專利名稱：用于單個(gè)dna分子的直接測(cè)序的方法和系統(tǒng)的制作方法
用于單個(gè)DNA分子的直接測(cè)序的方法和系統(tǒng)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2008年12月11日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第61/121，809號(hào)的優(yōu)先權(quán)， 通過引用將其全文并入本文。
背景技術(shù)：
與利用Sanger雙脫氧測(cè)序方法的傳統(tǒng)的基于凝膠或毛細(xì)管的測(cè)序儀相比，通過大規(guī)模的平行化和小型化，DNA測(cè)序的處理能力已經(jīng)大大提高了，而測(cè)序的成本卻降低了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。數(shù)種出現(xiàn)的其它測(cè)序平臺(tái)可以有效地提高處理能力，并且甚至可以將DNA測(cè)序的成本再降低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，有望為我們提供所謂的$1000基因組測(cè)序技術(shù) (Rothberg, J. M. and Leamon, J. H. , Nat Biotechnol,26 ；1117-1124(2008) ；Schloss, JA., Nat Biotechnol,26 :1113-1115(2008) ；Shendure, J. and Ji, H. ， Nat Biotechnol, 26 1135-1145(2008))。$1000基因組技術(shù)的可行性有望使基因組學(xué)走出主要的測(cè)序中心，并步入個(gè)體研究人員的實(shí)驗(yàn)室。這將顯著改變生物醫(yī)學(xué)研究，使基因組、轉(zhuǎn)錄組、遺傳網(wǎng)絡(luò)等的綜合分析成為可能。盡管已經(jīng)取得巨大進(jìn)步，但是$1000基因組技術(shù)仍沒有被攻克。在一系列綜述中報(bào)道了基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)展中的最新進(jìn)展和巨大挑戰(zhàn) (Rothberg, J.M. and Leamon, J.H.，Nat Biotechnol，26 ； 1117-1124(2008) ；Schloss, J. Α. ， Nat Biotechnol,26 :1113—1115(2008) ；Branton, D. et al. ， Nat Biotechnol, 26 1146-1153(2008))。本發(fā)明提供了用于遺傳物質(zhì)測(cè)序的改進(jìn)方法，例如，用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用和生物醫(yī)學(xué)研究。公開的方法可以用于快速個(gè)性化醫(yī)學(xué)、遺傳診斷、病原體鑒定和生物圈中任何物種的基因組測(cè)序。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于快速DNA測(cè)序的組合物、方法、試劑盒和系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，將感應(yīng)器設(shè)置到聚合酶分子的表面，用于監(jiān)測(cè)伴隨每種堿基類型的并入而發(fā)生的細(xì)微的、但不同的構(gòu)象改變。利用F6rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)可以精確測(cè)定聚合酶1-10 埃的移動(dòng)。位于聚合酶上重要?dú)埢幍亩鄠€(gè)FRET對(duì)(或網(wǎng)絡(luò))可用來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)構(gòu)象改變 (比DNA合成速率快10倍)。感應(yīng)器能提供關(guān)于聚合酶的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的多個(gè)參數(shù)信息，這些信息隨后提供并入的每種堿基類型的特有識(shí)別。按照公開的方法，還能檢測(cè)到模板DNA上的化學(xué)修飾，例如甲基化。因此，本發(fā)明提供了標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含至少一個(gè)FRET 供體和至少一個(gè)FRET受體，其中所述FRET供體和FRET受體在DNA聚合酶上的位置能使得對(duì)于被DNA聚合酶并入新DNA鏈的每種不同核苷酸都會(huì)產(chǎn)生不同的FRET信號(hào)。所述FRET 供體和受體在DNA聚合酶上的位置能使得當(dāng)聚合酶將核苷酸添加到DNA新生鏈時(shí)，至少根據(jù)并入的堿基(A、C、G、T)而產(chǎn)生的不同的FRET信號(hào)。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)DNA聚合酶讀取(遇到)模板DNA上甲基化的核苷酸時(shí)，產(chǎn)生不同的FRET信號(hào)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)RET供體的位置距FRET受體的距離非常接近于Fikster半徑(R0)。例如，當(dāng)DNA聚合酶處于開放位置時(shí)，供體的位置距受體約1個(gè)F6rster半徑(Rtl)或在例如10、5、2. 5或1埃的FSrster半徑(Rq)內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，從DNA聚合酶的開放位置到關(guān)閉位置，F(xiàn)RET供體和FRET受體之間的距離改變至少1、2. 5、5、10或更多埃。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)RET供體和受體位于DNA聚合酶的溶劑可及表面上。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)RET供體和受體不干擾DNA聚合酶的活性。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)RET受體位于手指結(jié)構(gòu)域上，例如位于手指結(jié)構(gòu)域的溶劑可及表面上，并且FRET供體位于手掌或拇指結(jié)構(gòu)域(或者在DNA合成過程中保持相對(duì)靜止的另一結(jié)構(gòu)域)上，例如位于聚合酶的溶劑可及表面上。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)RET受體位于DNA聚合酶的拇指或手掌結(jié)構(gòu)域(或者在 DNA合成過程中保持相對(duì)靜止的另一結(jié)構(gòu)域)上，例如位于溶劑可及表面上，同時(shí)FRET供體位于手指結(jié)構(gòu)域上，例如位于手指結(jié)構(gòu)域的溶劑可及表面上。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶來源選自噬菌體、細(xì)菌和酵母。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是諸如雜合體的基因工程化的酶或來自商業(yè)來源的DNA聚合酶(例如，T7 DNA聚合酶、2.0 版測(cè)序酶Gequenase version 2. 0 ))。在某些實(shí)施方案中，聚合酶是RT 或RNA聚合酶，例如T7RNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，聚合酶是天然的或工程化的逆轉(zhuǎn)錄酶，例如莫洛尼猴白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)或Superscript III 逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)。DNA聚合酶的實(shí)例包括φ-29、Taq、T7、Klenow (大腸桿菌DNA聚合酶I大片段)和Bst大片段(來自嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶)。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶是φ-29,并且FRET供體和受體位于選自表1所公開的那些氨基酸位置，或位于表1所公開的氨基酸位置中的1、2、3、4或5個(gè)氨基酸中。在某些實(shí)施方案中，包括了多于一個(gè)表1所公開的FRET對(duì)。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶不是φ-29,但是FRET供體和受體位于與表1中所公開的φ-29的FRET供體和受體位點(diǎn)同源的位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^最佳結(jié)構(gòu)比對(duì)來確定所述同源位點(diǎn)，即DNA聚合酶結(jié)構(gòu)的比較。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)RET供體和受體兩者都包含熒光分子(例如，有機(jī)染料分子)。例如，供體和受體可以獨(dú)立地選自熒光素、青色素、羅丹明和Alexa系列染料(Life Technologies)和Atto系列染料(Atto-Tec GmbH)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)RET供體和受體兩者都包含熒光量子納米顆粒(例如，銀或金納米簇)。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)記的DNA聚合酶包含多于一個(gè)FRET供體、FRET受體或FRET 對(duì)(FRET供體和受體)。例如，可以將FRET網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)成使單個(gè)FRET供體能激發(fā)至少兩個(gè) FRET受體，其中每個(gè)受體都非常接近FRET供體。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)FRET對(duì)具有不同的標(biāo)記組。本發(fā)明提供了制備本文所述的標(biāo)記的DNA聚合酶的方法。本發(fā)明還包括制備如下所述的任何其它蛋白的方法其中用化學(xué)部分(例如，諸如熒光染料或生物素分子的標(biāo)記， 或PNA)標(biāo)記所選的位置處的至少一個(gè)殘基，或用具有或不具有化學(xué)部分的非天然氨基酸取代至少一個(gè)殘基。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟(i)鑒定(選擇)DNA聚合酶上的至少一個(gè)第一位置用于FRET供體標(biāo)記和DNA聚合酶上的至少一個(gè)第二位置用于 FRET受體標(biāo)記；和(ii)在每個(gè)所鑒定的(或所選的)位置處引入非天然存在的氨基酸，從而制備標(biāo)記的DNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，所述非天然存在的氨基酸在被并入時(shí)進(jìn)行標(biāo)記，而在其它實(shí)施方案中，所述非天然存在的氨基酸是在被并入蛋白之后進(jìn)行標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，所述第一位置處的非天然存在的氨基酸不同于所述第二位置處的非天然存在的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，所述非天然存在的氨基酸是被標(biāo)記的，例如用生物素、化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)(例如，與染料分子共價(jià)連接)或熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，所述非天然存在的氨基酸是通常不能在DNA聚合酶的該位置處發(fā)現(xiàn)的氨基酸， 即突變的氨基酸、取代的氨基酸或衍生氨基酸。在某些實(shí)施方案中，所述突變的氨基酸是具有反應(yīng)性側(cè)基的氨基酸，例如半胱氨酸或賴氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述引入步驟包括體外(即無細(xì)胞)DNA聚合酶的翻譯。在某些實(shí)施方案中，所述引入步驟包括DNA聚合酶的基于細(xì)胞的翻譯。在某些實(shí)施方案中，所述非天然存在的氨基酸是在DNA聚合酶翻譯之后用FRET供體或受體分子(例如熒光團(tuán))進(jìn)行標(biāo)記的，由此形成標(biāo)記的DNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，所述非天然存在的氨基酸包含在翻譯過程中直接引入DNA聚合酶中的FRET供體或FRET受體。在某些實(shí)施方案中，所述體外翻譯反應(yīng)包括以下步驟a)將編碼標(biāo)記的DNA聚合酶的多核苷酸序列(例如，mRNA)固定到基底上；b)在適于翻譯的條件下，使所述固定的多核苷酸相繼(分別)與兩種或更多種不同的翻譯反應(yīng)混合物接觸；c)在與每種不同的反應(yīng)混合物接觸的間隔，洗滌所述固定的多核苷酸；和d)重復(fù)步驟b)和c)，直到翻譯出DNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，所述體外翻譯反應(yīng)包括以下步驟a)將編碼標(biāo)記的DNA聚合酶的多核苷酸序列固定到基底上；b)在適于翻譯的條件下，使所述固定的多核苷酸與至少一種第一體外翻譯反應(yīng)混合物接觸；c)洗滌所述固定的多核苷酸；d)在適于翻譯的條件下， 使所述固定的多核苷酸與至少一種第二體外翻譯反應(yīng)混合物接觸，其中所述第一和第二體外翻譯反應(yīng)混合物是不同的；e)洗滌所述固定的多核苷酸；和f)重復(fù)步驟b)_e)，直到翻譯出DNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，將反應(yīng)混合物的至少某些個(gè)體組分單獨(dú)加至多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述洗滌步驟能有效地從多核苷酸去除反應(yīng)混合物的組分。在某些實(shí)施方案中，所述洗滌步驟能有效地從多核苷酸去除除了核糖體和tRNA之外的反應(yīng)混合物組分，所述核糖體和tRNA帶有與核糖體共價(jià)連接和結(jié)合(在P位點(diǎn)中)的新生多肽。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種第一體外翻譯反應(yīng)混合物選自(i)包含非天然的氨基酸并且不包含其它氨基酸的反應(yīng)混合物；和(ii)包含標(biāo)記的DNA聚合酶序列中除了非天然存在的氨基酸之外的所有氨基酸的反應(yīng)混合物。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種第二體外翻譯反應(yīng)混合物選自(i)包含非天然的氨基酸并且不包含其它氨基酸的反應(yīng)混合物；和(ii)包含標(biāo)記的DNA聚合酶序列中除了非天然存在的氨基酸之外的所有氨基酸的反應(yīng)混合物。在某些實(shí)施方案中，至少一種第一體外翻譯混合物選自(i)包含用氨基酸或非天然存在的氨基酸(例如標(biāo)記的或非天然的氨基酸)預(yù)載或活化(共價(jià)軛合)的僅一種 tRNA和體外翻譯所必需的所有其它組分(例如核糖體、GTP、延伸因子、終止釋放因子)的反應(yīng)混合物；和(ii)包含用其它天然遺傳編碼的19種氨基酸預(yù)載或活化(共價(jià)軛合)的所有種類tRNA和體外翻譯所必需的所有其它組分、但是不含(i)中氨基酸的tRNA分子的反應(yīng)混合物。在某些實(shí)施方案中，至少一種第二體外翻譯混合物選自(i)包含用氨基酸或非天然存在的氨基酸(例如標(biāo)記的或非天然的氨基酸)預(yù)載或活化(共價(jià)軛合)的僅一種 tRNA和體外翻譯所必需的所有其它組分(例如核糖體、GTP、延伸因子、終止釋放因子)的反應(yīng)混合物；和(ii)包含用其它天然遺傳編碼的19種氨基酸預(yù)載或活化(共價(jià)軛合)的所有種類的tRNA和體外翻譯所必需的所有其它組分、但是不含(i)中氨基酸的tRNA分子的反應(yīng)混合物。在某些實(shí)施方案中，利用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行所述體外翻譯。在某些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括含有基底的柱。在某些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括用于自動(dòng)遞送反應(yīng)組分和洗滌溶液的管、泵和閥。本發(fā)明提供了 DNA分子測(cè)序方法，其中所述方法包括以下步驟(i)使標(biāo)記的DNA 聚合酶與DNA模板接觸，其中所述DNA模板與引物雜交；(ii)在適于DNA聚合的條件下，添加DNA測(cè)序(合成)反應(yīng)混合物；和(iii)通過檢測(cè)標(biāo)記的DNA聚合酶所產(chǎn)生的FRET信號(hào)來檢測(cè)并入DNA新鏈中的每個(gè)核苷酸的種類，進(jìn)而對(duì)DNA分子進(jìn)行測(cè)序。在某些實(shí)施方案中，DNA測(cè)序反應(yīng)混合物中的至少某些個(gè)體組分是單獨(dú)添加的。本發(fā)明提供了 DNA分子測(cè)序方法，其中所述方法包括以下步驟(i)使標(biāo)記的RNA 聚合酶與DNA模板接觸，其中RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列被加入所述DNA模板中；(ii)在適于轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合的條件下，添加RNA測(cè)序(合成)反應(yīng)混合物；和(iii)通過檢測(cè)標(biāo)記的RNA聚合酶所產(chǎn)生的FRET信號(hào)來檢測(cè)并入RNA新鏈中的每個(gè)核苷酸的種類，進(jìn)而對(duì)DNA 分子進(jìn)行測(cè)序。在某些實(shí)施方案中，RNA測(cè)序反應(yīng)混合物中的至少某些個(gè)體組分是單獨(dú)添加的。本發(fā)明提供了 RNA分子測(cè)序方法，其中所述方法包括以下步驟(i)使標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄酶與RNA模板接觸，其中所述RNA模板與引物雜交；(ii)在適于逆轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合的條件下，添加RNA測(cè)序(合成)反應(yīng)混合物；和(iii)通過檢測(cè)標(biāo)記的RNA聚合酶所產(chǎn)生的FRET信號(hào)來檢測(cè)并入RNA新鏈中的每個(gè)核苷酸的種類，進(jìn)而對(duì)RNA分子進(jìn)行測(cè)序。在某些實(shí)施方案中，RNA測(cè)序反應(yīng)混合物中的至少某些個(gè)體組分是單獨(dú)添加的。在某些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記的DNA聚合酶(或RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)被固定在基底上，例如，以有序陣列固定在基底上。在某些實(shí)施方案中，所述DNA或RNA模板被固定在基底上，例如，以有序陣列固定在基底上。在某些實(shí)施方案中，引物包含修飾的核酸或核酸酶抵抗的肽核酸(PNA)。在某些實(shí)施方案中，DNA模板是環(huán)狀分子。在某些實(shí)施方案中，所述DNA或RNA模板與基底在多于一個(gè)位點(diǎn)連接。例如，模板的每一端都可以與基底連接(即錨定)。在某些實(shí)施方案中，模板是伸展的，每一端都與基底連接。在某些實(shí)施方案中，多于一種標(biāo)記的DNA聚合酶(或RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)用于對(duì)DNA分子的全長進(jìn)行測(cè)序。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括洗滌固定的DNA或RNA 模板，和重復(fù)步驟a)-c)。在某些情況下，在預(yù)定的時(shí)間之后(例如，在某些檢測(cè)事件或某一時(shí)間長度之后)，將第一標(biāo)記的DNA聚合酶(或RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)洗掉。在某些實(shí)施方案中，在DNA或RNA分子測(cè)序的過程中，使用、洗掉(去除)并更換數(shù)種標(biāo)記的DNA聚合酶(或RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)。本發(fā)明提供了用于實(shí)施所述公開方法的試劑盒和反應(yīng)混合物。在某些實(shí)施方案中，將所述試劑盒設(shè)計(jì)用于DNA分子測(cè)序，并且所述試劑盒包含標(biāo)記的DNA聚合酶并任選地包含用于測(cè)序的試劑(例如，核苷酸和緩沖液)。在某些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記的DNA聚合酶被固定在基底上。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括使用說明書。在某些實(shí)施方案中， 所述試劑盒包含DNA測(cè)序反應(yīng)混合物或其成分(例如，dNTP、鹽和緩沖液成分)。在某些實(shí)施方案中，將所述試劑盒設(shè)計(jì)用于RNA分子測(cè)序，并且所述試劑盒包含用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄酶和試劑，例如核苷酸和緩沖液。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于標(biāo)記DNA聚合酶的試劑盒，所述試劑盒包括編碼DNA聚合酶的多核苷酸和使用說明書。在某些實(shí)施方案中，所述多核苷酸被固定在基底上。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含至少一種體外翻譯混合物。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種體外翻譯混合物包含非天然存在的氨基酸并且不包含其它氨基酸。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種體外翻譯混合物包含除了非天然存在的氨基酸之外的所有氨基酸。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含tRNA。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含至少兩種FRET染料。在某些實(shí)施方案中，所述FRET染料是在單獨(dú)的、不透明的容器中， 以避免光褪色。本發(fā)明提供了用于實(shí)施本文所述方法的裝置和系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括標(biāo)記的DNA聚合酶和能夠檢測(cè)來自單個(gè)分子(S卩，模板多核苷酸)的FRET信號(hào)的光學(xué)裝置。在某些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括具有預(yù)制芯片的微加工的流通池、微流體技術(shù)、 溫度控制和用于檢測(cè)信號(hào)的成像窗口。在某些實(shí)施方案中，READS系統(tǒng)不包括標(biāo)記的DNA 聚合酶，但是包括光學(xué)裝置，并且任選地包括用于分析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)軟件。在某些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括固定在基底(例如，玻璃蓋玻片或硅酮陣列材料)上的標(biāo)記的DNA聚合酶。在某些實(shí)施方案中，所述光學(xué)裝置包括與具體FRET染料(例如，在所需波長內(nèi)發(fā)射的 FRET染料)一起使用的激光器和濾色片。在某些實(shí)施方案中，所述光學(xué)裝置包括落射熒光顯微鏡。在某些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括用于分析READS數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)和/或計(jì)算機(jī)軟件。附圖簡述

圖1 左圖在表面上具有FRET對(duì)/網(wǎng)絡(luò)的工程化的DNA聚合酶。顯示了兩對(duì)，但可以使用更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。右圖通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA合成的化學(xué)機(jī)械過程來進(jìn)行測(cè)序。假定的信號(hào)軌跡顯示隨著時(shí)間FRET對(duì)之間的距離改變。圖2 ㈧具有手指、手掌和拇指亞結(jié)構(gòu)域的右手型結(jié)構(gòu)。(B)具有催化能力的三元復(fù)合體中的 RB69 聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)(Franklin et al. (2001)Cell 105:657-67)。(C) 小溝中聚合酶和引物/模板間的特異性相互作用作為分子尺，保證堿基對(duì)之間合適的間隔。(D)酶上的殘基和模板/引物/核苷酸/活性位點(diǎn)中Mg2+之間的特異性相互作用。(E) 伴隨核苷酸的結(jié)合和并入而發(fā)生的大的構(gòu)象改變。除了(B)，所有其它圖均來自Stryer， Biochemistry 4- ed(生物化學(xué)，第四版).(1995) W. H. Freeman & Co。圖3 =DNA聚合酶的催化機(jī)制。Conf.構(gòu)象；Pol =DNA聚合酶；Pr 引物；Tpl =DNA 模板；dNTP 脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP或dTTP)中的一種；* 具有催化能力的轉(zhuǎn)換態(tài)復(fù)合體；PPi 無機(jī)焦磷酸鹽。在核苷酸并入的化學(xué)機(jī)械過程中發(fā)生不同構(gòu)象間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換。圖4 用于對(duì)單個(gè)分子的高速復(fù)色熒光成像的、具有微流體技術(shù)和TIRF的自動(dòng)化系統(tǒng)的示意圖。物體不是按比例繪制的。所有組件都由具有定制軟件包的計(jì)算機(jī)控制。圖5 自動(dòng)化高速成像軟件的示意圖。它是例如用C++編寫的模塊化設(shè)計(jì)。硬件是為了可移植性從實(shí)施中抽象出來的。圖6 通過固相載體上的自動(dòng)化循環(huán)式體外翻譯將多個(gè)FRET對(duì)并入聚合酶中的方
9法。圖7 與引物-模板DNA復(fù)合的CP-29DNA聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)。將以下亞結(jié)構(gòu)域以簡圖模型展示手指、手掌、拇指、外切核酸酶、Trai和TPR2。以條形顯示引物/模板DNA。利用程序 PyMOL (可在萬維網(wǎng)的 pymol.org 獲得)JfPDB ID:2PZS 文檔(Berman et al. (2007) EMBO J. 26 =3494-3505)用于生成該圖。圖8 :cp-29DNA聚合酶的“開放”和“關(guān)閉”形式的比較。左圖“開放”和“關(guān)閉”
形式的疊加。右圖突出顯示手指亞結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的Cd主鏈。圖9 :φ-29 DNA聚合酶的天然半胱氨酸和溶劑可及表面。(A) 7個(gè)天然的半胱氨酸及它們的位置。(B) φ-29 DNA聚合酶的溶劑可及表面的正視圖。(C) cp-29DNA聚合酶的溶劑可及表面的后視圖。半胱氨酸殘基顯示在空間填充模型(A)中。利用ChemBio3D Ultra 11. O(CambridgeSoft)生成該結(jié)構(gòu)。圖10 用于標(biāo)記CP-29DNA聚合酶的㈧手指、⑶拇指和(C)手掌亞結(jié)構(gòu)域的候選殘基。頂圖和底圖分別顯示了正視圖和后視圖。以空間填充模型顯示蛋白。用白色圓圈標(biāo)出候選標(biāo)記位點(diǎn)。標(biāo)有星號(hào)的殘基代表具有優(yōu)選取向的標(biāo)記位點(diǎn)。用PyMOL生成該結(jié)構(gòu)。圖11 =FRET的效率，表示為供體和受體間分離的函數(shù)。E = 1/[1+(R/R0)6] ；R0 供體-受體對(duì)在E= 時(shí)的F5rster半徑。該圖來自 Royet al (2008) Nat Methods 5:507-16。圖12 可構(gòu)建用于標(biāo)記FRET對(duì)的tp-29DNA聚合酶突變體的代表。㈧突變體E375G’ K240C的標(biāo)記位點(diǎn)分別位于手指和手掌亞結(jié)構(gòu)域；⑶突變體E37K’K553e的標(biāo)記位點(diǎn)分別位于手指和拇指亞結(jié)構(gòu)域；(C)突變體E375e’ K553C的標(biāo)記位點(diǎn)分別位于手指和拇指亞結(jié)構(gòu)域；(D)突變體Ε375ε’κ·的標(biāo)記位點(diǎn)分別位于手指和拇指亞結(jié)構(gòu)域。以簡圖模型顯示蛋白的開放和關(guān)閉形式，并以球形模型顯示標(biāo)記位點(diǎn)。用PyMOL生成圖。圖13 用于單個(gè)分子高速測(cè)序的系統(tǒng)。左具有化學(xué)機(jī)械納米感應(yīng)器的單個(gè)DNA 聚合酶的流通池和陣列。右具有4個(gè)照相機(jī)和4個(gè)激光器的成像系統(tǒng)。圖14 用于長DNA分子的錨定和伸展的微加工裝置。㈧總體設(shè)計(jì)。⑶用320V/ cm電場(chǎng)伸展的末端捕獲的DNA分子的全EMCXD熒光圖像。發(fā)明詳述READS綜述-第四代測(cè)序技術(shù)本發(fā)明提供單個(gè)DNA分子直接測(cè)序的方法。該方法被稱為READS基因組技術(shù) (READS 利用化學(xué)機(jī)械納米感應(yīng)器從單個(gè)分子進(jìn)行實(shí)時(shí)DNA測(cè)序)。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)當(dāng)每個(gè)堿基并入到從雜交到模板鏈上的引物延伸的新生鏈時(shí)DNA或RNA聚合酶的動(dòng)態(tài)構(gòu)象改變來確定DNA分子或RNA分子的序列。通過利用F5rster/熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)監(jiān)測(cè)一對(duì)熒光染料或納米顆?；驘晒馊玖匣蚣{米顆粒網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)相互作用，檢測(cè)由于一種堿基的并入而引起的DNA或RNA聚合酶動(dòng)態(tài)構(gòu)象改變的獨(dú)特標(biāo)志。FRET染料分子被連接到聚合酶蛋白或蛋白復(fù)合體表面上合適的殘基。這些殘基可以是具有合適官能團(tuán)的先存殘基，所述官能團(tuán)例如伯胺，羧酸酯或巰基，或可以通過蛋白質(zhì)工程將這些殘基引入聚合酶。利用配備了電子倍增電荷耦合裝置(EMCCD)和激光激發(fā)器的全內(nèi)反射顯微鏡可以高速平行檢測(cè)來自個(gè)體聚合酶的FRET信號(hào)?？梢酝ㄟ^多合電子束分裂器和濾色片分解不同波長的個(gè)體熒光信號(hào)并用兩個(gè)或更多個(gè)照相機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明允許單個(gè)DNA分子的高速和精確測(cè)序。可以在約幾分鐘內(nèi)對(duì)單個(gè)DNA分子中的數(shù)萬個(gè)堿基進(jìn)行有效地直接測(cè)序。本發(fā)明提供利用天然核苷酸的天然DNA聚合酶的速度和精確性。這是相對(duì)之前的技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，之前的技術(shù)依賴于熒光核苷酸并且需要可以識(shí)別和并入標(biāo)記的核苷酸的聚合酶。本發(fā)明平臺(tái)聯(lián)合了測(cè)序方法和高速成像系統(tǒng)，從而允許廉價(jià)且非常高速地對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明的測(cè)序技術(shù)提供以下優(yōu)勢(shì)(1)快速實(shí)時(shí)測(cè)序；( 單個(gè)分子直接測(cè)序；(3) 長且精確的讀??；(4)非常廉價(jià)和(5)能夠檢測(cè)基因組DNA上諸如甲基化的化學(xué)修飾，用于表觀基因組測(cè)序?；靖拍钤趫D1中示出。本發(fā)明的READS(利用化學(xué)機(jī)械納米感應(yīng)器的實(shí)時(shí)DNA測(cè)序)包含以下概念(1)伴隨每種堿基的結(jié)合和并入過程，DNA聚合酶經(jīng)歷特征性的和獨(dú)特的動(dòng)態(tài)構(gòu)
象改變。(2)利用FRET對(duì)可以精確地監(jiān)測(cè)并入過程中動(dòng)態(tài)構(gòu)象改變的小但獨(dú)特的差異(距離改變1-10埃)。(3)利用現(xiàn)有成像技術(shù)，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)來自單個(gè)DNA聚合酶上FRET對(duì)的熒光信號(hào) (比DNA合成速率快10倍)。FRET感應(yīng)器可以提供關(guān)于伴隨DNA合成的化學(xué)機(jī)械過程的聚合酶動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的多參數(shù)信息，提供了對(duì)于并入的每種堿基的獨(dú)特標(biāo)志。還可以檢測(cè)模板DNA上諸如甲基化的化學(xué)修飾。通常，C是甲基化的核苷酸。本發(fā)明的標(biāo)記的DNA聚合酶可以用于區(qū)別模板DNA鏈上未修飾的C和甲基化的C。讀取Me-C 的DNA聚合酶和讀取C的DNA聚合酶的構(gòu)象的細(xì)微差異可以產(chǎn)生不同的FRET信號(hào)。定義READS技術(shù)是指利用標(biāo)記的DNA聚合酶檢測(cè)新生DNA鏈中每個(gè)核苷酸的并入而進(jìn)行的實(shí)時(shí)DNA測(cè)序。 F0rster共振能量轉(zhuǎn)移(F6rster resonance energy transfer)(縮寫為 FRET)，也稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移，是描述兩個(gè)生色團(tuán)之間能量轉(zhuǎn)移的機(jī)理。最初處于電子激發(fā)態(tài)的供體生色團(tuán)(FRET供體)通過非輻射偶極-偶極耦合可以將能量轉(zhuǎn)移到通常距其IOnm以內(nèi)的受體生色團(tuán)(FRET受體)。當(dāng)FRET供體和受體接近時(shí)(參見圖11)，轉(zhuǎn)移到FRET受體的能量以光發(fā)射(能量)進(jìn)行檢測(cè)。因此，“FRET信號(hào)”是由來自受體的光發(fā)射產(chǎn)生的信號(hào)。"FRET對(duì)”是指FRET供體和FRET受體對(duì)。本文中，術(shù)語“熒光團(tuán)”、“染料”、“熒光分子”、“熒光染料”、“FRET染料”和類似術(shù)語是同義使用。“標(biāo)記的DNA聚合酶”是指包含至少一個(gè)FRET對(duì)的DNA聚合酶。FRET供體和受體分子通常共價(jià)連接到標(biāo)記的DNA聚合酶表面上的氨基酸上。DNA聚合酶共享普遍的機(jī)理和結(jié)構(gòu)，因此根據(jù)本發(fā)明可以設(shè)計(jì)和使用任意DNA聚合酶。DNA聚合酶沿3' —5'方向“讀取”模板，并沿5' —3'方向?qū)€(gè)體核苷酸(堿基)添加到新鏈。聚合酶需要引物的3' OH基團(tuán)來起始新DNA鏈的延伸。根據(jù)圖3所述的普遍機(jī)理添加個(gè)體核苷酸(dNTP或dATP、dCTP、dTTP、dGTP或A、C、Τ、G)。具體的堿基(A、 C、T或G)取決于模板DNA的序列，從而使得新堿基與模板鏈上的核苷酸通過Watson-Crick 相互作用雜交。DNA聚合酶在“開放”和“關(guān)閉”構(gòu)象之間循環(huán)。DNA聚合酶與引物-模板 DNA復(fù)合體一起時(shí)處于開放位置。一旦進(jìn)入的核苷酸到達(dá)活性位點(diǎn)，聚合酶循環(huán)到關(guān)閉位CN 102317471 A
說明書
8/31 頁 置。本文所用的術(shù)語“非天然存在的氨基酸”是指連接到(標(biāo)記有)FRET供體或受體的氨基酸，或連接到(標(biāo)記有)用于連接所述FRET供體或受體的接頭分子的氨基酸。該術(shù)語還指在DNA聚合酶的天然序列中在DNA聚合酶的指定位點(diǎn)非天然存在的氨基酸。例如， 非天然存在的氨基酸可以是具有反應(yīng)性側(cè)基的氨基酸，其取代了聚合酶上指定位點(diǎn)的天然的(天然存在的)氨基酸。在這種情況下，在單獨(dú)的步驟中將FRET染料連接到非天然存在的(或取代的或突變的)氨基酸。術(shù)語“新生鏈”是指參與聚合的DNA(或RNA)的新鏈。DNA聚合酶以模板鏈依賴模式首先將第一個(gè)個(gè)體核苷酸(堿基)添加到引物上，將第二個(gè)個(gè)體核苷酸添加到第一個(gè)添加的堿基上，將第三個(gè)個(gè)體核苷酸添加到第二個(gè)添加的堿基上等?！靶律辨溁颉靶隆辨?zhǔn)侵敢铩⒀娱L鏈和由DNA聚合酶聚合的DNA鏈。術(shù)語“反應(yīng)混合物”通常是指給定化學(xué)或生物過程所需的組分。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，“翻譯反應(yīng)混合物”包括氨基酸、tRNA、緩沖液等。同樣，DNA合成反應(yīng)混合物包括實(shí)施該反應(yīng)所必需的個(gè)體核苷酸、緩沖液等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，用于DNA 合成、轉(zhuǎn)錄和翻譯的反應(yīng)混合物是清楚表征的并且是可商購的。術(shù)語“DNA分子測(cè)序”指本文所述的READS技術(shù)。獲得DNA模板以及新的和互補(bǔ)的 DNA鏈的序列信息。因此，本文語境中術(shù)語DNA分子是指模板鏈和新合成的鏈。本文所用的“核酸”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”或語法等同詞表示共價(jià)連接在一起的至少兩個(gè)核苷酸(即，堿基)。術(shù)語“核苷酸”和“堿基”通常是指單個(gè)的單體(例如dNTP 或rNTP，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥嘌呤)。寡核苷酸長度通常為從約5、6、7、8、9、 10、12、15、25、30、40、50或更多個(gè)核苷酸任選地至約100個(gè)核苷酸。核酸和多核苷酸是任意長度的聚合物，包括更長的長度，例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10，000 等。本發(fā)明的核酸通常包含磷酸二酯鍵，但是在一些情況下，還包括可以具有替代主鏈以及肽核酸主鏈和連接的核酸類似物，所述替代主鏈包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或0-甲基氨基磷酸酯連接(參見Eckstein，Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach (寡核苷酸和類似物實(shí)踐方法)，Oxford University Press)。其他核酸類似物包括具有陽性主鏈、非離子主鏈和非核糖主鏈的那些核酸，包括描述于美國專利第 5，235，033 號(hào)和第 5，034，506 號(hào)以及 ASC Symposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds.第 6 禾口 7 章的那些核酸。 包含一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義中。因?yàn)槎喾N原因可以進(jìn)行核糖-磷酸主鏈的修飾，例如，為了增加這類分子在生理環(huán)境中或作為生物芯片上的探針時(shí)的穩(wěn)定性和半壽期?？梢援a(chǎn)生天然存在的核酸和類似物的混合物；可選地，可以產(chǎn)生不同核酸類似物的混合物以及天然存在的核酸和類似物的混合物。 術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白，，在本文可替換地使用，是指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，還適用于天然存在的氨基酸的聚合物、包含修飾的殘基的那些聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。 術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸功能類似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些
12氨基酸以及后續(xù)修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸酯和0-磷酸絲氨酸。 氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)機(jī)構(gòu)的化合物，例如，與氫、羧基、氨基和R基結(jié)合的α碳，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物可以具有修飾的R基(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)機(jī)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)， 但與天然存在的氨基酸功能類似的化合物。在本文中，可以用氨基酸的公知的三字母標(biāo)識(shí)或用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)所推薦的單字母符號(hào)表示氨基酸。同樣地，可以用核苷酸的公認(rèn)的單字母代碼表示核苷酸?！氨Ｊ匦托揎椀淖凅w”適用于氨基酸序列和核酸序列。對(duì)于具體的核酸序列，保守型修飾的變體是指編碼相同的或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或如果所述核酸不編碼氨基酸序列，則是指基本上相同或相關(guān)的(例如天然相鄰的)序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼大多數(shù)蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在由密碼子指定為丙氨酸的每個(gè)位置，可以將密碼子改變?yōu)樗龅牧硪粚?duì)應(yīng)密碼子而不改變編碼的多肽。這類核酸變異是“沉默變異”，其是保守型修飾變異中的一種。本文中，編碼多肽的每個(gè)核酸序列也描述所述核酸的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在某些語境中，可以修飾核酸中每個(gè)密碼子(除了 AUG和TGG，AUG通常是蛋氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，通常，在涉及表達(dá)產(chǎn)物而不涉及實(shí)際探針序列的情況下，編碼多肽的核酸的沉默變異隱含在所述序列中。對(duì)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在編碼序列中改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或一小部分氨基酸而對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白序列進(jìn)行的個(gè)別取代、缺失或添加是 “保守型修飾的變體”，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守型取代表是本領(lǐng)域公知的。這類保守型修飾的變體還包括并且不排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同系物和等位基因。以下氨基酸可以互相進(jìn)行保守型取代1) 丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4) 精氨酸(R)，賴氨酸⑷；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M) (參見，例如，Creighton, Proteins (1984))?！皹?biāo)記”或“可檢測(cè)的部分”是可通過光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其他物理方法檢測(cè)的組分。本文所用的術(shù)語標(biāo)記通常是指熒光標(biāo)記，例如，F(xiàn)RET供體或受體。標(biāo)記還可以包括，例如，諸如生物素的親和劑、化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)、電子致密劑、酶(例如， ELISA中常用的酶)或地高辛?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)任意已知的偶聯(lián)標(biāo)記的方法，例如，利用 Hermanson, Biocon.jugate Techniques (生物偶聯(lián)技術(shù))1996, Academic Press, Inc. , San Diego所描述的方法?！皹?biāo)記的氨基酸”通常是指連接到FRET染料(熒光分子)或連接到在單獨(dú)的步驟中用于連接FRET染料的接頭分子/連接物的氨基酸。短語“與…選擇性(或特異性)雜交”是指例如，在高嚴(yán)緊性條件下，分子僅與特定核苷酸序列進(jìn)行的結(jié)合、形成雙鏈體或雜交，該分子對(duì)所述特定核苷酸序列的親和力高于對(duì)其它核苷酸序列(例如，總胞內(nèi)或文庫DNA或RNA)的親和力。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，核苷酸之間的特異性雜交通常依賴于互補(bǔ)核苷酸序列之間的Watson-Crick配對(duì)鍵合。本文所用的術(shù)語“探針”或“引物”被定義為如下所述的一個(gè)或多個(gè)核酸片段所述一個(gè)或多個(gè)核酸片段與樣品的特異性雜交是可檢測(cè)的。根據(jù)探針或引物將被用于的具體技術(shù)，其可以是任意長度的。例如，引發(fā)DNA聚合酶反應(yīng)(例如，PCR)的引物長度通常為 10-40個(gè)核苷酸，而用于例如Southern印跡的核酸探針的長度可以是幾百個(gè)核苷酸。引物可以是未標(biāo)記的或如下所述進(jìn)行標(biāo)記的，從而可以檢測(cè)其與靶標(biāo)或模板的結(jié)合。固定在靶元件上的核酸的長度和復(fù)雜度對(duì)本發(fā)明不重要。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以調(diào)整這些因素以提供最佳雜交條件。探針或引物還可以被固定在固相表面上(例如，硝化纖維、玻璃、石英、熔融石英載玻片)，例如以陣列的形式。在某些實(shí)施方案中，探針可以是例如WO 96/17958中所述的核酸的陣列的一員。為此目的，還可以使用能夠產(chǎn)生高密度陣列的技術(shù)(參見，例如，F(xiàn)odor (1991) Science 767-773 Johnston (1998) Curr. Biol. 8 :R171-R174 ； Schummer(1997)Biotechniques 23 :1087-1092 ；Kern(1997)Biotechniques 23 :120-124 ； 美國專利第5，143，邪4號(hào))。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以將具體探針的確切序列修飾至一定程度，但仍保留與其所來源的探針相同的與同一靶標(biāo)或樣品特異性結(jié)合(即，特異性雜交)的能力。 “流動(dòng)池”或“流動(dòng)通道”是指可以容納流體流或氣體流的結(jié)構(gòu)中的凹陷?！皩?duì)照”樣品或值是指作為用于與測(cè)試樣品進(jìn)行比較的參照(通常是已知參照)的樣品。例如，測(cè)試樣品可以是未知序列而對(duì)照是已知序列。在某些實(shí)施方案中，測(cè)試樣品可以包括具有未測(cè)試的FRET對(duì)的聚合酶而對(duì)照聚合酶包含已知FRET對(duì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在給定的情況下哪種對(duì)照是有用的并且可以基于與對(duì)照值的比較來分析數(shù)據(jù)。對(duì)照可用于確定數(shù)據(jù)的顯著性。例如，如果在對(duì)照中給定參數(shù)的值廣泛變化，則測(cè)試樣品中的變化將不會(huì)認(rèn)為是顯著的?；局亟M方法本發(fā)明提供克隆多核苷酸(例如用于表達(dá)為蛋白)的常規(guī)方法。如下所述，本發(fā)明的多核苷酸序列包括編碼DNA和RNA聚合酶的那些多核苷酸序列、模板多核苷酸序列(例如，待測(cè)序的基因組片段)、引物和接頭分子。公開了重組遺傳學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一般方法和技術(shù) WSSlB-zPIf^ll Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual ( ^ 子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))OOOl 年第 3 版)；Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual (基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)手冊(cè))(1990)；和 Ausubel et al，eds.，Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))(1994) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual (基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)手冊(cè))(1990)；和 Current Protocols in Molecular Biology (3 ^^^^^^ ^) (Ausubel et al., eds.，1994-1999)。通過體外擴(kuò)增方法可以獲得核酸，例如本文和Berger，Sambrook and Ausubel，以及 Mullis et al.，(1987)、美國專利第 4，683，202 號(hào)；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (PCR 流程方法和應(yīng)用指南)Qnnis et al.，eds)所述的那些方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)本發(fā)明的聚合酶進(jìn)行另外的修飾而不減弱它們的生物學(xué)活性?？梢赃M(jìn)行某些修飾來促進(jìn)克隆、表達(dá)或結(jié)構(gòu)域至融合蛋白的并入。這類修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并包括例如，在編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的任一末端添加密碼子，從而提供添加在氨基末端的蛋氨酸來提供起始位點(diǎn)，或提供位于任一末端的另外的氨基酸(例如，聚組氨酸)來方便地產(chǎn)生定位的限制性位點(diǎn)或終止密碼子或純化序列?？梢圆捎萌我庖阎漠a(chǎn)生多肽的基因工程方法獲得所需蛋白(例如，Morrison J. , J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983，101 :347-62)。例如，制備包含可表達(dá)形式(例如，與包括啟動(dòng)子在內(nèi)的調(diào)節(jié)序列可操作地連接)的編碼蛋白的多核苷酸的合適載體，將其轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中，然后培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞來產(chǎn)生蛋白?？梢岳萌我獬Ｓ玫膯?dòng)子，包括，例如SV40早期啟動(dòng)子(Rigby in Williamson(ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London,1982,83-141)、 EF-α 啟動(dòng)子(Kim et al. ,Gene 1990,91 :217-23)、CAG啟動(dòng)子(Niwa et al. ,Gene 1991， 108 :193) ,RSV LTR 啟動(dòng)子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152 :684-704)、SR α 啟動(dòng)子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 1988，8 :466)、CMV 即刻早期啟動(dòng)子(Seed et al.， Proc Natl Acad Sci USA 1987，84 :3365-9)、SV40 晚期啟動(dòng)子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982，1 :385-94)、腺病毒晚期啟動(dòng)子(Kaufman et al. ,MoI Cell Biol 1989， 9 :946)、HSV TK 啟動(dòng)子等。常見表達(dá)載體和宿主細(xì)胞是可商購的。根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法可以將表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中以表達(dá)所需序列，所述方法例如電穿孔(Chu et al. ,Nucleic Acids Res 1987，15 :1311-26)、磷酸鈣(Chen et al. ,Mol Cell Biol 1987，7 :2745-52)、DEAE 葡聚糖 (Lopata et al. ,Nucleic Acids Res 1984,12 :5707-17 ；Sussman et al. ,Mol Cell Biol 1985,4 :1641-3)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Derijard B, Cell 1994,7 :1025-37 ；Lamb et al.，Nature Genetics 1993,5 :22-30 ；Rabindran et al.，Science 1993，259 :230-4)等。還可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外產(chǎn)生蛋白(或其片段)。這類系統(tǒng)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的并是可商購的(例如，來自Ambion ^ Proteinscript II 或來自Invitrogen的 Expressway 或來自Promega的TNT⑧系統(tǒng)或來自Roche的RTS )。還可以使用利用修飾的tRNA分子和tRNA合成酶的基于細(xì)胞的方法。這類技術(shù)包括ReCodeTM(可從Ambryx Biotechnologies獲得)并描述于，例如，美國專利第7，083，970號(hào)和第7，045，337號(hào)。
READS技術(shù)和FSrster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)DNA聚合酶具有精密的3-D感應(yīng)器，其具有的原子分辨力可以高保真且高速地合成非常長的DNA分子。精密的蛋白質(zhì)工程技術(shù)比利用半導(dǎo)體技術(shù)的納米構(gòu)建更容易、更劃算且更易行。READS不需要熒光標(biāo)記的核苷酸。因此，熒光核苷酸所導(dǎo)致的背景不是問題。利用高性能的光學(xué)和成像技術(shù)，可以將剩余的背景(例如，因拉曼散射和瑞利散射而產(chǎn)生的背景)降低到幾乎可忽略的水平。因此，對(duì)于在持續(xù)的時(shí)間對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行成像，如果需要可以計(jì)數(shù)每個(gè)單個(gè)光子。DNA聚合酶的DNA合成的常見催化機(jī)制在圖3示出。在步驟1中，引發(fā)的DNA模板與聚合酶的結(jié)合是快速的。該過程開始于聚合酶的手掌區(qū)與引物/模板之間的特異性相互作用，隨后是拇指亞結(jié)構(gòu)域的大幅運(yùn)動(dòng)，包圍引物/模板，并將引物上最后的3' -OH堿基置于聚合酶的活性位點(diǎn)(圖2B、C、D)。在步驟2中，dNTP擴(kuò)散到活性位點(diǎn)中并且隨后的dNTP的結(jié)合觸發(fā)了從開放位置的快速且巨大的構(gòu)象改變。手指結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)向活性位點(diǎn)，并形成封閉口袋，只有形狀合適的堿基對(duì)適于容納在該口袋中(圖2E)。這是關(guān)閉構(gòu)象。在步驟3中(限速步驟)，聚合酶和引物/模板/dNTP/2Mg2+復(fù)合體之間的進(jìn)一步相互作用促進(jìn)該復(fù)合體進(jìn)入具有催化能力的轉(zhuǎn)換態(tài)(Rottiwell and Waksman, Adv Protein Chem， 71 :401-440(2005) ；Rothwell et al.，Mol Cell,19 :345-355(2005) ；Stengel et al.， Biochemistry, 46 :12289-12297 (2007)) 在步驟4中，發(fā)生下述化學(xué)反應(yīng)引物的3' -OH 基通過SN2反應(yīng)攻擊進(jìn)入的dNTP的α磷酸基，導(dǎo)致新堿基的并入和焦磷酸鹽的產(chǎn)生。在步驟5中，復(fù)合體經(jīng)歷另一大的構(gòu)象改變。手指亞結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)回到開放構(gòu)象，同時(shí)釋放焦磷酸鹽，模板轉(zhuǎn)位，并且3' -OH再生用于另一輪的合成(持續(xù)式合成)或聚合酶復(fù)合體的解離 (分配式合成)。高保真度的實(shí)現(xiàn)是部分取決于堿基對(duì)之間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性，除進(jìn)入的堿基和模板堿基之間特異性的Watson-Crick氫鍵之外，酶活性位點(diǎn)起重要作用(McCulloch and Kunke 1, Cell Res, 18 :148-161(2008) ；Kool，Annu Rev Biochem,71 191-219 (2002)) 中間構(gòu)象被證實(shí)為作為早期檢查點(diǎn)，允許進(jìn)入的dNTP預(yù)覽模板，隨后當(dāng)堿基錯(cuò)配時(shí)快速排斥(Joyce et al.，Biochemistry, 47 :6103-6116 (2008)) 0根據(jù)動(dòng)力學(xué)觀點(diǎn)，合成的保真度由反應(yīng)的 k3/KM決定(由于步驟3是限速步驟，所以k。at可以由1^3近似估計(jì))(Tsai et al. , Anal Biochem(2008) ；Tsai and Johnson，Biochemistry，45 :9675_9687 (2006))。除了與過程相關(guān)的多種構(gòu)象改變之外，每個(gè)步驟都有特征性的動(dòng)力學(xué)性質(zhì) (krk5)，在本測(cè)序方法中檢測(cè)了這些性質(zhì)。每種DNA聚合酶對(duì)4種dNTP中的每一種都具有不同的KM。每種堿基的并入速率(k3)也對(duì)于每種不同的堿基類型也是特有的。因此，通過精確測(cè)量并入速率，我們可以在堿基并入時(shí)鑒定每個(gè)堿基。給定堿基類型的速率極可能是序列依賴性的，并因此可能輕微地改變，但這種改變小于不同堿基類型之間的差異。通過監(jiān)測(cè)每個(gè)堿基并入時(shí)伴隨的動(dòng)態(tài)構(gòu)象改變可以獲得整個(gè)過程的多參數(shù)信息。這會(huì)在由&決定的特有并入速率之外捕獲到與每種堿基類型的并入相關(guān)的其它特有特征。例如，模板上的堿基和DNA聚合酶之間的相互作用是大量且特異性的(參見，例如，圖2B)。例如由甲基化堿基的存在而引起的相互作用網(wǎng)絡(luò)的小的波動(dòng)可以改變聚合酶構(gòu)象和進(jìn)入的互補(bǔ)堿基的并入速率。自最初報(bào)道以來(Stryer and Haugland, Proc Natl Acad Sci USA, 58 719-726(1967) ；Haugland et al. ,Proc Natl Acad Sci USA，63 :23-30 (1969))，F(xiàn)RET 已經(jīng)演變?yōu)闇y(cè)量納米級(jí)別的生物分子和復(fù)合體的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)相關(guān)的距離改變的非常強(qiáng)大的工具，所述構(gòu)象動(dòng)力學(xué)包括蛋白折疊和酶結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)。FRET和其他熒光技術(shù)可以用于監(jiān)測(cè)DNA合成的構(gòu)象改變和動(dòng)力學(xué)(Stengel et al. , Biochemistry,46 :12289-12297(2007) ；Tsai et al. , Anal Biochem(2008) ；Tsai and Johnson, Biochemistry, 45 :9675-9687 (2006) ；Allen et al. , Protein Sci,17 401-408(2008) ；Rothwe 11 and Waksman, J Biol Chem, 282 :28884-28892 (2007)) 然而， 之前的測(cè)量是在大的分子組裝上進(jìn)行的。本技術(shù)依賴于單分子FRET。Eid et al. (Science 323 133-38 (2009))觀察到每個(gè)不同的核苷酸的不同平均脈沖寬度(等同于 k3) :dATP :132 士 22ms ；dCTP :91 士 19ms ；dGTP :117 士 14ms ；dTTP
1696士 10ms。對(duì)于每種dNTP，它們脈沖寬度測(cè)量的改變是大的，可能是由于這樣的事實(shí)DNA 合成反應(yīng)是在非常低濃度的dNTP下進(jìn)行的(<<KM)。根據(jù)本技術(shù)的DNA合成是在高濃度的核苷酸下進(jìn)行的(等于或稍大于Km)。使用目前的衍射極限光學(xué)，包括EMCCD (電子倍增電荷耦合器件)、PMT (光學(xué)倍增管)、APD(雪崩光敏二極管)在內(nèi)的成像感應(yīng)器以及諸如共聚焦顯微鏡和全內(nèi)反射(TIRF) 顯微鏡的成像技術(shù)，常規(guī)可以以高速和良好的信噪比對(duì)單個(gè)熒光分子進(jìn)行成像(Walter et al.，Nat Methods, 5 :475-489 (2008)) 單分子 FRET 的首次試驗(yàn)展示由 Ha et al.，Proc Natl Acad Sci USA，93 :6洸4_6268 (1996)報(bào)道。現(xiàn)在，單分子FRET是應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)工具， 所述應(yīng)用包括在單分子水平上研究蛋白折疊和酶構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的構(gòu)象改變(Schuler and Eaton, Curr Opin Struct Biol, 18 16-26 (2008) ；Tsai and Johnson, Biochemistry,45 9675-9687(2006) ；Hanson et al. , Proc Natl Acad Sci USA,104 18055-18060(2007)； Haas, Chemphyschem,6 :858-870(2005))。大多數(shù)有機(jī)染料分子在它們最終被光褪色之前可以輸出平均一百萬至三百萬個(gè)光子。深冷EMCCD照相機(jī)可以以良好的信噪比(S/N)檢測(cè)約100個(gè)光子。如果成像系統(tǒng)的光子收集效率是約10%，在單個(gè)染料分子被光褪色之前可以以良好的S/N對(duì)其進(jìn)行幾千次的測(cè)量。單分子研究中非常需要具有良好光穩(wěn)定性的染料分子。Alexa系列染料是可獲得的最亮且光穩(wěn)定性最高的有機(jī)染料中的一些。使用通過去除氧(例如使用葡萄糖氧化酶/ 過氧化氫酶系統(tǒng))和防止閃爍(例如使用Trolox)來防止光褪色的合適步驟，使用最新技術(shù)的的光學(xué)技術(shù)和感應(yīng)器可以對(duì)每個(gè)染料有效進(jìn)行高達(dá)100，000次測(cè)量。噪音的主要來源是拉曼散射和其它散射，其可通過限制照射量來限制。分開距離為R的供體和受體染料之間的Fdrster共振能量轉(zhuǎn)移的效率由E = I/ [1+(R/R0)6]給出，其中Rtl是供體-受體對(duì)的F5rster半徑，這時(shí)E= 1/2。對(duì)于某些常用的染料對(duì)(例如，Cy3-Cy5)，Rtl為約50-60 A。該距離相當(dāng)于DNA聚合酶的尺寸。FRET信號(hào)隨著距離的六次方而變化。如果供體-受體對(duì)位于Rtl附近，可以以最好的信噪比測(cè)量出 1 A-50 A的距離的小的改變。使用現(xiàn)有技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)單個(gè)FRET對(duì)的Ims平行成像或更快的平行成像。利用處于合適距離的一個(gè)或多個(gè)FRET對(duì)可以監(jiān)測(cè)大的和小的構(gòu)象改變，特別是手指亞結(jié)構(gòu)域和拇指亞結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變。此外，對(duì)于諸如Klenow和φ-29 DNA聚合酶的某些常見DNA聚合酶，體外DNA合成速率慢于100個(gè)堿基/秒，其中φ-29 DNA在32°C下的合成速率為約50-100個(gè)堿基/秒，而在4°C下低至5個(gè)堿基/秒。因此我們可將合成速率控制到50個(gè)堿基/秒，并使用2ms采集速率(500Hz)獲得每個(gè)并入堿基的10個(gè)FRET數(shù)據(jù)點(diǎn)。使用2X2圖像合并，1兆像素的 EMCCD照相機(jī)具有140幅/秒的讀取速率。設(shè)置4個(gè)照相機(jī)，照相機(jī)的聯(lián)合輸出量會(huì)是560 幅/秒。這可以給出足夠的FRET動(dòng)力學(xué)信息以得到每種堿基類型的指紋譜。如果需要可以將DNA合成速率降到20個(gè)堿基/秒。即使使用這個(gè)速度，可以在10分鐘之內(nèi)對(duì)10，000 個(gè)堿基長的DNA進(jìn)行測(cè)序。該技術(shù)將微陣列和納米陣列用于高效成像，例如，每個(gè)模板9像素(Barbee and Huang, Anal Chem,80 :2149-2154(2008)) 有了這樣的性能，可以在一個(gè)小時(shí)內(nèi)對(duì)人類基因組[(1，000, 000/9)^20*3600 = 72億個(gè)堿基]進(jìn)行測(cè)序。READS中使用的聚合酶DNA (和RNA)聚合酶是指導(dǎo)從個(gè)體堿基/核苷酸以模板特異性的方式合成DNA (和RNA)的分子馬達(dá)。結(jié)構(gòu)和酶學(xué)機(jī)制屬于幾乎所有蛋白中表征最清楚的，并且經(jīng)常用作酶催化和特異性的教科書范例。為簡單起見，我們關(guān)注使用DNA聚合酶的DNA合成和測(cè)序。然而，本發(fā)明的方法可以擴(kuò)展到使用RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶來檢測(cè)序列，即，按照對(duì)于DNA聚合酶所描述的那樣， 用FRET對(duì)標(biāo)記RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。所有DNA聚合酶具有由手指亞結(jié)構(gòu)域、手掌亞結(jié)構(gòu)域和拇指亞結(jié)構(gòu)域組成的共有結(jié)構(gòu)框架，有時(shí)還存在外切核酸酶亞結(jié)構(gòu)域(參見圖2)。盡管天然存在的多種DNA聚合酶的序列是多樣的，但是結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制擁有共同的特征(Rottiwell，P. J. and Waksman, G.， Adv Protein Chem，71 :401-440(2005) ；McCulloch, S. D. and Kunke1, Τ. Α.，Cell Res,18 148-161(2008))。DNA聚合酶的常見機(jī)制在上文解釋并在圖3中示出(Rottiwel 1，PJ. And Waksman,G.，Adv Protein Chern，71 :401-440(2005) ；McCulloch, S.D. and Kunke1, Τ.Α.， Cell Res,18 148-161(2008)) 如上文所解釋，DNA聚合酶按照普遍機(jī)制進(jìn)行工作。因此，任意聚合酶都可用于本文的READS技術(shù)。理想情況下，所選擇的聚合酶具有如下特征1.易于表達(dá)(例如，在大腸桿菌中和/或通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng))；2.具有強(qiáng)的鏈置換活性；3.具有高保真度和持續(xù)性；以及4.具有與引發(fā)的DNA模板的強(qiáng)結(jié)合親和力(S卩，對(duì)于模板結(jié)合非常小的Km)。根據(jù)測(cè)定設(shè)計(jì)，錯(cuò)誤校讀活性(即，外切核酸酶活性)可以是不希望的。外切核酸酶活性可以作用于引物，從而使聚合的起始復(fù)雜化。有至少兩種方式解決該問題(i)提供核酸酶抵抗的引物(例如，修飾的核酸或PNA)或(ii)使用具有降低的外切核酸酶活性的基因工程化的聚合酶。多種聚合酶可以用作本發(fā)明的標(biāo)記的聚合酶的至少一部分。至少五個(gè)DNA依賴性的DNA聚合酶家族是已知的，盡管大多數(shù)屬于A、B和C家族。大多數(shù)A家族聚合酶是單鏈蛋白，其可以包括多種酶學(xué)功能，包括聚合酶活性，3'至5'外切核酸酶活性和5'至3' 外切核酸酶活性。B家族聚合酶通常具有單一催化結(jié)構(gòu)域以及輔助因子，所述催化結(jié)構(gòu)域具有聚合酶活性和3'至5'外切核酸酶活性。C家族聚合酶通常是多亞基蛋白，其具有聚合活性和3'至5'外切核酸酶活性。在大腸桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三種DNA聚合酶DNA聚合酶I、 II和III (分別相當(dāng)于A、B和C家族)。在真核細(xì)胞中，三種不同的B家族聚合酶，即DNA 聚合酶α，δ和ε，參與核復(fù)制，而一種A家族聚合酶，即聚合酶Y，用于線粒體DNA復(fù)制。 其它類型的DNA聚合酶包括噬菌體聚合酶。這些聚合酶中的任意一個(gè)、這些聚合酶中所有或部分的組合以及這些聚合酶或其等同物中兩個(gè)或更多個(gè)之間的嵌合體或雜合體可用于形成本發(fā)明的雜合聚合酶的聚合酶結(jié)構(gòu)域的一部分或全部?？梢允褂玫腄NA聚合酶的實(shí)例包括但不限于φ-29、Taq, Τ7、大腸桿菌 Klenow(來自DNA聚合酶I)、大腸桿菌DNA聚合酶III和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Baccilus stearothermophilus) (Bst)DNA聚合酶。DNA聚合酶也可以是基因工程化的，例如，雜合體 (例如，融合DNA聚合酶，其中將具有強(qiáng)dsDNA結(jié)合親和力的結(jié)構(gòu)域融合到DNA聚合酶以增強(qiáng)持續(xù)性)。許多有用的DNA聚合酶是可商購的(例如，T7 DNA pol、2. 0 版測(cè)序酶)。高持續(xù)性聚合酶包括φ29和T7 DNA聚合酶和莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，DNA聚合酶是結(jié)構(gòu)上相似的，因此可以使用來自不同聚合酶的同源結(jié)構(gòu)域?qū)⒅亟M聚合酶和雜合聚合酶工程化。為方便起見，我們選擇了還具有大量可獲得的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)并且在其表面上有很少天然半胱氨酸殘基的聚合酶。在蛋白數(shù)據(jù)庫中(RCSB PDB)，有780條DNA聚合酶和DNA聚合酶/底物復(fù)合體的高分辨率結(jié)構(gòu)。此外，許多DNA聚合酶的機(jī)制已經(jīng)被深入研究并詳細(xì)地闡明。我們選擇φ 29DNA聚合酶是因?yàn)槠渚哂兴璧臉?biāo)準(zhǔn)?？色@得伴有和不伴有引物/模板/核苷酸底物時(shí)該聚合酶的高分辨率X射線晶體結(jié)構(gòu)(Berman et al. (2007)EMB0J. 26 3494-3505)。相對(duì)于其它常用DNA聚合酶，φ-29 DNA聚合酶具有非常高的保真度(一百萬個(gè)堿基中少于1個(gè)錯(cuò)誤)、強(qiáng)的鏈置換活性和高的持續(xù)性。φ 29 DNA聚合酶的DNA合成的化學(xué)機(jī)械過程中涉及的構(gòu)象改變是已知的。Berman et al.解析了φ 29 DNA聚合酶復(fù)合體的四種晶體結(jié)構(gòu)，包括(1)轉(zhuǎn)位后狀態(tài)中與引物-模板底物結(jié)合的聚合酶(二元復(fù)合體)(圖 3f) ； (2)在下一個(gè)進(jìn)入的核苷酸與聚合酶結(jié)合之前的狀態(tài)中與引物-模板底物結(jié)合的聚合酶(二元復(fù)合體)(圖北)；(3)與具有互補(bǔ)的進(jìn)入的核苷酸的兩個(gè)不同引物-模板結(jié)構(gòu)結(jié)合的聚合酶(三元結(jié)構(gòu))(圖3c和/或圖3d) ； (4)與單鏈DNA結(jié)合的聚合酶(圖3g)。READS中使用的標(biāo)記和染料多種染料可被用作FRET供體和受體(綜述可參見Walter et al. (2008)Nat Methods 5 :475-89 ；Ha(2001)Methods 25 :78-86 ;Joo et al. , (2008)Ann. Rev. Biochem 77 :51-76 ；Roy et al.，(2008)Nat Methods 5 :507-16)。理想的染料是1.光穩(wěn)定的；2.亮的(具有高的吸收消光系數(shù)和高發(fā)射量子產(chǎn)額)；3.光化學(xué)上均勻的，在我們測(cè)量的時(shí)間尺度上顯示極小的發(fā)射波動(dòng)(不閃爍)；4.小的(使結(jié)構(gòu)干擾最小化)；以及5.可以使用可獲得的光源進(jìn)行激發(fā)以及可以使用商購EMCCD照相機(jī)進(jìn)行檢測(cè)?？梢允褂枚喾N染料，并且這些染料是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。最常用的染料是熒光素、花青素染料(Cy3至Cy7)、羅丹明染料(例如羅丹明6G)、Alexa系列染料(Alexa 405至Alexa 730)。這些染料中的一些已經(jīng)用于FRET網(wǎng)絡(luò)(具有多個(gè)供體和受體)。用于成像所有這些染料的光學(xué)技術(shù)需要從UV到接近頂?shù)臋z測(cè)(例如Alex 405至Cy7)以及Atto系列染料(Atto-Tec GmbH)的檢測(cè)。來自hvitrogen的Alexa系列染料覆蓋全光譜范圍。它們比其它染料更亮并且光穩(wěn)定性更高。用于FRET標(biāo)記的染料對(duì)的實(shí)例包括Alexa-405/Alex_488、Alexa-488/ Alexa-546、Alexa_532/Alexa_594、Alexa-594/Alexa_680、Alexa-594/Alexa_700、 Alexa-700/Alexa_790、Cy3/Cy5、Cy3. 5/Cy5. 5和羅丹明綠/羅丹明紅等。還可以使用諸如銀和金納米簇的熒光金屬納米顆粒(Richards et al.，(2008) J Am Chem Soc 130 5038-39 ；Vosch et al. , (2007)Proc Natl Acad Sci USA 104 :12616-21 ；Petty and Dickson (2003) J Am Chem Soc 125 :7780-81)。盡管這些納米粒具有良好的光穩(wěn)定性，但它們比其它染料更大并且能干擾DNA聚合酶的功能。濾色片、二色鏡、分色鏡和激光器影響染料的選擇。在我們的實(shí)例中，我們選擇了 Alexa 405、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 568 和 Alexa 680，開始時(shí)使用一對(duì)或兩個(gè)獨(dú)立的對(duì)。可以激發(fā)高效有機(jī)染料分子使其在被光褪色之前發(fā)射一百萬至三百萬個(gè)光子。因此單分子研究需要高度光穩(wěn)定的染料。Alexa系列染料是可獲得的最亮且光穩(wěn)定性最高的染料中的一些。去除氧(例如使用葡萄糖氧化酶過氧化氫酶系統(tǒng))和防止閃爍(例如使用 Trolox)會(huì)降低光褪色，從而可以獲得約100，000次測(cè)量。標(biāo)記位點(diǎn)的選擇另一問題是選擇聚合酶上用FRET染料標(biāo)記的殘基。在最簡單的模型中，用一個(gè) FRET對(duì)(即，一個(gè)供體和一個(gè)受體)標(biāo)記聚合酶，但是改進(jìn)的儀器可以允許另外的FRET對(duì)和更精密的檢測(cè)。每個(gè)堿基的并入中涉及的5個(gè)步驟中的2個(gè)產(chǎn)生非常大的構(gòu)象改變步驟2和 5(參見圖；3)。其他步驟涉及蛋白結(jié)構(gòu)中更細(xì)微的改變。在最簡單的情況下，如果每種堿基具有可區(qū)別的構(gòu)象改變動(dòng)力學(xué)時(shí)，來自一個(gè)FRET對(duì)的實(shí)時(shí)信號(hào)(強(qiáng)度表示為與時(shí)間的函數(shù)，參見圖1)足以解碼四種不同堿基。例如，如果每種堿基的& (限速步驟)之間的差異足夠大，則能觀察到FRET對(duì)的信號(hào)軌跡中的特征性時(shí)段。如果與每中不同堿基相關(guān)的特征性構(gòu)象改變是細(xì)微的和/或依賴于序列情況，則可以使用FRET對(duì)的多個(gè)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)本文所述的標(biāo)準(zhǔn)，可以明確選擇聚合酶上定位FRET對(duì)或網(wǎng)絡(luò)的位置。為了使細(xì)微改變的檢測(cè)最大化，F(xiàn)RET對(duì)的位置的距離可以大體上等于供體和受體之間的FGrster 半徑。如圖11所示，分開距離為R的供體和受體染料之間的FSrster共振能量轉(zhuǎn)移的效率由E = i/[i+(RZR0)6]給出，其中Rtl是供體-受體對(duì)的Fdrster半徑，這時(shí)E = 1/2。對(duì)于某些常用的染料對(duì)(例如，Cy3-Cy5)，Rtl為約50-60 A?？梢允褂靡韵鹿焦浪闳我釬RET對(duì)的Foster半徑
F1Ilo6= 9 MO & If(K) ε (λ) X4 d λ
128m5 Naii4Na是阿伏伽德羅常數(shù)；η:折射率；FU)供體的熒光光譜，根據(jù)/ F(X)cU = 1 標(biāo)準(zhǔn)化；ε ( λ )受體的消光系數(shù)；λ 波長。因此，F(xiàn)RET信號(hào)按距離的六次方的函數(shù)反向變化。如圖11所示，斜率在R = Rtl時(shí)最陡。因此，如果供體-受體對(duì)位于R0附近，可以以最大的FRET信號(hào)改變來測(cè)量出1 A至 10 A的距離的小的改變。每種DNA聚合酶對(duì)于四種不同的核苷三磷酸(dATP、dACTP、dGTP、dTTP)中的每一種具有不同的親和力(即Km)和并入速率(由k3近似估計(jì)，圖3中步驟3)。每種不同dNTP 的并入速率提供最有價(jià)值的特征性標(biāo)志。因此，至少一個(gè)FRET對(duì)是設(shè)計(jì)用于以最大靈敏度監(jiān)測(cè)并入速率。選擇兩個(gè)殘基，其中在聚合酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)域上各選擇一個(gè)，使得當(dāng)兩個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象處于開放狀態(tài)和關(guān)閉狀態(tài)中間時(shí)(例如圖3中b和c之間或d和e之間)，供體和受體之間的距離等于它們的F^rster半徑?？梢愿鶕?jù)該依據(jù)來定位用于監(jiān)測(cè)任意具體聚合酶上任意具體構(gòu)象改變的FRET 對(duì)，從而提供最大的靈敏度和信噪比。遵循本文所述的原則，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以鑒定突變和標(biāo)記的可能靶點(diǎn)?？梢灾辽偻ㄟ^以下標(biāo)準(zhǔn)確定待用FRET對(duì)標(biāo)記的殘基
1.位于蛋白的溶劑可及表面；2.側(cè)鏈朝向溶劑的(從而確保標(biāo)記的可及性并最小化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和活性的干擾)；3.在DNA合成過程的步驟之間大幅運(yùn)動(dòng)；和4.相隔理想的距離從而給出FRET信號(hào)的最大改變。應(yīng)當(dāng)考慮染料的大小和連接物(如果存在的話)的長度來給出染料之間距離可能改變的近似值。如果使用接頭將染料分子與蛋白連接，則可能需要微調(diào)距離以避免過大的轉(zhuǎn)動(dòng)或側(cè)向移動(dòng)。用于將染料與氨基酸連接的連接物是已知的且可商購。這類連接物包括簡單的烷基改變(例如，丙基)、寡二醇(PEG)或具有諸如苯基或環(huán)己基的剛性更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)的連接物。連接的活性官能團(tuán)包括但不限于用于與-SH基(例如，半胱氨酸上的)特異性反應(yīng)的馬來酰亞胺和用于與伯胺特異性反應(yīng)的(例如，賴氨酸上的)NHS酯基。如果需要，可以利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，通過位點(diǎn)特異性誘變來突變選擇用于標(biāo)記的位點(diǎn)，并且可以在蛋白表達(dá)和折疊之后進(jìn)行標(biāo)記。φ-29 DNA聚合酶的示例性FRET對(duì)和標(biāo)記位點(diǎn)在實(shí)施例1中描述。。表1中公開的位置僅是實(shí)例，一些改變是可接受的。FRET供體和受體位點(diǎn)可以位于不同位置，只要它們大體上遵循本文公開的標(biāo)準(zhǔn)。例如，供體或受體的位置可以距表1中公開的位點(diǎn)1、2、3、4或 5個(gè)氨基酸。供體和受體位點(diǎn)也可以交換。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，通過優(yōu)化比對(duì)聚合酶結(jié)構(gòu)，公開的用于標(biāo)記φ-29 DNA聚合酶的位點(diǎn)可以用于其他DNA聚合酶。多種DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)是可獲得的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本文所述的標(biāo)準(zhǔn)來選擇合適的標(biāo)記位點(diǎn)(例如，溶劑可及的、活性位點(diǎn)外部等)。多種DNA聚合酶的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息可在NCBI結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫獲得(MMDB和PDB，可在 NCBI N f^ikU, N Jat ^ ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ？ db = Structure&itool = toolbar)。例如，BST DNA聚合酶I的結(jié)構(gòu)可見于NCBI結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB登錄號(hào)3EZ5和 3EYZ) ο大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段的結(jié)構(gòu)可見于PDB登錄號(hào)1KFD、IDPUI^Z 和IZM。來自釀酒酵母(S. cerevisae)的高保真度DNA聚合酶δ的結(jié)構(gòu)可見于PDB登錄號(hào)3ΙΑΥ。Taq DNA聚合酶I的結(jié)構(gòu)可見于PDB登錄號(hào)4KTQ。Τ7 DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)可見于 PDB登錄號(hào)2AJQ。使用這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，可以選擇具體DNA聚合酶上的位置，例如，選擇位置的溶劑可及性。使用已知結(jié)構(gòu)，可以選擇FRET供體和受體的位置使其互相接近(約1R。)，在DNA合成時(shí)接近的程度具有可檢測(cè)的改變。制備標(biāo)記的聚合酶的方法可以按照常見的重組和標(biāo)記方法來制備本發(fā)明的標(biāo)記的聚合酶。例如，可以如上文所述將容易地連接(例如，直接連接、通過諸如生物素的第二標(biāo)記連接或通過連接物連接)到染料分子上的氨基酸殘基引入聚合酶的序列中。這類殘基包括半胱氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。如本文所述，在翻譯期間可以將標(biāo)記的或修飾的氨基酸直接添加到聚合酶?？梢允褂没诩?xì)胞的或無細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄和翻譯聚合酶。在使用非天然存在的tRNA分子的基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，可以將修飾的氨基酸直接引入到蛋白中。 這些修飾的tRNA識(shí)別特有的密碼子并且可以加載所需的修飾的殘基。將用于表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，使其表達(dá)特有的tRNA和tRNA合成酶。從而，通過引入具有一個(gè)特有密碼子的編碼序列，該細(xì)胞可以用于表達(dá)修飾的蛋白。這類技術(shù)包括ReCodeTM(可獲自Ambryx Biotechnologies)，并描述于，例如，美國專利第7，083，970號(hào)和第7，045，337號(hào)。可以直接并入非天然存在的熒光氨基酸來標(biāo)記聚合酶分子。例如，Summerer et al. , ((2006)Proc. Natl. Acad. Sci USA 103-9785)描述了使用琥珀無義密碼子在釀酒酵母中遺傳編碼的2-氨基-3-(5-( 二甲基氨基)萘-1-磺胺)丙酸(丹磺酰丙氨酸)，以及相應(yīng)的直系同源tRNA/氨酰-tRNA合成酶對(duì)。還可以使用大腸桿菌體外翻譯系統(tǒng)來并入非天然的熒光標(biāo)記的氨基酸(Hohsaka et al. ,2003 Nuc. Acids Symp. Series 3 :271)。體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)也是可商購的，例如， RTS 系統(tǒng)(5Prime )、Proteinscript (Ambion )或 Expressway (Invitrogen )。實(shí)施例中描述了制備標(biāo)記的φ-29聚合酶的無細(xì)胞方法的應(yīng)用。半胱氨酸、賴氨酸或任何其它容易標(biāo)記的氨基酸可以是并入DNA聚合酶中的非天然存在的氨基酸。在這種情況下，非天然的是指非自身的或突變的?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)方法并使用有機(jī)熒光染料分子來標(biāo)記所選的殘基。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)包括馬來酰亞胺標(biāo)記的染料分子和半胱氨酸的巰基之間的特異性反應(yīng)；以及NHS標(biāo)記的染料分子和Fmoc保護(hù)的賴氨酸上的胺基之間的反應(yīng)。如果氨?；鵷RNA合成酶不能活化具有相應(yīng)的標(biāo)記的氨基酸的半胱氨酸-tRNA 或賴氨酸-tRNA，則可以在利用tRNA合成酶將未標(biāo)記的氨基酸加載至tRNA之后再進(jìn)行標(biāo)記。加載至同類tRNA分子的修飾的半胱氨酸和賴氨酸可以在體內(nèi)或體外被核糖體有效并入延長的肽鏈中。該方法允許用所需熒光染料的任意組合、在任意所需位置簡單地標(biāo)記聚合酶。標(biāo)記的聚合酶的固定可以將標(biāo)記的聚合酶固定在基底上用于檢測(cè)。在這種情況下，將模板多核苷酸添加到固定的聚合酶分子上。在某些實(shí)施方案中，用互補(bǔ)引物將模板DNA預(yù)先引發(fā)，然后添加至固定的聚合酶。還可以添加包含dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)的反應(yīng)混合物。待測(cè)序的模板可以是幾乎任何形式，例如，剪切的基因組片段、單鏈或雙鏈線性分子、或環(huán)狀分子 (例如，質(zhì)粒DNA)。例如，可以將固相基底安排為平面上的陣列、點(diǎn)陣列、或珠上。用于此目的的常見基底包括玻璃和石英載玻片。由于READS技術(shù)被設(shè)計(jì)為從多于一個(gè)DNA聚合酶同時(shí)收集測(cè)量結(jié)果，所以陣列形式是方便的。以陣列形式為例，可以利用各種捕獲區(qū)域尺寸(用于捕獲聚合酶分子的點(diǎn))?；卓梢园A(yù)定尺寸和密度的孔和/或點(diǎn)尺寸，例如約50nl或更小的點(diǎn)尺寸?？谆螯c(diǎn)的圖案可以提供諸如條形碼信息的具體信息?；走€可以包含用于產(chǎn)生分析或信號(hào)讀取的參考測(cè)量結(jié)果或?qū)φ招盘?hào)的材料，或包含可以簡單地用作基底上的定位裝置的材料。通過使位于N末端或賴氨酸殘基處的胺基、天冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈或位于聚合酶C末端的羧酸基與基底上的氨基或羧基反應(yīng)從而形成共價(jià)肽鍵，可以將聚合酶固定?？梢蕴砑犹级啺穪泶龠M(jìn)結(jié)合反應(yīng)?？梢陨锼鼗蚩股锼氐鞍着c聚合酶連接(例如，通過常規(guī)方法連接到特定氨基酸的側(cè)鏈上)，并且所述生物素或抗生物素蛋白與固定在基底上的抗生物素蛋白或生物素連接來實(shí)現(xiàn)結(jié)合。可以用于固定的官能團(tuán)和反應(yīng)包括 巰基-溴乙酰反應(yīng)·巰基(在氧化、堿性條件下) 氨基-醛反應(yīng) 巰基-醛反應(yīng) 羥氨基-醛反應(yīng)基底上的固定還可以依賴于物理吸附。在這種情況下，通過簡單地使緩沖液中的聚合酶分子與基底接觸來實(shí)現(xiàn)固定。例如，根據(jù)常規(guī)方法，可以在室溫下持續(xù)15分鐘-2小時(shí)，或在4 °C過夜來進(jìn)行固定反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些方法中也可以使用中間連接分子。PEG通常用作連接物。還可以處理基底以提高連接物或反應(yīng)性基團(tuán)的結(jié)合。金和聚電解質(zhì)多層是對(duì)固體基底所做處理的實(shí)例。在具體實(shí)例中，可以將具有鏈霉標(biāo)簽(Str印tag)或生物素標(biāo)記的DNA聚合酶固定在包被有鏈霉親和素的170 μ m玻璃蓋玻片上，并組裝在流動(dòng)池內(nèi)?；椎谋砻嫣匦詫?duì)單分子成像非常重要。例如，按照RCA流程(70°C下的1 1 5的NH4OH H2O2 H2O,然后用食人魚洗液(piranha solution)清潔)清潔玻璃蓋玻片基底，用氨基丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行衍生，然后用NHS-PEG500-生物素。然后將生物素化的蓋玻片組裝在流動(dòng)池內(nèi)。使鏈霉親和素溶液流進(jìn)流動(dòng)池，從而用鏈霉親和素將生物素化的表面浸濕。然后使標(biāo)記的聚合物酶溶液流進(jìn)流動(dòng)池。用TIRF 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)固定以確保表面上聚合酶的合適密度。聚合酶應(yīng)當(dāng)良好地分離開(例如，平均間隔約500nm)以利于更好的光學(xué)解析。PEG5000可被用作長的連接物來使聚合酶與玻璃表面分離(約10_15歷)。在DNA 模板被加載到聚合酶之前獲取圖像。使與引物預(yù)雜交的DNA模板溶液流進(jìn)流動(dòng)池。孵育一段時(shí)間后，獲取另一圖像。由于聚合酶會(huì)與DNA結(jié)合并包圍DNA，所以FRET強(qiáng)度會(huì)發(fā)生改變。最終，使dNTP溶液流進(jìn)流動(dòng)池以起始DNA合成。獲取一系列圖像來監(jiān)測(cè)FRET信號(hào)。包含合成的120個(gè)堿基長的同聚物的測(cè)試模板可被用于確定與每種不同堿基相關(guān)的特征指紋譜?？梢詷?gòu)建包含聚A、聚C、聚G和聚T區(qū)段的四種120個(gè)堿基長的單鏈DNA 模板并用于測(cè)定。如上文所述，這些測(cè)試模板可以與30個(gè)堿基長的引物預(yù)雜交并被加載到聚合酶。一旦確定每種特征指紋譜，則可以利用READS技術(shù)使用更復(fù)雜的模板，例如包括， 具有甲基化堿基的模板。固定的模板多核苷酸在某些實(shí)施方案中，模板多核苷酸是固定在基底上的。在某些實(shí)施方案中，在固定之前用互補(bǔ)寡核苷酸引發(fā)模板，而在某些實(shí)施方案中，是在固定之后才添加引物。在某些實(shí)施方案中，引物寡核苷酸可以執(zhí)行雙功能并被用作捕獲探針以將模板固定在基底上。這類雙功能寡核苷酸與基底的連接比較接近于所述寡核苷酸5'端，剩下可與模板雜交的3' 端和可以由標(biāo)記的聚合物酶添加核苷酸堿基的3'羥基。如上文所述，引物可以包括修飾的、核酸酶抵抗的堿基或可以包括PNA分子。當(dāng)模板多核苷酸被固定時(shí)，標(biāo)記的DNA聚合酶分子被加載到模板分子上，并在適于DNA聚合的條件下與反應(yīng)混合物混合。
將核酸與基底連接的方法是領(lǐng)域內(nèi)已知的。使用多種技術(shù)可以將多核苷酸分子固定在基底上，包括共價(jià)連接和非共價(jià)連接。事實(shí)上，上文所述的固定聚合酶的相同技術(shù)中的很多都可以使用。在某些實(shí)施方案中，基底包含與多核苷酸分子雜交的捕獲探針。還可以使用接頭寡核苷酸，例如，在模板和捕獲探針之間的接頭寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，接頭寡核苷酸與模板連接并與捕獲探針雜交。在某些實(shí)施方案中，接頭是可以用末端轉(zhuǎn)移酶添加的多核苷酸(例如，聚A)，并可與捕獲探針雜交。在某些實(shí)施方案中，捕獲探針可以包含與接頭形成三鏈體的寡核苷酸夾或類似結(jié)構(gòu)，如Gryaznov et al.，美國專利第5，473，060號(hào)所述。表面可以具有反應(yīng)性官能團(tuán)，其與多核苷酸上的互補(bǔ)官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)從而形成共價(jià)連接(參見，例如，Smirnov et al.， (2004)，Genes, Chromosomes & Cancer，40 :72-77 ； Beaucage (2001) ,Current Medicinal Chemistry,8 :1213-1244。長的 DNA 分子(幾百個(gè)堿基)也可以與疏水表面有效連接，所述疏水表面例如具有較低濃度的諸如-OH基的反應(yīng)性官能團(tuán)的清潔的玻璃表面。多核苷酸分子可以被吸附至表面。在這種情況下，多核苷酸分子通過與表面的非特異性相互作用而被固定，或通過諸如氫鍵、范德華力等的非共價(jià)相互作用而被固定。連接還可以包括不同嚴(yán)緊度的洗滌步驟以去除不完全連接的單個(gè)分子或其他試劑。在具體實(shí)例中，我們利用磁場(chǎng)或電場(chǎng)組裝了幾乎完全有序的高密度陣列(例如， Barbee & Huang(2008) Anal Chem 80 =2149-54) 光刻法可用于在通過化學(xué)方法功能化的玻璃蓋玻片上的光致抗蝕劑或SiO2層中產(chǎn)生微孔的圓片規(guī)模陣列。所述陣列被包圍在微流體裝置中，用于磁場(chǎng)或電場(chǎng)引導(dǎo)的將與DNA分子連接的微珠裝配成非常高密度的陣列而基本上沒有背景或缺陷。利用完善的大規(guī)模生產(chǎn)的制造工藝，這些方法可用于制造大規(guī)模的、高密度的、維度為數(shù)十納米的陣列。這類低缺陷陣列沒有背景并且兼容于自動(dòng)化工藝、 微流體裝置和常規(guī)顯微術(shù)。當(dāng)高度有序的陣列被適當(dāng)?shù)卦O(shè)定了大小并與給定CCD感應(yīng)器對(duì)準(zhǔn)時(shí)，還可以大大改善成像效率并降低成像過程的復(fù)雜度。我們已經(jīng)證實(shí)，使每個(gè)特征成像僅需要少至3X3的像素。這些技術(shù)可以通過減少照射區(qū)域來提高我們的單分子陣列的效率并消除背景(因拉曼散射和其他散射)。DNA模板的單個(gè)分子可以與作為固定載體的小顆粒(例如，直徑為約200nm的二氧化硅或DNA顆粒)連接。儀器本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及實(shí)施READS的裝置、系統(tǒng)或儀器。所述系統(tǒng)可以是特別構(gòu)建用于本方法的，或可以是一般用途的光學(xué)儀器，例如由計(jì)算機(jī)中存儲(chǔ)的計(jì)算機(jī)程序選擇性地啟動(dòng)和配置。上文所示的方法并非一定涉及任何特定的光學(xué)儀器或電腦裝置。具有用于呈現(xiàn)樣品的各種光學(xué)手段、校正算法和高靈敏度照相機(jī)的FRET成像系統(tǒng)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(參見，例如，美國專利第6，661，909號(hào)，第6，456，734號(hào)，第 7，012，694號(hào))。在某些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括顯微鏡、檢測(cè)相機(jī)、光源、落射熒光模塊(例如，用于供體，受體和FRET)，成像處理器和用于查看數(shù)據(jù)的圖像輸出裝置中的一個(gè)或多個(gè)。在某些實(shí)施方案中，所述光學(xué)儀器包括至少一個(gè)照相機(jī)和顯微鏡。所述光學(xué)儀器還可以提供背景消減、譜重疊校正和來自三個(gè)通道的數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)化。落射熒光模塊包括濾色片(例如，激發(fā)光濾色片、發(fā)射光濾色片、分色鏡)，濾色片的選擇取決于FRET染料的激發(fā)波長和發(fā)射波長。
在某些應(yīng)用中，樣品被固定在通過光學(xué)系統(tǒng)直接觀察的基底上(例如，玻璃)。在某些實(shí)施方案中，樣品被固定在流動(dòng)通道里并且鑄在芯片上。通過將芯片與封閉了通道的平坦基底(例如，玻璃蓋玻片)粘結(jié)，可以形成通道。在這種情況下，合成通道的一側(cè)由平坦基底提供。所述儀器可以包括存在多個(gè)通道的流動(dòng)池整合系統(tǒng)，以及用于控制試劑流入和流出流動(dòng)池的流體學(xué)組件(例如微泵、微閥和連接通道)。本發(fā)明的儀器可以利用以下描述的管道裝置例如，Zdeblick et al.，A Microminiature Electric-to-Fluidic Valve, Proceedings of the 4th International Conference on Solid State Transducers and Actuators，1987 ；Shoji et al.，Proceedings of Transducers，San Francisco，1991 ； Vieider et al. , Proceedings of Transducers，Stockholm，1995。在某些實(shí)施方案中，所述儀器包括合成通道、閥、泵和連接通道。在某些實(shí)施方案中，流通池由通過具有預(yù)定圖形的反應(yīng)通道的硅橡膠墊組裝在玻璃載玻片或不銹鋼板上的玻璃蓋玻片基底組成。玻璃載玻片或不銹鋼板中鉆有孔用于流體連接。在某些實(shí)施方案中，流動(dòng)池被組裝在具有精確溫度控制和微流體技術(shù)以及用于有效熒光成像的窗口的儀器中。對(duì)于高速成像，可以按照?qǐng)D4組裝用于對(duì)單個(gè)分子的復(fù)色靈敏成像的基于目標(biāo)的TIRF系統(tǒng)。該系統(tǒng)由裝備有TIRF插片(TIRF 3插片，Carl Zeiss)的落射熒光顯微鏡 (AxioObserver Zl顯微鏡，Carl Zeiss)組成，激光激發(fā)光通過所述TIRF插片被導(dǎo)入到目標(biāo)中。利用由壓力馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的促動(dòng)裝置可以快速調(diào)整TIRF角度。NA為1.46的IOOX油物鏡(Alpha planapo 100X/油物鏡，Carl kiss)可以用于TIR激光激發(fā)和熒光檢測(cè)。 所述系統(tǒng)具有四種用于激發(fā)的定制的直接二極管和二極管泵浦固態(tài)激光器G05nm、488nm、 532nm和660nm)。激光器是通過保偏振單模寬帶光纖(KineFLEX，Point Source)與TIRF 插片連接。利用自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)(Definite Focus, Carl Zeiss)可以保持成像時(shí)光焦位置， 所述自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)使用從蓋玻片的表面反射的835nm LED光作為對(duì)焦反饋。我們已經(jīng)使用 TIRF顯微鏡來監(jiān)測(cè)由DNA聚合酶將標(biāo)記的核苷酸并入。使用了四波段光束分離器和發(fā)射光濾色片(Pinkel set, Semrock he.)，使得獲得4色熒光圖像不需要機(jī)械切換。對(duì)于檢測(cè)，使用了具有35兆像素/秒的高讀取速度、 單光子敏感性和14位動(dòng)態(tài)范圍的非常靈敏的分幅轉(zhuǎn)移EMCXD照相機(jī)(iXon Plus, Andor Technologies)。使用照相機(jī)上的像素合并要素，可以在低至1毫秒的曝光時(shí)間連續(xù)獲得 6X6合并(每個(gè)要素36個(gè)像素)的完整圖像。固態(tài)激光器的高功率(> IOOmW)和高調(diào)制率(> IOOkHz)與照相機(jī)的高讀取速度結(jié)合在一起允許每個(gè)通道僅1毫秒曝光時(shí)間的高 SNR成像。該系統(tǒng)能夠?qū)蝹€(gè)分子進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。圖5示出系統(tǒng)控制軟件中一小部分的分級(jí)結(jié)構(gòu)(例如，以C++或合適的編程語言編寫)。使用模塊式編程，可以減少從設(shè)計(jì)測(cè)序程序到實(shí)施的時(shí)間。此外，由于諸如EMCCDS 和固態(tài)激光器的領(lǐng)域內(nèi)新技術(shù)的發(fā)展，從軟件抽象出硬件允許容易地整合新裝置。具有傳統(tǒng)軟件平臺(tái)的另一益處是能夠優(yōu)化和同步從試劑遞送到圖像獲取的測(cè)序流程，以達(dá)到最高的序列通量。使用從DAQ板(PCI6733，National Instruments)觸發(fā)的TTL實(shí)現(xiàn)了激發(fā)源、 TIR角度和檢測(cè)器的精確時(shí)控。這確保了熒光通道和每個(gè)圖像中均勻光采集之間最小化的色度亮度干擾?？刂栖浖峁┝宋覀兊某上裣到y(tǒng)的可擴(kuò)展性和優(yōu)化的核心框架。
所關(guān)注的一點(diǎn)是提高成像系統(tǒng)的速度和效率，因?yàn)檫@些因素決定了我們的成像系統(tǒng)的讀取長度。如上文所解釋，深冷EMCCD照相機(jī)可以以良好的信噪比(S/N)檢測(cè)約100 個(gè)光子。如果成像系統(tǒng)的光子收集效率是10%，在染料分子光褪色之前可以以良好的S/N 對(duì)單個(gè)染料分子進(jìn)行幾千次的測(cè)量。由于拉曼散射和瑞利散射，良好S/N所需的光子數(shù)量可能更大，可以進(jìn)行的測(cè)量數(shù)可能更低?？梢允褂酶咝阅軆x器以最小化這些影響，例如，使用具有非常高的QE(量子效率，高達(dá)90%)和高數(shù)據(jù)速率(IOMHz/像素、無合并)的兩個(gè)背照射EMCCD照相機(jī)。使用兩個(gè)照相機(jī)同時(shí)監(jiān)測(cè)來自FRET對(duì)的供體和受體的信號(hào)，可以在DNA合成期間獲取更多的DNA 聚合酶工作時(shí)的照片。對(duì)于單個(gè)Alexa染料分子，可以進(jìn)行100，000次測(cè)量。如果我們假定需要10次快照來捕獲每個(gè)堿基的指紋譜，則每個(gè)特寫可以對(duì)高達(dá)10，000個(gè)堿基進(jìn)行測(cè)序。使用具有非常高的光收集能力的物鏡來達(dá)到最高的光子收集效率，例如，40 X /NAl. 3油物鏡和20X/NA1.0水浸物鏡?？焖俎D(zhuǎn)換的高能激光器對(duì)于高速成像是理想的。如上文所解釋，基于激光器的TIRF系統(tǒng)可以用于高速單分子成像(參見，圖13)。我們開發(fā)了用于高速成像的軟件包，其是通過對(duì)每個(gè)裝置進(jìn)行編程以實(shí)現(xiàn)硬件啟動(dòng)。原則上，DNA合成可以以較低速率進(jìn)行(例如10個(gè)堿基/秒)以便更易于成像。降速的DNA合成可用于在堿基并入期間捕獲更多的快照。事實(shí)上，Φ-290ΝΑ聚合酶的合成速率可以從4°C下的約5個(gè)堿基/秒到32°C下的 100個(gè)堿基/秒。對(duì)于每秒5個(gè)堿基的反應(yīng)速率，例如，允許有高達(dá)200ms來獲得由于堿基并入的化學(xué)機(jī)械過程所導(dǎo)致的FRET特征的一系列快照。將具有4個(gè)照相機(jī)和4個(gè)快速轉(zhuǎn)換激光器(IMHz)的系統(tǒng)用于FRET對(duì)/網(wǎng)絡(luò)的多參數(shù)測(cè)量會(huì)給予我們進(jìn)行更復(fù)雜的激發(fā)模式和快速獲得更多信息的能力。我們期望使用改進(jìn)的儀器能在5ms或更少的曝光時(shí)間獲得良好的S/N。使用改進(jìn)的系統(tǒng)，可以檢測(cè)到DNA合成其間化學(xué)機(jī)械過程中非常小的波動(dòng)(例如，模板DNA上存在甲基化堿基)。試劑盒和反應(yīng)混合物本發(fā)明提供用于實(shí)施READS技術(shù)的試劑盒和反應(yīng)混合物。組分取決于READS被設(shè)計(jì)用于的具體方面(例如，制備標(biāo)記的DNA聚合酶，利用固定的DNA聚合酶進(jìn)行測(cè)序或利用固定的模板DNA進(jìn)行測(cè)序)。試劑盒通常包括利用試劑盒的組分進(jìn)行READS反應(yīng)的使用說明。制備標(biāo)記的DNA聚合酶的反應(yīng)混合物可以包含編碼聚合酶的多核苷酸，從而購買者可以操控該序列(例如，添加非天然存在的氨基酸的密碼子)。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物不包含所述編碼序列，所述編碼序列是由購買者提供的，其在特定位置具有非天然存在的氨基酸的密碼子。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包含用于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的組分。這類組分包括 RNA聚合酶、rNTP、多種tRNA合成酶、所有20種氨基酸的特異性tRNA、氨基酸以及各種緩沖液和鹽。在某些實(shí)施方案中，對(duì)于每種非天然存在的氨基酸都有單獨(dú)的反應(yīng)混合物。在某些實(shí)施方案中，所有待并入的非天然存在的氨基酸和合適的tRNA及tRNA合成酶都包含在同一反應(yīng)混合物中。在某些實(shí)施方案中，每種非天然存在的氨基酸都用FRET染料標(biāo)記，或用用于連接FRET染料的接頭分子標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，非天然存在的氨基酸是未修飾的，并且在DNA聚合酶翻譯之后被修飾(標(biāo)記)。
制備標(biāo)記的DNA聚合酶的試劑盒可以包含如上文所述的反應(yīng)混合物。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含DNA聚合酶，所述DNA聚合酶任選地包含用于固定到基底上的接頭序列(例如，生物素)。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶已經(jīng)包含可供購買者選擇進(jìn)行標(biāo)記的多個(gè)非天然存在的核酸(例如，半胱氨酸)。根據(jù)所用的儀器的性能，可以包含和選擇多種染料。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含編碼標(biāo)記的DNA聚合酶的核苷酸序列和用于體外或基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)的試劑。核苷酸序列還可以被購買者進(jìn)一步操控，例如，添加非天然存在的氨基酸的另外的密碼子。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于翻譯DNA聚合酶的數(shù)種反應(yīng)混合物，從而在聚合酶表面上的特定靶位點(diǎn)引入非天然存在的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，非天然存在的氨基酸是引入到非天然位置(產(chǎn)生突變DNA聚合酶)的容易標(biāo)記的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，用FRET染料標(biāo)記非天然存在的氨基酸。在后一種情況下，還可以包含修飾的tRNA和tRNA合成酶。 從任選固定的模板DNA合成和測(cè)序的反應(yīng)混合物可以包括dNTP (dATP、dGTP、 dTTP、dCTP)，以及標(biāo)記的聚合物酶所需的各種鹽/緩沖液(例如，Mg、Mn和Si鹽)。反應(yīng)混合物還可以包含用于固定模板DNA的組分，例如，接頭核苷酸、生物素或抗生物素蛋白等。設(shè)計(jì)用于使用固定的模板DNA進(jìn)行測(cè)定的試劑盒可以包含本文所述的標(biāo)記的DNA 聚合酶。在某些實(shí)施方案中，DNA聚合酶被包裝而沒有進(jìn)行標(biāo)記，并且包含用于標(biāo)記聚合酶從而使其適用于購買者使用的光學(xué)儀器的說明和試劑。在某些實(shí)施方案中，包含寡核苷酸， 例如，捕獲探針、引物寡核苷酸、和/或與模板DNA序列連接的寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含例如如上所述的各種反應(yīng)混合物，而在某些實(shí)施方案中，試劑盒不包含反應(yīng)混合物，并且組分是單獨(dú)包裝的。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含合適的基底(例如，處理過的玻璃載玻片)，所述基底任選地包含固定的對(duì)照序列。設(shè)計(jì)用于使用固定的標(biāo)記的DNA聚合酶進(jìn)行測(cè)序的試劑盒包含用于固定DNA聚合酶的試劑(如前所述)或包含具有已經(jīng)連接的標(biāo)記的DNA聚合酶的基底。用于測(cè)序/合成的試劑盒可以包含反應(yīng)混合物的組分。典型的DNA聚合酶反應(yīng)混合物可以包含dNTP、緩沖液(例如，Tris)、各種鹽(例如，KC1、NaCl, (NH4)2SO4, MnCl2, Zn 鹽、MgCl2),通常還包含穩(wěn)定劑、去垢劑、DMSO和DTT。本發(fā)明的試劑盒包含用于增加聚合酶反應(yīng)的特異性和效率的添加劑。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，本發(fā)明的試劑盒還包含上述組分的任意組合。說明書可以包含在本發(fā)明的試劑盒內(nèi)。例如，使用固定的模板DNA進(jìn)行測(cè)序的試劑盒的通常流程可以包括以下說明·制備模板DNA (例如，包括分離和去除污染物)； 將接頭寡核苷酸序列連接到模板DNA上(例如，與基底上的捕獲探針雜交或與引物序列雜交)；·將模板DNA固定到基底上； 添加引物寡核苷酸；·添加標(biāo)記的DNA聚合酶和DNA聚合酶反應(yīng)混合物；·在溫度T下孵育(根據(jù)成像系統(tǒng)的性能和所需的反應(yīng)速率給出溫度范圍)；·檢測(cè)由標(biāo)記的聚合酶產(chǎn)生的FRET信號(hào)；
·任選地，通過洗去DNA聚合酶和反應(yīng)混合物來終止聚合酶反應(yīng)；·添加新的(非光褪色的)DNA聚合酶和DNA聚合酶反應(yīng)混合物；·如前所述檢測(cè)FRET信號(hào)。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，利用本領(lǐng)域公知的參數(shù)來優(yōu)化DNA聚合酶活性的效率和特異性的條件，上述示例性的流程可以改變。例如，較長的靶核酸的合成可能需要更長的孵育時(shí)間和/ 或更高的溫度來達(dá)到有效且特異性的擴(kuò)增。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的實(shí)例和實(shí)施方案僅用作示例性目的，并且根據(jù)其進(jìn)行的多種修飾和改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并包括在本申請(qǐng)的實(shí)質(zhì)和范圍以及附加權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。通過引用將本文引用的所有出版物、網(wǎng)站、專利和專利申請(qǐng)整體并入本文用于所有目的。
實(shí)施例實(shí)施例1 標(biāo)記的φ-29 DNA聚合酶的設(shè)計(jì)為了說明的目的，我們描述了我們對(duì)與不同底物復(fù)合的φ-29 DNA聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)性檢驗(yàn)。我們使用了基因工程化的、外切核酸酶缺陷的φ-29 DNA聚合酶(Berman et al.，EMBO J,26 :3494-3505 Q007))。參與去除外切核酸酶活性的突變不影響手指、拇指和手掌結(jié)構(gòu)域上的活性位點(diǎn)或鄰近位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，所公開的用于標(biāo)記CP-29DNA聚合酶的位點(diǎn)可以用于其它DNA聚合酶。如上文所解釋，DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)具有良好的保守性。因此，通過最佳結(jié)構(gòu)比對(duì)(特定結(jié)構(gòu)位置中存在的氨基酸的比對(duì))，本文所公開的位置可適用于寬范圍的聚合酶。我們選擇手指亞結(jié)構(gòu)域上的殘基作為熒光供體標(biāo)記位點(diǎn)的候選者，并選擇手掌或拇指亞結(jié)構(gòu)域上的某些殘基作為熒光受體標(biāo)記位點(diǎn)的候選者。圖7顯示與引物/模板DNA復(fù)合的φ-29 DNA聚合酶。盡管在引發(fā)的DNA聚合酶中存在兩個(gè)末端蛋白區(qū)(TPR)亞結(jié)構(gòu)域，但是我們關(guān)注于由手指、手掌和拇指亞結(jié)構(gòu)域所組成的聚合結(jié)構(gòu)域上的構(gòu)象和特定殘基。φ-29 DNA聚合酶與引物-模板DNA復(fù)合的轉(zhuǎn)位后二元復(fù)合體(PDB ID :2PZS)和聚合酶與引物-模板DNA和進(jìn)入的核苷酸底物復(fù)合的三元復(fù)合體(PDB ID :2PYJ)分別被定義為“開放”和“關(guān)閉”構(gòu)象。該術(shù)語反映核苷酸并入引起的構(gòu)象改變?；陂_放和關(guān)閉復(fù)合體間的手掌和拇指亞結(jié)構(gòu)域的Cα鏈比對(duì)來比較構(gòu)象轉(zhuǎn)換 (圖8)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)間的RMS(均方根)偏差是0.583 Α。當(dāng)“開放”和“關(guān)閉”形式間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換非常大時(shí)(在結(jié)合進(jìn)入的dNTP之后，尖端區(qū)移動(dòng)7.03人)，手指亞結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象發(fā)生改變。我們選擇半胱氨酸作為非天然存在的氨基酸，用于標(biāo)記表面上的位點(diǎn)。對(duì)于翻譯后標(biāo)記，我們估計(jì)了天然的半胱氨酸對(duì)水性溶劑的可及性。聚合酶的溶劑可及表面顯示在圖9中；7個(gè)天然的半胱氨酸殘基中沒有一個(gè)位于φ-29 DNA聚合酶的溶劑可及表面上。因此，天然的半胱氨酸殘基不會(huì)被用作熒光標(biāo)記位點(diǎn)。不需要替換這些殘基，因?yàn)樗鼈儽浑[藏起來并且是標(biāo)記反應(yīng)不可及的。φ-29 DNA聚合酶上用作FRET對(duì)的候選殘基顯示在圖10中。那些殘基對(duì)的距離
28列于以下的表1中。在結(jié)合進(jìn)入的核苷酸之前和之后，距離改變較大的FRET對(duì)是優(yōu)選的， 因?yàn)檫@會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的FRET信號(hào)。我們選擇了 5對(duì)，包括突變體E375e’K24(C、突變體E375e’E236C, 突變體E375e’ κ·、突變體E375e’ K547C和突變體e·，它們的距離改變分別為
6.92 A、6.70 A、6.37 A, 7.02 A和6.97 A (圖12)。完全溶劑可及的并對(duì)于簡單且
大量的標(biāo)記具有良好取向的那些位點(diǎn)在圖10中用星號(hào)標(biāo)記。為了防止顯著的結(jié)構(gòu)干擾和聚合酶活性丟失，聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能完整性所必需的重要?dú)埢话ㄔ趦?nèi)。在所選殘基的Cd之間測(cè)定了 φ-29 DNA聚合酶從“開放”向“關(guān)閉”形式轉(zhuǎn)換中候選殘基至間的距離改變，并列于表1中。表1 靴殘基、開放和關(guān)閉構(gòu)象中手指和手掌/拇指亞結(jié)構(gòu)域上殘基間的距離和距
離的改變(以A為單位)
權(quán)利要求
1.標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含至少一個(gè)FRET供體和至少一個(gè)FRET 受體，其中所述FRET供體和FRET受體位于在DNA聚合酶上的位置能使得當(dāng)聚合酶將核苷酸添加到DNA新生鏈時(shí)，至少根據(jù)并入的堿基(A、C、G、T)而產(chǎn)生不同的FRET信號(hào)。
2.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中當(dāng)DNA聚合酶處于開放位置時(shí)，F(xiàn)RET 供體距FRET受體為10埃以內(nèi)的Fdrster半徑(Rq)。
3.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中從DNA聚合酶的開放位置到關(guān)閉位置， FRET供體和FRET受體之間的F5rster半徑改變至少2. 5埃。
4.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述FRET供體和FRET受體與DNA聚合酶的溶劑可及表面上的氨基酸共價(jià)連接。
5.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶來自噬菌體或細(xì)菌。
6.如權(quán)利要求5所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述噬菌體是φ-29。
7.如權(quán)利要求5所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌(E.coli)。
8.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是經(jīng)基因工程化的。
9.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，還包含至少一個(gè)第二FRET供體。
10.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，還包含至少一個(gè)第二FRET受體。
11.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，還包含至少一個(gè)第二FRET供體和至少一個(gè)第二 FRET受體。
12.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中所述FRET供體和FRET受體的位置能使得當(dāng)DNA聚合酶讀取模板DNA上甲基化的核苷酸時(shí)，產(chǎn)生不同的FRET信號(hào)。
13.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶，其中按照包括以下步驟的方法制備所述 DNA聚合酶選擇DNA聚合酶上的至少一個(gè)第一位置用于FRET供體標(biāo)記和DNA聚合酶上的至少一個(gè)第二位置用于FRET受體標(biāo)記；和在每個(gè)所選的位置處引入非天然存在的氨基酸，從而制備標(biāo)記的DNA聚合酶。
14.制備權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶的方法，所述方法包括以下步驟選擇DNA聚合酶上的至少一個(gè)第一位置用于FRET供體標(biāo)記和DNA聚合酶上的至少一個(gè)第二位置用于FRET受體標(biāo)記；和在每個(gè)所選的位置處引入非天然存在的氨基酸，從而制備標(biāo)記的DNA聚合酶。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，所述第一位置處的非天然存在的氨基酸不同于所述第二位置處的非天然存在的氨基酸。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述非天然存在的氨基酸是標(biāo)記的氨基酸。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述非天然存在的氨基酸是取代的氨基酸。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述取代的氨基酸是半胱氨酸或賴氨酸。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述引入步驟包括體外翻譯反應(yīng)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述體外翻譯反應(yīng)包括以下步驟a)將包含編碼權(quán)利要求1所述的DNA聚合酶的序列的多核苷酸固定；b)在適于翻譯的條件下，使所述固定的多核苷酸相繼與兩種或更多種不同的反應(yīng)混合物接觸；c)在與每種不同的反應(yīng)混合物接觸的間隔，洗滌所述固定的多核苷酸；和d)重復(fù)步驟c)和d)，直到翻譯出DNA聚合酶。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述體外翻譯反應(yīng)包括以下步驟a)將包含編碼權(quán)利要求1所述的DNA聚合酶的序列的多核苷酸固定；b)在適于翻譯的條件下，使所述固定的多核苷酸與至少一種第一體外翻譯反應(yīng)混合物接觸；c)洗滌所述固定的多核苷酸；d)在適于翻譯的條件下，使所述固定的多核苷酸與至少一種第二體外翻譯反應(yīng)混合物接觸，其中所述第一和第二體外翻譯反應(yīng)混合物是不同的；e)洗滌所述固定的多核苷酸；和f)重復(fù)步驟b)-e)，直到翻譯出DNA聚合酶。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述至少一種第一體外翻譯反應(yīng)混合物選自(i) 包含非天然的氨基酸并且不包含其它氨基酸的反應(yīng)混合物；和(ii)包含標(biāo)記的DNA聚合酶序列中除了非天然存在的氨基酸之外的所有氨基酸的反應(yīng)混合物。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述至少一種第二體外翻譯反應(yīng)混合物選自(i) 包含非天然的氨基酸并且不包含其它氨基酸的反應(yīng)混合物；和(ii)包含標(biāo)記的DNA聚合酶序列中除了非天然存在的氨基酸之外的所有氨基酸的反應(yīng)混合物。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中利用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行所述體外翻譯反應(yīng)。
25.DNA分子測(cè)序方法，所述方法包括以下步驟(a)使權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶與DNA模板接觸，其中所述DNA模板與引物雜交；(b)在適于DNA聚合的條件下，添加DNA測(cè)序反應(yīng)混合物；(c)通過檢測(cè)標(biāo)記的DNA聚合酶所產(chǎn)生的FRET信號(hào)來檢測(cè)并入DNA新鏈中的每個(gè)核苷酸的種類，進(jìn)而對(duì)DNA分子進(jìn)行測(cè)序。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中將所述DNA模板固定在基底上。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中將所述DNA聚合酶固定在基底上。
28.如權(quán)利要求沈所述的方法，所述DNA模板與所述基底在多于一個(gè)位點(diǎn)處連接。
29.如權(quán)利要求沈所述的方法，還包括洗滌所述固定的DNA模板，和重復(fù)步驟a)-c)。
30.用于DNA分子測(cè)序的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶和用于蛋白測(cè)序的試劑。
31.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含DNA測(cè)序反應(yīng)混合物。
32.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，還包含dNTP。
33.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述標(biāo)記的DNA聚合酶被固定在基底上。
34.用于標(biāo)記DNA聚合酶的試劑盒，所述試劑盒包含編碼DNA聚合酶的多核苷酸和用于制備標(biāo)記的DNA聚合酶的試劑。
35.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，包含至少一種體外翻譯反應(yīng)混合物。
36.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，還包含氨基酸和tRNA。
37.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，還包含至少兩種FRET染料。
38.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中所述多核苷酸被固定在基底上。
39.DNA分子實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)，包括權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的DNA聚合酶和能夠檢測(cè)來自單個(gè)分子的FRET信號(hào)的光學(xué)裝置。
40.DNA分子實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)，包括微加工的流通池、微流體技術(shù)、溫度控制和成像窗口， 其中所述系統(tǒng)能夠檢測(cè)來自單個(gè)分子的FRET信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于核酸測(cè)序的改進(jìn)方法，例如，用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用和生物醫(yī)學(xué)研究。公開的方法可以用于快速個(gè)性化醫(yī)學(xué)、遺傳診斷、病原體鑒定和物種基因組測(cè)序。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK102317471SQ200980156620
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者黃曉華 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)