分離方法、檢測方法、信號測定方法、疾病的判定方法、疾病治療藥的藥效評價方法、試劑 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分離方法、檢測方法、信號測定方法、疾病的判定方法、疾病治療藥的 藥效評價方法、試劑盒W及液態(tài)組合物。更詳細而言，設(shè)及外泌體等具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡 的分離方法，利用了該方法的核酸或者蛋白質(zhì)的檢測方法、信號測定方法、疾病的判定方 法、疾病治療藥的藥效評價方法、疾病判定或者藥效評價用試劑盒W及上述分離方法中使 用的液態(tài)組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 囊泡具有脂質(zhì)雙層膜所包圍的結(jié)構(gòu)，運樣的囊泡中，作為生物體內(nèi)的體液中存在 的囊泡顆粒，已知有外泌體。已知在外泌體的表面，與一般的細胞表面同樣地存在各種膜蛋 白質(zhì)，另一方面，也可知在外泌體的內(nèi)部，除細胞因子等各種蛋白質(zhì)W外也含有microRNA (miRNA)O
[0003] 另外，已知從免疫系統(tǒng)的細胞、各種癌細胞等各種細胞分泌外泌體，作為生物體內(nèi) 的細胞間通訊的媒介作用的外泌體的功能，外泌體與生理現(xiàn)象、癌等疾病的相關(guān)性受到關(guān) 注，正在開展運些研究。例如，已經(jīng)報告使用作為腫瘤標(biāo)志物的化CAM的抗體時，從卵巢癌患 者的循環(huán)血液中分離外泌體，來自外泌體的miRNA表達量與卵巢癌的進展之間具有相關(guān)性 (非專利文獻1)。
[0004] 另外，作為外泌體上表達的四次跨膜的膜蛋白質(zhì)，有屬于四次跨膜蛋白家族的 CD9、CD63W及CD81，非專利文獻2中報告了黑色素瘤患者的血漿中的外泌體量比健康人高， 運能夠用針對CD63的抗體、針對腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的化veo 1 in - 1的抗體進行檢測?定量化。 另外，對離屯、分離后的血漿樣品組合CD63抗體、針對各種膜蛋白質(zhì)的抗體等進行反應(yīng)，由此 對來自癌患者的外泌體的信號進行定量解析(專利文獻1)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0006] 專利文獻
[0007] 專利文獻1:國際公開第2010/065968號 [000引非專利文獻
[0009] 非專利文獻 I=D-DJaylor.，et al. ,Gynecol.Oncol. ,110,13-21(2008)
[0010] 非專利文獻2:M丄ogozzi.，et al.，PLoS 0肥.，4,1-10(2009)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 然而，作為鍵合抗體的固相載體的反應(yīng)液、清洗液、將抗體鍵合粒子懸浮的緩沖液 的功能，要求減少對平板等反應(yīng)容器、粒子表面的非特異性吸附，減少反應(yīng)中發(fā)生的粒子的 凝聚的功能。
[0012] 然而，用磁性粒子運樣的粒子捕捉像上述外泌體那樣的被脂質(zhì)雙層膜覆蓋的囊泡 時，不但容易引起上述非特異性吸附，而且容易產(chǎn)生粒子彼此的凝聚，有時對囊泡的回收 率、粒子的清洗效率造成負面影響。如果反應(yīng)后的抗體鍵合粒子的清洗不充分，則存在來自 檢體的夾雜蛋白質(zhì)混入，外泌體的精制度降低的問題。
[0013] 因此，要將被脂質(zhì)雙層膜覆蓋的囊泡分離時，也需要能夠減少對固相載體的非特 異性吸附和粒子的凝聚、清洗能力高的緩沖液。
[0014] 然而，發(fā)現(xiàn)即使將一般用于抑制非特異性吸附、粒子凝聚所使用的BSA等蛋白質(zhì)添 加到粒子保存緩沖液、反應(yīng)緩沖液等中，要將被脂質(zhì)雙層膜覆蓋的囊泡分離時，粒子也會凝 聚，進而對其后進行的精制外泌體的蛋白質(zhì)組解析等造成影響。
[0015] 另外，將被脂質(zhì)雙層膜覆蓋的囊泡分離時，還要求對具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的破 壞少。
[0016] 本發(fā)明要解決的課題在于提供夾雜物的除去效率優(yōu)異且具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡 不易被破壞的具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法。
[0017] 因此，本發(fā)明人等深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過在包括復(fù)合體形成工序和清洗工序的 具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法中，在非離子性表面活性劑的存在下進行上述復(fù)合體形 成工序和上述清洗工序中的至少任一工序，能夠解決上述課題，從而完成了本發(fā)明，其中， 復(fù)合體形成工序是使含有具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的生物體試樣與鍵合有識別存在于上述 囊泡表面的表面抗原的配體的固相載體接觸，形成上述囊泡和上述固相載體的復(fù)合體;清 洗工序是清洗上述復(fù)合體。
[0018] 目P，本發(fā)明提供<1>一種具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法，其特征在于，包括： 使含有具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的生物體試樣與鍵合有識別存在于上述囊泡表面的表面抗 原的配體的固相載體進行接觸，形成上述囊泡和上述固相載體的復(fù)合體的復(fù)合體形成工 序;和清洗上述復(fù)合體的清洗工序;在非離子性表面活性劑的存在下進行上述復(fù)合體形成 工序和上述清洗工序中的至少任一工序。
[0019] 另外，本發(fā)明提供<2>-種囊泡中的核酸的檢測方法，其特征在于，在上述<1> 的分離方法之后，進一步包含檢測囊泡中的核酸的核酸檢測工序。
[0020] 進而，本發(fā)明提供<3>-種來自囊泡的蛋白質(zhì)的檢測方法，其特征在于，在上述 <1>的分離方法之后，進一步包含對在囊泡的內(nèi)側(cè)和表面的至少一方存在的蛋白質(zhì)進行 檢測的蛋白質(zhì)檢測工序。
[0021] 進而，本發(fā)明提供<4>一種來自囊泡的信號測定方法，其特征在于，在上述<1> 的分離方法之后，進一步包含對來自形成上述復(fù)合體的囊泡的信號強度進行測定的信號測 定工序。
[0022] 進而，本發(fā)明提供<5>-種疾病的判定方法，其特征在于，是判定被檢者是否發(fā) 病的方法，包含使用來自被檢者的生物體試樣，利用上述<4>的信號測定方法對來自形成 上述復(fù)合體的囊泡的信號強度進行測定的工序。
[0023] 進而，本發(fā)明提供<6>-種疾病治療藥的藥效評價方法，其特征在于，是疾病治 療藥的藥效評價方法，包含使用疾病治療藥的給予前W及給予后的來自被檢者的生物體試 樣，利用上述<4>的信號測定方法對來自形成上述復(fù)合體的囊泡的信號強度進行測定的 工序。
[0024] 進而，本發(fā)明提供<7>-種試劑盒，其特征在于，具備鍵合有識別存在于具有脂 質(zhì)雙層膜的囊泡的表面的表面抗原的配體的固相載體和含有非離子性表面活性劑的液態(tài) 組合物。
[0025] 進而，本發(fā)明提供<8>-種液態(tài)組合物，其特征在于，含有非離子性表面活性劑， 在具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法中使用，用于清洗上述復(fù)合體，上述具有脂質(zhì)雙層膜 的囊泡的分離方法包含:使含有具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的生物體試樣與鍵合有識別存在于 上述囊泡表面的表面抗原的配體的固相載體接觸，形成上述囊泡和上述固相載體的復(fù)合體 的復(fù)合體形成工序;清洗上述復(fù)合體的清洗工序。
[0026] 就本發(fā)明的具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法而言，夾雜物的除去效率優(yōu)異，并 且，具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡不易被破壞。
[0027] 另外，將本發(fā)明的試劑盒、液態(tài)組合物用于具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離時，夾雜 物充分被除去，并且，具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡不易被破壞。
【附圖說明】
[0028] 圖1是表示非離子性表面活性劑對鍵合于粒子的抗體與外泌體的反應(yīng)的影響的 圖。
[0029] 圖2是表示含有非離子性表面活性劑的清洗緩沖液的清洗能力的銀染色圖像。
[0030] 圖3是表示含有非離子性表面活性劑的清洗緩沖液難W從鍵合于粒子的抗體剝離 外泌體的Western印跡圖像。
[0031] 圖4是表示用鍵合了抗CD63抗體的磁性粒子捕捉的外泌體的粒徑不成為問題的粒 度分布的波形。
[0032] 圖5是表示用各抗體鍵合磁性粒子捕捉的外泌體的粒徑不成為問題的粒度分布的 圖。
[0033] 圖6是表示用抗CD9抗體鍵合磁性粒子捕捉的外泌體的形態(tài)沒有問題的透射式電 子顯微鏡像。
[0034] 圖7是表示能夠從用抗體鍵合磁性粒子捕捉的外泌體中檢測核酸的生化分析儀的 解析圖。
[0035] 圖8是表示能夠?qū)目贵w鍵合磁性粒子捕捉的外泌體中的microRNA進行定量的擴 增曲線。
[0036] 圖9是表示能夠從用抗體鍵合磁性粒子捕捉的囊泡檢測來自囊泡的內(nèi)側(cè)和表面的 蛋白質(zhì)的Western印跡圖像。
[0037] 圖10是表示利用抗體鍵合磁性粒子得到的囊泡的捕捉量與反應(yīng)的囊泡的量成比 例的Western印跡圖像。
[0038] 圖11是表示能夠檢測來自用抗體鍵合磁性粒子從各種培養(yǎng)上清液和體液中捕捉 的囊泡的表面蛋白質(zhì)的Western印跡圖像。
【具體實施方式】
[0039] 〔具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法）
[0040] 本發(fā)明的具有脂質(zhì)雙層膜的囊泡的分離方法，其特征在于，包含:使含有具有脂質(zhì) 雙層膜的囊泡的生物體試樣與鍵合有識別存在于上述囊泡表面的表面抗原的配體的固相 載體接觸，形成上述囊泡和上述固相載體的復(fù)合體的復(fù)合體形成工序;和清洗上述復(fù)合體 的清洗工序，在非離子性表面活性劑的存在下進行上述復(fù)合體形成工序和上述清洗工序中 的至少任一工序。
[0041] (非離子性表面活性劑）
[0042] 作為本發(fā)明的分離方法中使用的非離子性表面活性劑，優(yōu)選在分子中不含有芳香 族基團。通過使用運樣的在分子中不含有芳香族基團的非離子性表面活性劑，從而能夠在 不破壞構(gòu)成外泌體等囊泡的脂質(zhì)雙層膜的情況下，減少夾雜物對固相載體的非特異性吸 附。另外，囊泡與固相載體的捕捉反應(yīng)的反應(yīng)性提高。并且，也能夠抑制精制的外泌體對蛋 白質(zhì)組解析等的影響。
[0043] 作為上述的在分子中不含有芳香族基團的非離子性表面活性劑，可舉出聚乙二醇 型非離子性表面活性劑，對甘油、季戊四醇等多元醇加入疏水性基團而得的多元醇型非離 子性表面活性劑。
[0044] 作為上述聚乙二醇型非離子性表面活性劑，只要是具有聚環(huán)氧乙燒鏈作為親水性 基團，就沒有特別限定，可舉出聚亞烷基二醇環(huán)氧乙燒加成物、多元醇脂肪酸醋環(huán)氧乙燒加 成物、高級醇環(huán)氧乙燒加成物、脂肪酸環(huán)氧乙燒加成物、高級烷基胺環(huán)氧乙燒加成物、脂肪 酸酷胺環(huán)氧乙燒加成物、油脂的環(huán)氧乙燒加成物等。
[0045] 其中，從非特異性吸附減少效果、對囊泡的損傷少方面考慮，優(yōu)選聚亞烷基二醇環(huán) 氧乙燒加成物、多元醇脂肪酸醋環(huán)氧乙燒加成物。
[0046] 作為上述聚亞烷基二醇環(huán)氧乙燒加成物，優(yōu)選嵌段共聚型，更優(yōu)選具有由聚環(huán)氧 乙燒構(gòu)成的嵌段（W下，也稱為嵌段A)和由聚氧化亞烷基構(gòu)成的上述亞烷基的碳原子數(shù)為3 W上的嵌段（W下，也稱為嵌段B)的嵌段共聚物。另外，作為嵌段B中含有的亞烷基氧基的碳 原子數(shù)，優(yōu)選3~6,更優(yōu)選3或者4,特別優(yōu)選3。應(yīng)予說明，嵌段B中含有的亞烷基氧基的碳原 子數(shù)為3的聚亞烷基二醇環(huán)氧乙燒加成物為聚丙二醇環(huán)氧乙燒加成物。
[0047] 另外，作為嵌段A的合計含量，在嵌段共聚物中，優(yōu)選15~99質(zhì)量％，更優(yōu)選50~99 質(zhì)量％，進一步優(yōu)選60~95質(zhì)量％，特別優(yōu)選70~90質(zhì)量％。
[0048] 另外，作為嵌段B的合計含量，從細胞毒性的觀點考慮，在嵌段共聚物中，優(yōu)選1~ 85質(zhì)量％，更優(yōu)選1~50質(zhì)量％，進一步優(yōu)選5~40質(zhì)量％，特別優(yōu)選10~30質(zhì)量％。
[0049] 應(yīng)予說明，運些含量可W用NMR等進行測定，嵌段A為2個W上時，表示2個W上的嵌 段A的各含量的合計值。同樣地嵌段B為2個W上時，為2個W上的嵌段B的各含量的合計值。
[0050] 運樣的聚亞烷基二醇環(huán)氧乙燒加成物中，優(yōu)選普朗尼克型非離子性表面活性劑等 所例示的那樣的具有W2個嵌段A夾著嵌段B的結(jié)構(gòu)的ABA型=嵌段共聚物。
[0化1] 作為聚亞烷基二醇環(huán)氧乙燒加成物的市售品，例如，可舉出Pluronic F-