biāo)記物被捕獲、鑒別并且從所述納米孔釋放。11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述待分選的標(biāo)記物成組釋放并且加以收集。12. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中當(dāng)待分選的標(biāo)記物的數(shù)目除以由所述納米孔捕獲 并且鑒別的標(biāo)記物的剩余數(shù)目的比率增加超過閾值時，所述待分選的標(biāo)記物成組釋放。13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括定量構(gòu)成標(biāo)記物的總數(shù)的不足約0.05 %的 標(biāo)記物。14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含每小時捕獲并且鑒別至少約1 百萬個標(biāo)記物。15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述速率為每小時至少約100百萬個標(biāo)記物。16. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述速率為每小時至少約10億個標(biāo)記物。17. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約8種不同 類型的標(biāo)記物。18. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約32種不 同類型的標(biāo)記物。19. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約100種不 同類型的標(biāo)記物。20. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約500種不 同類型的標(biāo)記物。21. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約500種不 同類型的標(biāo)記物22. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述納米孔的陣列被配置為具有多個能夠?qū)Σ煌瑯?品執(zhí)行所述方法的區(qū)域。23. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記物基于流動通過所述個別納米孔的電流 和/或所述標(biāo)記物離開所述納米孔時的電壓來鑒別。24. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記物各自包含附接于珠粒的單鏈核酸分子。25. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記物如下產(chǎn)生： a. 使第一探針與核酸樣品雜交； b. 使第二探針與鄰近于所述第一探針的所述核酸樣品雜交； c. 使所述第一探針接合于所述第二探針以產(chǎn)生組合探針；以及 d. 用附接于寡核苷酸的珠粒捕獲所述組合探針，其中所述寡核苷酸與所述組合探針雜 交。26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其進(jìn)一步包括確定所述核酸樣品中的核酸序列的拷貝 數(shù)變化。27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其進(jìn)一步包括檢測拷貝數(shù)的差異，所述差異小于或等于 約0.05% 〇28. 如權(quán)利要求25所述的方法，其進(jìn)一步包括定量所述核酸樣品中的相對RNA表達(dá)水 平。29. 如權(quán)利要求25所述的方法，其進(jìn)一步包括對所述核酸樣品執(zhí)行ELISA測定。30. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述第一探針包含約20個與約50個之間的核苷酸。31. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述第二探針包含約20個與約50個之間的核苷酸。32. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述第一探針包含生物素。33. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述珠粒為磁性的。34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其進(jìn)一步包括用磁場集中鄰近或接近于所述納米孔的 陣列的標(biāo)記物。35. -種用于分子計數(shù)和/或分選的方法，所述方法包括： a. 提供納米孔的陣列，其中所述陣列的個別納米孔可通過以非法拉第模式操作的鄰近 感測電極單獨(dú)尋址； b. 提供多個能夠由所述個別納米孔捕獲并且使用所述感測電極鑒別的標(biāo)記物；以及 c. 用所述納米孔的陣列以每秒每個納米孔至少約1個標(biāo)記物的速率捕獲并且鑒別所述 標(biāo)記物。36. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述標(biāo)記物以每秒每個納米孔至少約四個標(biāo)記物 的速率被捕獲并且鑒別。37. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述多個標(biāo)記物包含至少四種不同標(biāo)記物。38. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述標(biāo)記物包含具有至少四種不同長度的尾端。39. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述標(biāo)記物基于所述標(biāo)記物離開所述納米孔時的 電壓來鑒別。40. 如權(quán)利要求35所述的方法，其進(jìn)一步包括從所述納米孔釋放所述被捕獲的標(biāo)記物。41. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述多個標(biāo)記物包含待分選的標(biāo)記物，其中所述待 分選的標(biāo)記物被捕獲、鑒別并且保持于所述納米孔中，并且其中除所述待分選的標(biāo)記物外 的標(biāo)記物被捕獲、鑒別并且從所述納米孔釋放。42. 如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述待分選的標(biāo)記物成組釋放并且加以收集。43. 如權(quán)利要求41所述的方法，其中當(dāng)待分選的標(biāo)記物的數(shù)目除以由所述納米孔捕獲 并且鑒別的標(biāo)記物的剩余數(shù)目的比率增加超過閾值時，所述待分選的標(biāo)記物成組釋放。44. 如權(quán)利要求35所述的方法，其進(jìn)一步包括定量構(gòu)成標(biāo)記物的總數(shù)的不足約0.05 % 的標(biāo)記物。45. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含每小時捕獲并且鑒別至少約1 百萬個標(biāo)記物。46. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述速率為每小時至少約100百萬個標(biāo)記物。47. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述速率為每小時至少約10億個標(biāo)記物。48. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約8種不 同類型的標(biāo)記物。49. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約32種不 同類型的標(biāo)記物。50. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約100種 不同類型的標(biāo)記物。51. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約500種 不同類型的標(biāo)記物。52. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述納米孔的陣列被配置為具有多個能夠?qū)Σ煌?樣品執(zhí)行所述方法的區(qū)域。53. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述標(biāo)記物基于流動通過所述個別納米孔的電流 和/或所述標(biāo)記物離開所述納米孔時的電壓來鑒別。54. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述標(biāo)記物各自包含附接于珠粒的單鏈核酸分子。55. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述標(biāo)記物如下產(chǎn)生： d. 使第一探針與核酸樣品雜交； e. 使第二探針與鄰近于所述第一探針的所述核酸樣品雜交； f. 使所述第一探針接合于所述第二探針以產(chǎn)生組合探針；以及 g. 用附接于寡核苷酸的珠粒捕獲所述組合探針，其中所述寡核苷酸與所述組合探針雜 交。56. 如權(quán)利要求55所述的方法，其進(jìn)一步包括確定所述核酸樣品中的核酸序列的拷貝 數(shù)變化。57. 如權(quán)利要求56所述的方法，其進(jìn)一步包括檢測拷貝數(shù)的差異，所述差異小于或等于 約0.05% 〇58. 如權(quán)利要求55所述的方法，其進(jìn)一步包括定量所述核酸樣品中的相對RNA表達(dá)水 平。59. 如權(quán)利要求55所述的方法，其進(jìn)一步包括對所述核酸樣品執(zhí)行ELISA測定。60. 如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述第一探針包含約20個與約50個之間的核苷酸。61. 如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述第二探針包含約20個與約50個之間的核苷酸。62. 如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述第一探針包含生物素。63. 如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述珠粒為磁性的。64. 如權(quán)利要求63所述的方法，其進(jìn)一步包括用磁場集中鄰近或接近于所述納米孔的 陣列的標(biāo)記物。65. -種用于測序、計數(shù)和/或分選分子的方法，所述方法包括： a. 提供納米孔的陣列，其中所述陣列的個別納米孔可通過以非法拉第模式或法拉第模 式操作的鄰近感測電極單獨(dú)尋址； b. 提供多個磁吸珠粒，所述珠粒各自偶合于待使用所述納米孔的陣列測序、計數(shù)和/或 分選的多個分子中的分子； c. 用磁鐵集中在所述納米孔的陣列附近的磁吸珠粒；以及 d. 用所述納米孔的陣列測序、計數(shù)和/或分選所述分子。66. 如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述磁吸珠粒包含金屬。67. 如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述磁吸珠粒包含永磁材料。68. 如權(quán)利要求65所述的方法，其中在集中所述磁吸珠粒之前，所述磁吸珠粒的濃度為 至多100飛摩爾濃度。69. 如權(quán)利要求65所述的方法，其中在集中所述磁吸珠粒之前，所述磁吸珠粒的濃度為 至多10飛摩爾濃度。70. 如權(quán)利要求65所述的方法，其中靠近所述納米孔的陣列的所述磁吸珠粒的濃度通 過所述集中增加至少100倍。
【專利摘要】描述使用納米孔來捕獲和確定分子的身份的方法和設(shè)備。所述分子可使用大量的納米孔(例如，在1小時內(nèi)讀取180百萬個分子的132,000個納米孔)以平行方式快速地進(jìn)行計數(shù)、分選和/或分箱。分子的這種快速捕獲和讀取可用于捕獲探針分子或已經(jīng)產(chǎn)生以代表最初的難以檢測的分子或最初分子的部分的其它分子?？砂l(fā)生樣品分子或樣品分子的代用品的精確計數(shù)。在一些情況下，所述設(shè)備和方法捕獲特定分子或分子的代用品并且保持于所述納米孔中并且接著將其噴射于潔凈溶液中以類似于流式細(xì)胞儀執(zhí)行捕獲、分選和分箱功能。
【IPC分類】G01N33/566, C07H21/02
【公開號】CN105723222
【申請?zhí)枴緾N201480056841
【發(fā)明人】R.W.戴維斯
【申請人】吉尼亞科技公司
【公開日】2016年6月29日
【申請日】2014年10月23日
【公告號】CA2926138A1, US20150111779, WO2015061509A1