一種小分子有機納米腫瘤光熱治療試劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑及其制備方法。本發(fā)明的光熱治療試劑主要成分是3，6?二(2?噻吩基)?2，5?二氫吡咯并[3，4?c]吡咯?1，4?二酮(DPP)衍生物，通過再沉淀的方法得到吸收波長在近紅外區(qū)的納米顆粒，該納米顆粒具有良好的光聲及光熱轉(zhuǎn)換能力、優(yōu)異的水分散性和腫瘤組織靶向性，作為光聲成像介導(dǎo)的腫瘤光熱治療試劑可以有效的殺死腫瘤細胞，減少腫瘤治療的毒副作用。本發(fā)明的腫瘤光熱治療試劑結(jié)構(gòu)明確、合成過程簡單易行，作為新型腫瘤光熱治療試劑具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種小分子有機納米腫瘤光熱治療試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于材料和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種小分子有機納米腫瘤光熱治療試 劑及其合成過程以及其在光聲成像介導(dǎo)的腫瘤光熱治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥，也被稱為惡性腫瘤，是人類生命健康的主要殺手之一。從2015年世界癌癥報 告數(shù)據(jù)顯示，全球癌癥病例一直呈現(xiàn)快速增長，從2012年的1400萬人逐年增加到2025年的 1900萬人。當前癌癥治療主要包括:手術(shù)切除、化療和放療。然而，這些治療方法都有很大的 副作用，例如:手術(shù)切除需要準確定位腫瘤的位置，而化療和放療會同時損傷人體的正常細 胞，對病人的健康造成的巨大的二次傷害。因此，開發(fā)更加有效的癌癥治療方法成為當前亟 待解決的關(guān)鍵問題。
[0003] 光熱治療(PTT)是一種新的腫瘤治療技術(shù)，由于其只作用于腫瘤組織并對其他器 官幾乎沒有傷害以及可以作用于深層生物組織等特點，得到越來越多的關(guān)注。光熱治療主 要是將具有近紅外吸收特性的治療試劑富集到腫瘤組織，然后在近紅外激光照射下將激光 能量轉(zhuǎn)換為熱量，從而達到殺死腫瘤組織的目的。許多光熱藥物，尤其是無機納米材料，比 如:金納米球、銀納米顆粒、二維過度金屬硫化物、石墨稀、碳納米管等，由于其良好的光熱 轉(zhuǎn)換效率，已經(jīng)得到了廣泛的研究。然后，大多數(shù)無機納米材料在體內(nèi)生物相容性差且具有 長期毒性，同時也不具備在體內(nèi)成像的功能，限制了其發(fā)展。小分子有機化合物具有良好的 體內(nèi)生物相容性以及低毒性的特點，例如吲哚菁綠(ICG)已經(jīng)得到很好的臨床應(yīng)用，但由于 其光穩(wěn)定性差，難以改性修飾及靶向性差等缺點，吲哚菁綠等小分子光熱試劑的進一步應(yīng) 用受到了的限制。因此，研發(fā)具有高光熱轉(zhuǎn)換效率、生物相容性好、光穩(wěn)定及靶向性的有機 小分子光熱診斷試劑顯得越來越重要。光聲成像(PAI)是一種非入侵式和非電離式的新型 生物成像技術(shù)，富集在腫瘤組織中的特定藥物在近紅外激光照射下會產(chǎn)生光聲信號，達到 生物成像的目的。光聲成像同時結(jié)合了熒光成像的高選擇性以及超聲成像的深層組織穿透 力，可以避免傳統(tǒng)生物成像的光散射等問題，得到高對比度和高分辨率的生物成像圖片。由 于光聲成像與光熱治療相似的引發(fā)條件，研發(fā)同時具有兩者功能的近紅外材料顯得格外重 要。
[0004] 吡咯并吡咯二酮(DPP)衍生物是一種具有易修飾、高耐熱、耐光、顏色明亮及摩爾 吸光系數(shù)高的染料，在有機電子器件以及生物探針領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。然而，在生物醫(yī)藥領(lǐng) 域，DPP的水溶性和靶向性仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。為了克服這些缺點，親水基團的表面修 飾及制備納米顆粒等方法被廣泛研究，在這些方法中，再沉淀方法具有操作簡單，不需要親 水基團即可形成水分散性良好的有機納米顆粒等優(yōu)點，引發(fā)了廣泛的研究。同時，由于腫瘤 組織血管的疏松，納米顆粒容易通過增強滯留和滲透(EPR)效應(yīng)富集在腫瘤組織，從而解決 DPP衍生物靶向治療問題。
[0005] 在本項發(fā)明中，設(shè)計合成了一種有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑，試劑的主要 成分是3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氫吡咯并[3，4-c ]吡咯-1，4-二酮(DPP)衍生物，通過再沉 淀方法得到近紅外納米顆粒，該納米顆粒具有良好的光聲及光熱轉(zhuǎn)換能力、優(yōu)異的水分散 性、腫瘤組織靶向性，應(yīng)用于腫瘤細胞以及活體光聲成像介導(dǎo)的腫瘤光熱治療中，能有效的 殺死腫瘤細胞。因此，該有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑在腫瘤光熱治療領(lǐng)域具有巨大 的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明設(shè)計合成了一種新型有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑，可以解決現(xiàn)有診 療試劑生物相容性差、水溶性差、無特定靶向性、光不穩(wěn)定等缺陷，為腫瘤的精準光熱治療 提供一種新型的光熱試劑。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供該小分子有機納米腫瘤光熱治療試劑的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0009] 一種新型有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑，表達式為DPP-R NPs(簡稱DPP)，其 結(jié)構(gòu)為：
[0010]
[0011] 上述結(jié)構(gòu)有機小分子腫瘤光熱治療試劑的制備方法包含以下步驟：
[0012] ⑴氮氣保護下，3,6-二(2-噻吩基)-2,5_二（1-溴-己烷)啦咯并[3,4-c]吡咯-1， 4-二酮，R，醋酸鈀，三甲基乙酸，無水碳酸鉀加入無水N，N_二甲基乙酰胺中，加熱攪拌，除去 溶劑后得到粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品分離后得到DPP-R;
[0013] (2)DPP-R溶于四氫呋喃中，慢慢滴加到快速攪拌的純水中，攪拌5-10分鐘后，充氮 氣吹走溶液中的四氫呋喃，然后離心分離得到所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑 DPP-R NPs〇
[0014] 其中，R為
[0015] 上述合成方法中，DPP-R可以為3,6_二（5-(4-(4-(二甲氨基）苯甲酰)苯-2-噻吩 基)-2,5_ 二（1-溴-己烷)吡咯并[3,4-c]吡咯-1，4-二酮（即 DPP-R1)或3,6_二(5-(4-(二苯 胺)苯-2-噻吩基)-2，5-二（1 -溴-己烷)吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮（即DPP-R2)。
[0016] 其中，步驟（1)所述3，6-二（2-噻吩基)-2，5-二（1 -溴-己烷)吡咯并[3，4-C ]吡咯-1，4_二酮與R的摩爾比為1: (2-10)，優(yōu)選摩爾比為1: (2-5); 3,6_二(2-噻吩基)-2,5_二溴代 己烷吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮與醋酸鈀的摩爾比為1:(0.01-1)，優(yōu)選摩爾比為1: (0 · 025-0 · 035); 3，6-二（2-噻吩基)-2，5-二溴代己烷吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮與三甲 基乙酸的摩爾比為1:(0.1-10)，優(yōu)選摩爾比為1:(0.15-0.25); 3,6_二（2-噻吩基)-2，5_二 溴代己烷吡咯并[3,4_c]吡咯-1，4-二酮與無水碳酸鉀的摩爾比為1:(0.1-10)，優(yōu)選摩爾比 為1: (2-5)，進一步優(yōu)選摩爾比為1: (2-3)，最優(yōu)選摩爾比為1:2.5。
[0017]步驟（1)所述的加熱攪拌溫度為85-120°C，加熱攪拌的時間為1 -30小時;優(yōu)選加熱 攪拌的溫度為100-120 °C，加熱攪拌的時間為4-10小時。
[0018] 步驟（2)所述的DPP-R在四氫呋喃中濃度為1-5毫克/毫升，滴入量為0.05-0.5毫 克/毫升，滴加速度為1-30滴/分鐘，快速攪拌速度為500-2000轉(zhuǎn)/分鐘。步驟(2)所述粗產(chǎn)品 用硅膠色譜柱分離后得到DPP-R。
[0019] 所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑可以在制備光聲成像介導(dǎo)的腫瘤光熱 治療中藥物中應(yīng)用。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的主要優(yōu)點包括以下幾個方面：（1)本發(fā)明制備的腫瘤光 熱治療試劑結(jié)構(gòu)明確、合成工藝簡單易行；（2)本發(fā)明制備的腫瘤光熱治療試劑澄清透明， 具有優(yōu)異的水分散性、腫瘤靶向性和優(yōu)異的光聲轉(zhuǎn)換能力和光熱轉(zhuǎn)換能力；（3)本發(fā)明制備 的腫瘤光熱治療試劑作為光聲成像介導(dǎo)的腫瘤光熱治療試劑可以有效的殺死腫瘤細胞，減 少腫瘤治療的毒副作用，具有優(yōu)異的腫瘤光熱治療效果，作為新型腫瘤光熱治療試劑具有 良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明實施例有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑DPP-R1NPS的紫外可見光 吸收光譜，在600nm-800nm之間有很寬的吸收峰。
[0022]圖2是本發(fā)明實施例所述的有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑DPP-RINPs的掃描 電子顯微鏡圖，納米顆粒的平均尺寸約123nm。
[0023]圖3是本發(fā)明實施例有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑DPP-RINPs在溶液中的光 聲成像信號圖，光聲信號隨著濃度增加而增強，并且成線性關(guān)系。
[0024]圖4是本發(fā)明實施例有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑DPP-RINPs的細胞毒性實 驗結(jié)果，很明顯的給藥光照組有很強的毒性，10yg/mL就殺死了 50%的細胞，而空白組和給 藥不光照組則沒有細胞死亡。
[0025]圖5是本發(fā)明實施例有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑DPP-RINPs的裸鼠治療實 驗結(jié)果，治療組在第六天就基本消除掉了腫瘤組織，而其他兩組的腫瘤組織隨著時間在不 斷增長。
[0026]圖6是本發(fā)明實施例有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑DPP-R2NPS的紫外可見光 吸收光譜，最大吸收峰在660nm，并且在600nm-800nm有很強的吸收。
[0027]圖7是本發(fā)明實施例有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑DPP-R2NPS的掃描電子顯 微鏡圖，納米顆粒的平均尺寸約130nm〇
[0028]圖8是本發(fā)明實施例有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑DPP-R2NPS在激光照射下 (660nm，lW/cm2)的光熱轉(zhuǎn)換效率測試結(jié)果，隨著時間的增加，光照的溶液不斷的增強，其中 80yg/mL的溶液在十分鐘時溫度溫度在60 °C以上。
[0029]圖9是本發(fā)明實施例有機納米小分子腫瘤光熱治療試劑DPP-RINPs和DPP-R2NPS在 水中的溶解照片，明顯是澄清透明的狀態(tài)。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1
[0031] 3,6_二（5-(4-(4-(二甲氨基)苯甲酰)苯-2-噻吩基)-2,5_二（1-溴-己烷)吡咯并 [3，4-c ]吡咯-1，4-二酮（即 DPP-R1)的合成：
[0032] 氮氣保護下，3,6_二(2-噻吩基)-2,5_二（1-溴-己烷)吡咯并[3,4_c]吡咯-1，4-二 酮（0.780克，1毫摩爾），對二甲氨基二苯甲酮（0.562克，2.5毫摩爾），醋酸鈀（0.006克， 0.025毫摩爾），三甲基乙酸(0.015克，0.15毫摩爾），無水碳酸鉀(0.345克,2.5毫摩爾)加入 25毫升無水N，N-二甲基乙酰胺中，100°C下攪拌4小時后，水洗，用DCM萃取除去DMF得到粗產(chǎn) 品，粗產(chǎn)品用硅膠色譜柱分離得到DPP-R1 (0.612克，產(chǎn)率60 % )。
[0033] 150微升的4毫克/毫升DPP-R1四氫呋喃溶液，慢慢滴加（滴加速度為25-30滴/分 鐘）到快速攪拌（1000轉(zhuǎn)/分鐘）的10毫升水中后，攪拌5分鐘，充氮氣吹走溶液中的四氫呋 喃，離心分離得到所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑DPP-RINPs。
[0034] DPP-RINPs體外光聲成像實驗：
[0035] DPP-RINPs(0，5，10，20，40微克/毫升)水溶液分別放入微量離心管中，然后用小動 物光聲成像儀進行測試，發(fā)現(xiàn)光聲信號隨著濃度的增加呈現(xiàn)線性增長。
[0036] DPP-RINPs腫瘤細胞體外光熱治療實驗：
[0037]實驗選取Hela腫瘤細胞進行光熱治療，測試其暗毒性，普通光毒性及激光毒性。具 體實驗步驟如下:DPP-RINPs溶解在PBS溶液中，然后用DMEM稀釋成各種濃度。Hela細胞被接 種在黑底96孔培養(yǎng)板，37 °C下培養(yǎng)24h使其貼壁生長，用PBS溶液清洗，避光加藥（100yL)培 養(yǎng)24小時后，一組細胞繼續(xù)避光，一組是由氙燈輻照8分鐘(40mW/cm 2)，一組由NIR激光器輻 射5分鐘(660nm，lW/cm2)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后用MTT比色法進行測定。20yLMTT溶液(5mg/ ml)添加到細胞中在相同的環(huán)境孵育4小時后加入DMS0(150yL)，然后使用Bio-Tek微型板塊 酶標儀測定吸收峰為490nm的吸收值。
[0038]圖4是本實施例新型有機納米小分子腫瘤診療試劑DPP-RINPs進入Hela細胞培養(yǎng)4 小時后在不同情況下，不同DPP-RINPs濃度下的成活率。在約10μg/ml濃度下，光照后細胞成 活率為50 %。
[0039] DPP-RINPs腫瘤細胞體內(nèi)光熱治療實驗：
[0040]選擇將Hela細胞注入腋下的裸鼠作為腫瘤模型。當腫瘤體積約為100mm3。18只裸 鼠隨機分為3組。在第一和第二組的小鼠分別通過尾靜脈注射DPP-RINPs PBS溶液(40yg/ mL，0.08ml)。第三組通過尾靜脈注射生理鹽水。2小時后，第一組和第三組小鼠的腫瘤在NIR 激光器輻射8分鐘（660nm，lW/cm2)，第二組不進行特別光照。上述過程重復(fù)了 16天，腫瘤大 小每2天測量一次。
[0041 ]圖5是本實施例新型有機納米小分子腫瘤診療試劑DPP-RINPs，在長有Hela腫瘤的 裸鼠體內(nèi)進行治療的腫瘤體積大小的變化，3組腫瘤起始體積約為100mm3，16天實驗結(jié)束 后，對比其他兩組組，光熱治療組對腫瘤起到明顯的治療作用。
[0042] 實施例2
[0043] 3,6_ 二(5-(4-(二苯胺)苯-2-噻吩基)-2,5_ 二（1-溴-己烷)吡咯并[3,4-c]吡咯- 1，4-二酮（8卩0??-1?2)的合成：
[0044] 氮氣保護下，3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二（1-溴-己烷)吡咯并[3，4-c ]吡咯-1，4-二 酮(0.780克，1毫摩爾），對三苯胺(0.615克，2.5毫摩爾），醋酸鈀(0.006克，0.025毫摩爾）， 三甲基乙酸(0.015克，0.15毫摩爾），無水碳酸鉀(0.345克，2.5毫摩爾）加入25毫升無水N， N-二甲基乙酰胺中，110°C下攪拌10小時后，水洗，用DCM萃取除去DMF得到粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品用 硅膠色譜柱分離得到DPP-R2(0.820克，產(chǎn)率74% )。
[0045] 150yL的4mg/mL-tPP-R〗四氫呋喃溶液，慢慢滴加(滴加速度為15-20滴/分鐘）到快 速攪拌(2000轉(zhuǎn)/分鐘）的10ml水中后，攪拌5分鐘后，鼓氮氣吹走溶液中的四氫呋喃，然后離 心分離得到機小分子納米腫瘤診療試劑DPP-R2NPS。
[0046] DPP-R2NPS體外光聲成像實驗：
[0047] DPP-R2NPs(0，5，10，20，40yg/mL)水溶液分別放入微量離心管中，然后用小動物光 聲成像儀進行測試，明顯發(fā)現(xiàn)光聲信號隨著濃度的增加呈現(xiàn)線性增長。
[0048] DPP-R2NPS腫瘤細胞體外光熱治療實驗：
[0049] 實驗選取Hela腫瘤細胞進行光熱治療，測試其暗毒性，普通光毒性及激光毒性。具 體實驗步驟如下:DPP-R2NPS溶解在PBS溶液中，然后用DMEM稀釋成各種濃度。Hela細胞被接 種在黑底96孔培養(yǎng)板，37 °C下培養(yǎng)24h使其貼壁生長，用PBS溶液清洗，避光加藥（100yL)培 養(yǎng)24h后，一組細胞繼續(xù)避光，一組是由氙燈輻照8分鐘(40mW/cm 2)，一組由NIR激光器輻射5 分鐘（660nm，lW/cm2)，繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后用MTT比色法進行測定。20yLMTT溶液（5mg/ml)添 加到細胞中在相同的環(huán)境孵育4h后加入DMS0(150yL)，然后使用Bio-Tek微型板塊酶標儀測 定吸收峰為490nm的吸收值，治療組約在10yg/mL的濃度下，細胞成活率為50%。
[0050] DPP-R2NPS腫瘤細胞體內(nèi)光熱治療實驗：
[0051]選擇將Hela細胞注入腋下的裸鼠作為腫瘤模型。當腫瘤體積約為100mm3。18只裸 鼠隨機分為3組。在第一和第二組的小鼠分別通過尾靜脈注射DPP-R2NPS PBS溶液(40yg/ mL，0.08ml)。第三組通過尾靜脈注射生理鹽水。2小時后，第一組和第三組小鼠的腫瘤在NIR 激光器輻射8分鐘（660nm，lW/cm2)，第二組不進行特別光照。上述過程重復(fù)了 16天，腫瘤大 小每2天測量一次。治療組在第二次治療時基本消除腫瘤，而其他兩組的腫瘤隨著時間增加 而變大。
【主權(quán)項】
1. 一種有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：2. -種權(quán)利要求1所述有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑的制備方法，其特征在于該 方法包含以下步驟： (1) 氮氣保護下，3,6_二(2-噻吩基)-2,5_二溴代己烷吡咯并[3,4-c]吡咯-1，4-二酮， R，醋酸鈀，三甲基乙酸，無水碳酸鉀加入無水N，N-二甲基乙酰胺中，加熱攪拌，除去溶劑后 得到粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品分離后得到DPP-R; (2) DPP-R溶于四氫呋喃中，慢慢滴加到快速攪拌的純水中，攪拌5-10分鐘后，充氮氣吹 走溶液中的四氫呋喃，然后離心分離得到所述有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑DPP-R的 納米粒子DPP-R NPs;3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑的制備方法，其特征在于， 步驟（1)所述3,6_二（2-噻吩基)-2,5_二（1-溴-己烷)吡咯并[3,4-c]吡咯-1，4-二酮與R的 摩爾比為1:(2-10)。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑的制備方法，其特征在于， 步驟（1)所述3,6_二(2-噻吩基)-2,5_二溴代己烷吡咯并[3,4-c]吡咯-1，4-二酮與醋酸鈀 的摩爾比為1:(0.01-1)。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑的制備方法，其特征在于， 步驟（1)所述3,6_二(2-噻吩基)-2,5_二溴代己烷吡咯并[3,4-c]吡咯-1，4-二酮與三甲基 乙酸的摩爾比為1: (0.1-10)。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑的制備方法，其特征在于， 步驟（1)所述3，6_二(2-噻吩基)_2，5-二溴代己燒吡略并[3，4_c]吡略-1，4_二酮與無水碳 酸鉀的摩爾比為1: (〇. 1-10)。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑的制備方法，其特征在于 步驟(1)所述的加熱攪拌溫度為85-120 °C，加熱攪拌的時間為1 -30小時。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑的制備方法，其特征在于 步驟(1)所述的加熱攪拌溫度為100-120 °C，加熱攪拌的時間為4-10小時。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑的制備方法，其特征在于 步驟(2)所述DPP-R在四氫呋喃中濃度為1-5毫克/毫升，滴加速度為1-30滴/分鐘，快速攪拌
【文檔編號】A61K9/51GK106008525SQ201610431612
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】董曉臣, 張琪, 黃維, 蔡宇, 唐倩云
【申請人】南京工業(yè)大學(xué)