使用納米孔的高速分子感測的制作方法
【專利說明】使用納米孔的高速分子感測
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年10月23日提交的美國臨時申請?zhí)?1/894,577的權(quán)益，該申請W 引用的方式整體并入本文。
[000；3]背景
[0004] 基因組分析中的一些應用需要拷貝數(shù)變化的檢測。例如，產(chǎn)前篩查可確定染色體 13、19和21的某些部分是否在胎兒自由浮動脫氧核糖核酸(DNA)中復制或缺失。實現(xiàn)此舉的 一種方式是針對選擇染色體上的具體區(qū)域富集完整基因組樣品（例如，經(jīng)由PCR)。然而，PCR 可W數(shù)種不同方式在產(chǎn)物中引入偏差或誤差，包括酶的速率之間的不一致或引物對特定位 點的結(jié)合親和力之間的差異。
[0005] 發(fā)明簡述
[0006] 本文描述使用納米孔來捕獲和確定分子的身份的方法、設備和系統(tǒng)。所述分子可 使用大量的納米孔(例如，在1小時內(nèi)讀取180百萬個分子的132,000個納米孔）W平行方式 快速地進行計數(shù)、分選和/或分箱。分子的運種快速捕獲和讀取可用于捕獲探針分子或已經(jīng) 產(chǎn)生W代表最初的難W檢測的分子或最初分子的部分的其它分子。運可用于例如檢測核酸 (例如DNA)多態(tài)現(xiàn)象，如拷貝數(shù)變化。可發(fā)生樣品分子或樣品分子的代用品的精確計數(shù)。本 文所述的方法和設備可尤其替換流式細胞儀和其它計數(shù)儀器(例如，當相對于流式細胞儀 提供增加的精確度和通量時）。在一些情況下，所述設備和方法捕獲特定分子或分子的代用 品并且保持于所述納米孔中并且接著將其噴射于潔凈溶液中W類似于流式細胞儀執(zhí)行捕 獲、分選和分箱功能。
[0007] -方面，本公開提供一種用于分子計數(shù)和/或分選的方法，所述方法包括：（a)提供 納米孔的陣列，其中所述陣列的個別納米孔可通過鄰近感測電極單獨尋址；（b)提供多個各 自包含核巧酸的標記物，其中所述核巧酸中的至少兩種與核酸樣品雜交，并且其中所述標 記物能夠由所述個別納米孔捕獲并且使用所述感測電極鑒別；W及(C)用所述納米孔的陣 列W每秒每個納米孔至少約1個標記物的速率捕獲并且鑒別所述標記物。
[000引在一些實施方案中，所述感測電極W法拉第模式操作。
[0009] 在一些實施方案中，所述感測電極W非法拉第模式操作。
[0010] 在一些實施方案中，所述核酸樣品來源于患者。
[0011] 另一方面，本公開提供一種用于分子計數(shù)和/或分選的方法，所述方法包括：（a)提 供納米孔的陣列，其中所述陣列的個別納米孔可通過W非法拉第模式操作的鄰近感測電極 單獨尋址；（b)提供多個能夠由所述個別納米孔捕獲并且使用所述感測電極鑒別的標記物； W及(C)用所述納米孔的陣列W每秒每個納米孔至少約1個標記物的速率捕獲并且鑒別所 述標記物。
[0012] 在一些實施方案中，所述標記物W每秒每個納米孔至少約四個標記物的速率被捕 獲并且鑒別。
[0013] 在一些實施方案中，所述多個標記物包含至少四種不同標記物。
[0014] 在一些實施方案中，所述標記物包含具有至少四種不同長度的尾端。
[0015] 在一些實施方案中，所述標記物基于所述標記物離開所述納米孔時的電壓來鑒 別。
[0016] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括從所述納米孔釋放所述被捕獲的標記 物。
[0017] 在一些實施方案中，所述多個標記物包含待分選的標記物，其中所述待分選的標 記物被捕獲、鑒別并且保持于所述納米孔中，并且其中除所述待分選的標記物外的標記物 被捕獲、鑒別并且從所述納米孔釋放。
[0018] 在一些實施方案中，所述待分選的標記物成組釋放并且加 W收集。
[0019] 在一些實施方案中，當待分選的標記物的數(shù)目除W由所述納米孔捕獲并且鑒別的 標記物的剩余數(shù)目的比率增加超過闊值時，所述待分選的標記物成組釋放。
[0020] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括定量構(gòu)成標記物的總數(shù)的不足約0.05% 的標記物。
[0021] 在一些實施方案中，其中所述捕獲和鑒別包含每小時捕獲并且鑒別至少約1百萬 個標記物。
[0022] 在一些實施方案中，所述速率為每小時至少約100百萬個標記物。
[0023] 在一些實施方案中，所述速率為每小時至少約10億個標記物。
[0024] 在一些實施方案中，所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約8種不同類型的標 記物。
[0025] 在一些實施方案中，所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約32種不同類型的 標記物。
[0026] 在一些實施方案中，所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約100種不同類型的 標記物。
[0027] 在一些實施方案中，所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約500種不同類型的 標記物。
[0028] 在一些實施方案中，所述捕獲和鑒別包含計數(shù)和/或分選至少約500種不同類型的 標記物
[0029] 在一些實施方案中，所述納米孔的陣列被配置為具有多個能夠?qū)Σ煌瑯悠穲?zhí)行所 述方法的區(qū)域。
[0030] 在一些實施方案中，所述標記物基于流動通過所述個別納米孔的電流和/或所述 標記物離開所述納米孔時的電壓來鑒別。
[0031] 在一些實施方案中，所述標記物各自包含附接于珠粒的單鏈核酸分子。
[0032] 在一些實施方案中，所述標記物如下產(chǎn)生：（a)使第一探針與核酸樣品雜交；（b)使 第二探針與鄰近于所述第一探針的所述核酸樣品雜交；（C)使所述第一探針接合于所述第 二探針W產(chǎn)生組合探針；W及(d)用附接于寡核巧酸的珠粒捕獲所述組合探針，其中所述寡 核巧酸與所述組合探針雜交。
[0033] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括確定所述核酸樣品中的核酸序列的拷貝 數(shù)變化。
[0034] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括檢測拷貝數(shù)的差異，所述差異小于或等 于約0.05%。
[0035] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括定量所述核酸樣品中的相對RNA表達水 平。
[0036] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括對所述核酸樣品執(zhí)行化ISA測定。
[0037] 在一些實施方案中，所述第一探針包含約20個與約50個之間的核巧酸。
[0038] 在一些實施方案中，所述第二探針包含約20個與約50個之間的核巧酸。
[0039] 在一些實施方案中，所述第一探針包含生物素。
[0040] 在一些實施方案中，所述珠粒為磁性的。
[0041] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括用磁場集中鄰近或接近于所述納米孔的 陣列的標記物。
[0042] 另一方面，本公開提供一種用于測序、計數(shù)和/或分選分子的方法，所述方法包括： (a)提供納米孔的陣列，其中所述陣列的個別納米孔可通過W非法拉第模式或法拉第模式 操作的鄰近感測電極單獨尋址；（b)提供多個磁吸珠粒，所述珠粒各自偶合于待使用所述納 米孔的陣列測序、計數(shù)和/或分選的多個分子中的分子；
[0043] 用磁鐵集中在所述納米孔的陣列附近的磁吸珠粒；W及(C)用所述納米孔的陣列 測序、計數(shù)和/或分選所述分子。
[0044] 在一些實施方案中，所述磁吸珠粒包含金屬。
[0045] 在一些實施方案中，所述磁吸珠粒包含永磁材料。
[0046] 在一些實施方案中，在集中所述磁吸珠粒之前，所述磁吸珠粒的濃度為至多100飛 摩爾濃度。
[0047] 在一些實施方案中，在集中所述磁吸珠粒之前，所述磁吸珠粒的濃度為至多10飛 摩爾濃度。
[0048] 在一些實施方案中，靠近所述納米孔的陣列的所述磁吸珠粒的濃度通過所述集中 增加至少100倍。
[0049] 所屬領域的技術人員由W下詳細描述將顯而易知本公開的額外方面和優(yōu)勢，其中 僅展示并且描述本公開的說明性實施方案。如應了解，本公開能夠具有其它和不同的實施 方案，且其若干詳情能夠在各種明顯方面具有修改，均未偏離本公開。因此，所述圖式和描 述應實際上被視為說明性的，而非限制性的。
[0050] 通過引用并入
[0051] 本說明書中所提及的所有公布、專利和專利申請均W引用的方式并入本文，其并 入程度就如同各個別公布、專利或?qū)＠暾執(zhí)囟ǖ厍覀€別地指示W(wǎng)引用的方式并入一般。 [0化 2] 附圖簡述
[0053] 本發(fā)明的新穎特征尤其在隨附權(quán)利要求書中陳述。對本發(fā)明的特征和優(yōu)勢的更好 了解將參考W下詳細描述和附圖（本文中也為"圖"）來獲得，所述詳細描述陳述其中利用本 發(fā)明的原理的說明性實施方案，在所述附圖中：
[0054] 圖1示意性地展示所述方法的步驟；
[0055] 圖2A、2B和2C展示納米孔檢測器的實例，其中圖2A具有安置于電極上的納米孔，圖 2B具有插入加樣孔上方的膜中的納米孔并且圖2C具有在突出電極上方的納米孔；
[0056] 圖3展示納米孔檢測器的陣列；
[0057] 圖4展示分成兩個通道的納米孔的陣列；
[0058] 圖5展示由傳遞至納米孔中的標記物實體(或標記物)產(chǎn)生的信號的實例；
[0059] 圖6展示小型傳感器電路的實例；
[0060] 圖7展示使用納米孔來計數(shù)、分選或分箱標記物實體的實例；
[0061 ]圖8展示標記物實體和用于產(chǎn)生標記物實體的方法的實例；
[0062] 圖9展示具有單向閩口的標記物實體的實例；
[0063] 圖10展示標記物實體基于其脫落電壓的鑒別的實例；
[0064] 圖11展示使用所述脫落電壓來校準外加電壓的實例；
[0065] 圖12展示用于分選和分箱分子實體的設備和/或方法的實例；W及
[0066] 圖13展示經(jīng)程序化或W其它方式配置來實施本公開的方法的計算機系統(tǒng)的實例。
[0067] 詳述
[0068] 雖然本文已經(jīng)展示并且描述本發(fā)明的各種實施方案，但所屬領域的技術人員應顯 而易見，所述實施方案僅舉例提供。多種變化、改變和取代可由所屬領域的技術人員想到， 而不偏離本發(fā)明。應了解，可采用本文所述的本發(fā)明的實施方案的多種替換物。
[0069] 如本文所用，術語"納米孔"一般是指在膜中形成或W其它方式提供的孔、通道或 通路。膜可為有機膜，如脂質(zhì)雙層，或合成膜，如由聚合材料形成的膜。膜可為聚合材料。納 米孔可鄰近或接近于感測電路或與感測電路禪合的電極安置，所述感測電路例如為互補金 屬氧化物半導體(CMOS)或場效應晶體管(FET)電路。在一些實施例中，納米孔具有大約0.1 納米(nm)至約1000 nm的特征性寬度或直徑。一些納米孔為蛋白。a-溶血素為蛋白納米孔的 實例。
[0070] 如本文所用，術語"核酸"一般是指包含一個或多個核酸亞單位的分子。核酸可包 括選自腺巧(A)、胞喀晚(C)、鳥嚷嶺(G)、胸腺喀晚(T)和尿喀晚化)或其變體的一個或多個 亞單位。核巧酸可包括4、(：、6、1'或11，或其變體。核巧酸可包括任何可并入生長中的核酸鏈的 亞單位。所述亞單位可為A、C、G、T或U，或者對一個或多個互補A、C、G、T或U具有特異性或與 嚷嶺（即A或G，或其變體)或喀晚（即C、T或U，或其變體)互補的任何其它亞單位。亞單位可使 得個別核酸堿基或成組的堿基(例如，44^4、41'、6(：、〔6、(：1'、1'(：、61'^6、4(：、〔4或其尿喀晚對 應物)能夠被解析。在一些實施例中，核酸為脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其衍 生物。核酸可為單鏈或雙鏈。
[0071] 如本文所用，術語"聚合酶"一般是指任何能夠催化聚合反應的酶。聚合酶的實例 包括不限于核酸聚合酶或連接酶。聚合酶可為聚合作用的酶。
[007。方法和設備
[0073] -方面，本公開提供用于分子計數(shù)和/或分選的方法和設備，其包括提供納米孔的 陣列，其中各納米孔可單獨尋址并且鄰近于感測電極安置?？蓡为殞ぶ返募{米孔可各自提 供其本身的電子信號(例如，使用所述感測電極）。在一些情況下，施加于各可單獨尋址的納 米孔的電壓可單獨加 W控制。在一些情況下，所述納米孔被分組，其中各組納米孔相對于彼 此可單獨尋址(例如，提供信號和/或可具有單獨施加的電