壓）。
[0074] 所述方法可包括提供多個能夠由所述納米孔捕獲并且鑒別的標(biāo)記物實(shí)體(本文中 也為"標(biāo)記物"）。所述標(biāo)記物實(shí)體可為任何能夠由所述納米孔捕獲并且鑒別的分子或分子 復(fù)合物。本公開提供標(biāo)記物實(shí)體和分子實(shí)體的一些實(shí)例。
[0075] 在一些情況下，所述方法包括用所述納米孔的陣列捕獲并且鑒別所述標(biāo)記物實(shí) 體。所述感測電極可W非法拉第(或電容)感測模式操作(例如，其中所述電極和電解質(zhì)不執(zhí) 行氧化還原反應(yīng)）。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記物實(shí)體快速地(例如，W每秒每個納米孔至 少約1個標(biāo)記物實(shí)體的速率)被捕獲并且鑒別。
[0076] 圖1展示所述方法的步驟的實(shí)例。在一些情況下，所述標(biāo)記物由核酸樣品產(chǎn)生。所 述核酸樣品可從生物體、組織或細(xì)胞提取。所述標(biāo)記物實(shí)體可根據(jù)本文所述的方法制備(參 見例如圖8和相應(yīng)正文）。所述標(biāo)記物實(shí)體可借助于納米孔陣列檢測。
[0077] 本公開的設(shè)備和方法可能夠檢測和/或計(jì)數(shù)數(shù)種不同的標(biāo)記物實(shí)體(例如，在同一 納米孔上和/或平行位于所述納米孔陣列的不同部分上）。所述方法可能夠計(jì)數(shù)和/或分選 任何適合數(shù)目的標(biāo)記物實(shí)體。在一些情況下，所述方法能夠計(jì)數(shù)和/或分選約巧巾、約巧中、約 4種、約5種、約6種、約7種、約8種、約10種、約12種、約15種、約20種、約25種、約30種或約50種 不同類型的標(biāo)記物實(shí)體。在一些情況下，所述方法能夠計(jì)數(shù)和/或分選至少約巧巾、至少約3 種、至少約4種、至少約5種、至少約6種、至少約7種、至少約8種、至少約10種、至少約12種、至 少約15種、至少約20種、至少約25種、至少約30種或至少約50種不同類型的標(biāo)記物實(shí)體。
[007引納米孔陣列
[0079] 本文提供借助于納米孔來計(jì)數(shù)、分箱和分選的系統(tǒng)和方法。所述納米孔可形成或 W其它方式包埋于鄰近于感測電路的感測電極安置的膜中，所述電路如集成電路。所述集 成電路可為專用集成電路(ASIC)。在一些實(shí)施例中，所述集成電路為場效應(yīng)晶體管或互補(bǔ) 金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)。所述感測電路可位于具有所述納米孔的忍片或其它設(shè)備中，或 脫離所述忍片或設(shè)備，如在忍片外配置中。所述半導(dǎo)體可為任何半導(dǎo)體，包括不限于IV族 (例如娃)和III-V族半導(dǎo)體(例如神化嫁）。
[0080] 在一些情況下，當(dāng)標(biāo)記物實(shí)體流動通過或鄰近于所述納米孔時(shí)，所述感測電路檢 測與所述標(biāo)記物實(shí)體相關(guān)的電信號。所述標(biāo)記物實(shí)體可為較大分子的亞單位。所述標(biāo)記物 實(shí)體可為核巧酸并入事件或在標(biāo)記的核酸與所述納米孔或鄰近于所述納米孔的物質(zhì)之間 的其它相互作用的副產(chǎn)物，所述物質(zhì)如從核酸裂解標(biāo)記物實(shí)體的酶。所述標(biāo)記物實(shí)體可保 持附接于核酸?？墒占瘷z測到的信號并且將其存儲于存儲單元中，并且稍后用于計(jì)數(shù)所述 標(biāo)記物實(shí)體?？蓪κ占男盘栠M(jìn)行處理W解釋檢測到的信號中的任何異常，如誤差。
[0081] 圖2展示如可根據(jù)美國專利申請公布號2011/0193570中所述的方法制備的具有溫 度控制的納米孔檢測器(或傳感器）的實(shí)例，所述公布W引用的方式整體并入本文。參考圖 2A，所述納米孔檢測器包含與導(dǎo)電溶液(例如鹽溶液)207接觸的頂部電極201。底部導(dǎo)電電 極202靠近、鄰近或接近于插入膜205中的納米孔206。在一些情況下，底部導(dǎo)電電極202包埋 于半導(dǎo)體203中，其中在半導(dǎo)體襯底204中包埋有電路。半導(dǎo)體203的表面可被處理成疏水性 的。所檢測的具有標(biāo)記物實(shí)體的樣品穿過納米孔206中的孔。半導(dǎo)體忍片傳感器放置于包裝 208中，而包裝208又在溫度控制元件209附近。溫度控制元件209可為熱電加熱和/或冷卻設(shè) 備(例如，帕爾貼設(shè)備）。多個納米孔檢測器可形成納米孔陣列。
[0082] 參考圖2B，其中相同的數(shù)字表示相同的元件，膜205可安置于加樣孔210上方，其中 傳感器202形成加樣孔的表面的一部分。圖2C展示一個實(shí)例，其中電極202從處理過的半導(dǎo) 體表面203突出。
[0083] 在一些實(shí)例中，膜205在底部導(dǎo)電電極202上形成，而非在半導(dǎo)體203上形成。膜205 在所述情況下可與底部導(dǎo)電電極202形成禪合相互作用。然而，在一些情況下，膜205在底部 導(dǎo)電電極202和半導(dǎo)體203上形成。作為替換，膜205可在半導(dǎo)體203上形成，而非在底部導(dǎo)電 電極202上形成，但可延伸超過底部導(dǎo)電電極202。
[0084] 納米孔可用于間接地計(jì)數(shù)、分選或分箱標(biāo)記物實(shí)體，在一些情況下使用電檢測。間 接檢測可為其中標(biāo)記物實(shí)體并未傳遞通過納米孔的任何方法。所述標(biāo)記物實(shí)體可在相距 和/或接近于納米孔的任何適合距離內(nèi)傳遞，在一些情況下在使得標(biāo)記物實(shí)體在納米孔中 被檢測到的距離內(nèi)傳遞。
[0085] 核巧酸并入事件的副產(chǎn)物可通過納米孔檢測。"核巧酸并入事件"為將核巧酸并入 生長中的聚核巧酸鏈中。副產(chǎn)物可與給定類型的核巧酸的并入有關(guān)。核巧酸并入事件一般 由如DNA聚合酶的酶催化，并且使用與模板分子的堿基對相互作用在可用于在各位置處并 入的核巧酸中進(jìn)行選擇。在一些情況下，所述標(biāo)記物實(shí)體用于對核酸分子測序。
[0086] 所述納米孔可形成陣列。本公開提供用于檢測標(biāo)記物實(shí)體的納米孔檢測器(或傳 感器)的陣列。參考圖3,多個標(biāo)記物實(shí)體可在納米孔檢測器的陣列上檢測到。此處，各納米 孔位置(例如301)均包含納米孔，在一些情況下所述納米孔附接于聚合酶和/或憐酸酶。在 如本文別處所述的各陣列位置處一般還有傳感器。所述納米孔各自可單獨(dú)尋址。
[0087] 所述納米孔的陣列可具有任何適合數(shù)目的納米孔。在一些情況下，所述陣列包含 約200、約400、約600、約800、約1000、約1500、約2000、約3000、約4000、約5000、約10000、約 15000、約20000、約40000、約60000、約80000、約100000、約200000、約400000、約600000、約 800000、約1000000個納米孔等。所述陣列可包含至少200、至少400、至少600、至少800、至少 1000、至少1500、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少10000、至少15000、至少 20000、至少 40000、至少 60000、至少 80000、至少 100000、至少 200000、至少 400000、至少 600000、至少800000或至少1000000個納米孔。
[0088] 在一些情況下，標(biāo)記物實(shí)體靠近納米孔提供或集中（例如，磁力地）。鄰近于納米孔 的納米孔傳感器可檢測個別標(biāo)記物實(shí)體，或多個標(biāo)記物實(shí)體?？蓹z測到與標(biāo)記物實(shí)體有關(guān) 的一個或多個信號，并且對其進(jìn)行處理W產(chǎn)生平均信號。
[0089] 標(biāo)記物實(shí)體可由所述傳感器隨時(shí)間檢測。隨時(shí)間檢測到的標(biāo)記物實(shí)體可用于確定 所述標(biāo)記物實(shí)體的身份，如借助于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(參見例如圖13)，所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)經(jīng)程序化 W記錄傳感器數(shù)據(jù)并且由所述數(shù)據(jù)產(chǎn)生計(jì)數(shù)、分選或分箱函數(shù)。
[0090] 所述納米孔檢測器的陣列可具有高密度的離散位點(diǎn)。例如，每單位面積相對較大 數(shù)目的位點(diǎn)（即，密度）允許構(gòu)建較小設(shè)備，所述設(shè)備是便攜的、廉價(jià)的或具有其它有利特 征。所述陣列中的個別位點(diǎn)可為可單獨(dú)尋址的位點(diǎn)。包含納米孔和感測電路的大量位點(diǎn)可 允許同時(shí)檢測相對大量的標(biāo)記物實(shí)體。所述系統(tǒng)可提高通量和/或降低計(jì)數(shù)、分選或分箱的 成本。
[0091] 標(biāo)記物實(shí)體可使用具有襯底的傳感器(或檢測器)進(jìn)行檢測，所述襯底具有包含離 散位點(diǎn)的表面，各個別位點(diǎn)具有納米孔，并且在一些情況下具有附接于所述納米孔的聚合 酶和鄰近于所述納米孔的感測電路。所述系統(tǒng)可進(jìn)一步包括與所述襯底流體連通的流槽， 所述流槽經(jīng)調(diào)適W遞送一種或多種試劑至所述襯底。
[0092] 所述表面包含任何適合密度的離散位點(diǎn)（例如，適用于在給定的時(shí)間長度內(nèi)或W 給定的成本確定標(biāo)記物實(shí)體的密度）。各離散位點(diǎn)可包括傳感器。所述表面可具有大于或等 于每Imm2約500個位點(diǎn)的離散位點(diǎn)密度。在一些實(shí)施方案中，所述表面具有每Imm 2約200、約 300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000、約 6000、約7000、約8000、約9000、約10000、約 20000、約40000、約60000、約80000、約100000或 約500000個位點(diǎn)的離散位點(diǎn)密度。在一些情況下，所述表面具有每Imm 2至少200、至少300、 至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少2000、至少3000、至 少4000、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少10000、至少20000、至少 40000、至少60000、至少80000、至少100000或至少500000個位點(diǎn)的離散位點(diǎn)密度。
[0093] 在一些情況下，所述納米孔的陣列被配置為具有多個能夠?qū)Σ煌瑯悠穲?zhí)行所述方 法的區(qū)域(例如，通道）。所述樣品可為不同的，或所述樣品可分成獨(dú)立體積，其中對各體積 執(zhí)行不同測定。
[0094] 在一些情況下，多個加樣孔(包括加樣孔的總數(shù)的任何子集)包括公用電解質(zhì)池。 各加樣孔可具有安置于其上方的具有納米孔的膜和在加樣孔下方或其中的感測電極。如圖 4中所示，加樣孔401可由壁402分成數(shù)行，使得一行加樣孔共有在所述加樣孔上方的公用電 解質(zhì)池。如此處所述將生物忍片分割成數(shù)個區(qū)段可允許在單一生物忍片上分析多個樣品 (例如，通過將不同樣品放入所述忍片的不同區(qū)段中）。
[00巧]感測電極和其操作
[0096] 標(biāo)記物實(shí)體可基于流動通過所述納米孔的電流和/或所述標(biāo)記物實(shí)體離開所述納 米孔(或從其去除）的電壓(例如脫落電壓)來鑒別。圖5展示預(yù)言曲線，其中標(biāo)記物實(shí)體隨時(shí) 間阻斷流動通過所述納米孔的電流。所述電流在所述納米孔中不存在標(biāo)記物實(shí)體的情況下 處于基線水平505下。當(dāng)不同標(biāo)簽位于所述納米孔中時(shí)（例如501、502、503、504)，所述電流 可降低至不同程度。下文描述標(biāo)記物實(shí)體基于脫落電壓的檢測。
[0097] 所述電流可用感測電極(例如，其可包括感測電路或與感測電流電連通)檢測。所 述感測電極可能夠?yàn)榉ɡ诨蚍欠ɡ诟袦y模式。
[0098] 在法拉第導(dǎo)電模式中，金屬電極和導(dǎo)電鹽可反應(yīng)(例如執(zhí)行氧化/還原(氧化還原） 反應(yīng)）W形成新的金屬物質(zhì)和電子，所述電子稍后由所述忍片的傳感器電路感測。在法拉第 模式中，可通過電極之間的外加電勢產(chǎn)生離子流，從而可使所述電極與溶液中的離子反應(yīng)。 在氯化銀(AgCl)電極的實(shí)例中，在外加電勢下在一個電極處的過量電子可使氯陰離子被排 出，而在另一電極處電子的缺乏可使存在的銀(Ag)與Cr反應(yīng)并且形成AgCl。運(yùn)一系統(tǒng)（例 如，還原：電子+AgCl□Ag(s)+C^;氧化:C^+Ag(s)□AgCl+電子)被描述為法拉第的并且可 代表使用任何金屬的氧化和還原來產(chǎn)生離子流的任何模型。為了在操作所述系統(tǒng)時(shí)在所述 電極處維持Ag和AgCl的平衡并且為了幫助存在于雙層或膜和納米孔的任一側(cè)上的平衡粒 子，可有必要偶爾地(或頻繁地)逆轉(zhuǎn)所述電極上的電勢W逆轉(zhuǎn)所述反應(yīng)。
[0099] 所述離子流也可通過非法拉第方式產(chǎn)生。在非法拉第模式(本文中也為"電容模 式"和"快速模式"）中，所述金屬電極和所述鹽一般不反應(yīng)(例如，并且不執(zhí)行氧化還原反 應(yīng)）。結(jié)果可為，所述金屬電極一般不形成新的物質(zhì)。在非法拉第模式中，可通過在存在于金 屬與鹽或液體之間的電容雙層上施加電壓(或電勢）降來建立鹽離子流。在電勢下，所述雙 層的電容可為實(shí)質(zhì)上足夠的，使得所述雙層可導(dǎo)電并且保留電荷直至所述雙層（電容器)達(dá) 到其存儲電荷的最大能力。去除所述電勢并且使電容器通過納米孔放電可產(chǎn)生鹽離子流， 其可由傳感器電路檢測。通過足夠快地轉(zhuǎn)換電壓(例如，轉(zhuǎn)換所述電壓的極性或量值），可將 一系列放電周期串聯(lián)在一起，所述放電周期在時(shí)間上足夠接近W檢測并且表示與納米孔相 互作用的分子的效應(yīng)。運(yùn)種技術(shù)具有允許極小的金屬或非金屬導(dǎo)電電極產(chǎn)生離子和電流而 不會使所述電極在實(shí)驗(yàn)過程中降級或改變的優(yōu)勢。
[0100] 電容方法可用于從電極吸引和排斥離子，但所述離子無法在所述電極的表面處引 起化學(xué)反應(yīng)。還可在所述電極處誘導(dǎo)電子流;然而，其可為電荷影響而非物理化學(xué)反應(yīng)和電 子發(fā)射或捕獲的結(jié)果。W非法拉第方法操作電荷和離子流也