專利名稱：用納米孔的分析物測(cè)序的制作方法
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背景技木DNA中編碼的信息對(duì)醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)具有至上重要性。人基因組的標(biāo)位革命化遺傳病癥理解和疾病的預(yù)測(cè)，及會(huì)輔助發(fā)展治療?？焖俸筒话嘿F地測(cè)序DNA的能力是個(gè)別化的醫(yī)學(xué)及科學(xué)研究所必要的。需要超過原Sanger測(cè)序的新測(cè)序技術(shù)的開發(fā)來達(dá)到這些目標(biāo)。甚至更優(yōu)選的是可應(yīng)用于除了核酸之外的聚合物的新測(cè)序技木。發(fā)明概述因此，一些實(shí)施方式提供對(duì)2個(gè)或更多用至少第I阻攔構(gòu)建體和第2阻攔構(gòu)建體修飾的分析物單元進(jìn)行測(cè)序的方法，其包括(a)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和修飾的分析物的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的納米孔，其中納米孔包含提供順式側(cè)和反式側(cè)之間的液體交通的開ロ ；(b)使修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生第I離子電流水平，其中第I離子電流水平代表第I單元；(c)改變修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)；(d)使修飾的分析物的第2阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生代表第2単元的第2離子電流水平；及(e)將第I離子電流水平和第2離子電流水平與已知的単元的已知的離子電流水平進(jìn)行比較，由此對(duì)2個(gè)或更多分析物單元進(jìn)行測(cè)序。也提供的是對(duì)核酸的2個(gè)或更多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法，其包括(a)提供包含至少2個(gè)各定義為Xn的未知的核苷酸或未知的重復(fù)核苷酸組的核酸，其中n=l 1，000，000,且其中各X和各η可相同或不同；將第I插入物阻攔構(gòu)建體和第2插入物阻攔構(gòu)建體放入核酸，各包含雙鏈核酸和各與Xn相鄰，以提供修飾的核酸；(c)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和修飾的核酸的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的突變MspA孔蛋白；Cd)使第I插入物阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入突變MspA孔蛋白的隧道后中止修飾的核酸，由此產(chǎn)生第I離子電流水平，其中第I離子電流水平代表第IXn ; (e)改變第I插入物阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的核酸向反式側(cè)前進(jìn)；(f)使修飾的核酸的第2插入物阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止，由此產(chǎn)生代表第2Xn的第2離子電流水平；及(g)將第I離子電流水平和第2離子電流水平與已知的Xn的離子電流水平進(jìn)行比較，由此對(duì)核酸的2個(gè)或更多核苷酸進(jìn)行測(cè)序。也提供的是將離子電流水平與已知的分析物單元關(guān)聯(lián)的方法，其包括(a)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和用2個(gè)或更多阻攔構(gòu)建體修飾且含有全部已知的目標(biāo)單元的分析物的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的納米孔，其中納米孔包含提供順式側(cè)和反式側(cè)之間的液體交通的開ロ ；(b)使修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生離子電流水平，其中離子電流水平代表第I已知的分析物單元；(c)改變修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)；(d)使修飾的分析物的第2阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生代表第2単元的第2離子電流水平；及(e)用含有全部単元及對(duì)應(yīng)目標(biāo)離子電流水平的已知的修飾的分析物校準(zhǔn)納米孔和任選地獲得分隔物水平，由此將各離子電流水平與已知的分析物單元關(guān)聯(lián)。
還提供的是減緩或促進(jìn)修飾的分析物通過納米孔的開ロ轉(zhuǎn)位的速度的方法，其包括Ca)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和修飾的分析物的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì) 的反式側(cè)之間定位的納米孔；(b)使修飾的分析物的阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生一個(gè)或更多離子電流水平，其中各離子電流水平是可區(qū)分的；及(C)改變至少修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)；其中修飾的分析物具有小于分析物在修飾和改變的缺失下通過隧道轉(zhuǎn)位的平均轉(zhuǎn)位速度的經(jīng)開ロ平均轉(zhuǎn)位速度。系統(tǒng)也在本文提供，諸如包含具有開ロ的納米孔的系統(tǒng)，其中納米孔定位在第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和第2導(dǎo)電液體介質(zhì)之間，其中至少ー個(gè)液體介質(zhì)包含定義為修飾的核酸的修飾的分析物。

本發(fā)明的上述方面和許多伴隨優(yōu)勢(shì)會(huì)變得更容易被同意，如通過參考以下詳述結(jié)合附圖變得更佳明白。圖I描繪MspA的晶體結(jié)構(gòu)。使用空間填充模型的通過Ml-NNN-MspA的結(jié)構(gòu)的交叉-截面圖顯示氨基酸類紅是帶正電的；藍(lán)是帶負(fù)電的；紫是極性的；黃是疏水-脂肪族；橙是疏水-芳族。見 Science 303:1189 (2004)。圖2A，2B, 2C和2D描繪通過納米孔MspA的DNA轉(zhuǎn)位?？ㄍ枥L通過MspA的DNA轉(zhuǎn)位和得到的殘余電流。圖2A:正電壓吸引帶負(fù)電的發(fā)卡DNA進(jìn)入孔隙。圖2B:DNA穿過孔隙直到更寬發(fā)卡雙鏈體防止進(jìn)ー步轉(zhuǎn)位。圖2C :幾個(gè)ms之后，發(fā)卡解離允許完全轉(zhuǎn)位。圖2D :得到的與以上卡通關(guān)聯(lián)的電流跡顯示，存在于孔隙的發(fā)卡DNA允許殘余電流，Ires，直到發(fā)卡雙鏈體解離。圖3A和3B提供平均的殘余離子電流，<Ires>的例直方圖，其顯示14bp發(fā)卡(hp)的不同"同聚物"單鏈尾。在(a) 180mV及(b) 140mV取數(shù)據(jù)。包括在圖3A的轉(zhuǎn)位具有相比Ims更長的持續(xù)時(shí)間及掲示可區(qū)分的和良好-解析的電流水平。許多實(shí)驗(yàn)的擬合的高斯平均值的平均提供于下例。有用各發(fā)卡DNA的至少4個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。在140mV寬度減小是由于作為解離時(shí)間平均增加的時(shí)間是相比在180mV的解離時(shí)間的幾乎30X更長。附加信息可見于表A。圖4A，4B，4C和4D提供由于在另外聚_dA發(fā)卡尾中單核苷酸取代的殘余電流直方圖。圖4A :為比較目的，圖4A總結(jié)在ISOmV同聚物發(fā)卡尾Ires的平均的高斯平均值和寬度(在下例中描述擬合值)。黑色，藍(lán)色，紅色和綠色的顏色用于輔助分離分別由于dA，dG，dC和dT對(duì)Iras的效應(yīng)。殘余電流隨著在另外聚-dA同聚物發(fā)卡(hp)尾內(nèi)單核苷酸dNx的位置，X而顯著變化。圖4B :當(dāng)核苷酸取代與雙鏈末端相鄰，x=l，殘余電流偏離以模擬與取代的核苷酸關(guān)聯(lián)的同聚物值。ClT1取代最接近地模擬IdT。圖4C:在x=2，核苷酸取代也導(dǎo)致殘余電流更接近與取代的核苷酸關(guān)聯(lián)的同聚物。dC2取代最接近Id。。圖4D:隨著在x=3的任何取代，Ires僅稍微不同于IdA，提示MspA在發(fā)卡雙鏈體之后主要 敏感于2nt。在x=l,2,或3的dGx取代不顯著影響電流，如給定Ide和Itw的相對(duì)接近可預(yù)期的。
圖5A，5B和5C描繪使用MspA的雙鏈體間斷的(DI)納米孔測(cè)序的展示。將模擬分析物DNA的合成的DNA轉(zhuǎn)化為具有攜帶信息的核苷酸之間的雙鏈體。各這些雙鏈必需依次熔解，或解離，如拉DNA通過孔隙，致使殘余電流測(cè)定序列。采用選擇以代表不同分析物 序列的 DNA :3' -ATGC-5，[SEQ ID NO: I](圖 5A) ;3' -TACG-5’ [SEQ ID N0:2](圖 5B)和"盲"序列測(cè)定為3' -GTCAC-5’ [SEQ ID N0:3](圖5C)。殘余電流的例跡顯示在各圖5A，5B和5C的左側(cè)。殘余電流中的各步驟是由14bp DNA雙鏈體把持的MspA的收縮之內(nèi)的3個(gè)核苷酸的代表。對(duì)于各這些步驟，對(duì)于N轉(zhuǎn)位，各水平的直方圖在各圖5A，5B和5C的右側(cè)顯示。這些結(jié)果從3個(gè)或更多實(shí)驗(yàn)在140mV產(chǎn)生。在更高電壓，轉(zhuǎn)位數(shù)增加(見圖10 12中的表)，但由于減少的時(shí)間平均而水平特異性減小(見表A和B和圖10 12中的表)。圖6A，6B，6C和6D是對(duì)于在同聚物發(fā)卡尾中，在遠(yuǎn)離發(fā)卡雙鏈體的位置x的核苷酸dN插入，表示為dNx的平均殘余電流，〈Ires〉的代表性的直方圖。垂直虛線指示指示的同聚物殘余電流的高斯平均值。由N給各直方圖的計(jì)數(shù)。注意同聚物背景對(duì)核苷酸取代的效應(yīng)的效應(yīng)。圖7A，7B和7C呈現(xiàn)來自對(duì)于分析物DNA，3' ATGC5 ' [SEQ ID N0:1](左欄)3’TACG 5’ [SEQ ID N0:2](中欄)及盲 DNA 測(cè)定為 3’GTCAC 5’ [SEQ ID N0:3](右欄)，在140mV的施加的電壓的DI-測(cè)序例的數(shù)據(jù)。各組圖含(a)含有4 (或5)個(gè)水平的一例電流跡，(b)對(duì)于自具有4 (或5)個(gè)水平的多個(gè)事件的各水平的各平均電流的直方圖，及(c)指示對(duì)于直方圖中的多個(gè)事件的電流水平之間的轉(zhuǎn)變的密度標(biāo)繪圖。未阻斷的孔隙電流是237. 0± I. OpA (平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差)。用各DI-DNA進(jìn)行3或更大個(gè)體實(shí)驗(yàn)。圖8A，8B和8C代表以類似于圖7A，7B和7C的形式，但對(duì)于160mV的施加的電壓的數(shù)據(jù)。未阻斷的孔隙電流是294. 7±0. SpA (平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差)。圖9A，9B和9C代表以類似于圖8A，8B和8C的形式，但對(duì)于180mV的施加的電壓的數(shù)據(jù)。未阻斷的孔隙電流是325. 1±1. SpA (平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差)。在更高電壓，區(qū)別電流跡中的獨(dú)特水平變得更難，因?yàn)殡娏魉降臏p少的時(shí)間-平均。圖10 12在以上圖5A，5B和5C的圖標(biāo)及以下實(shí)施例中所述。發(fā)明詳述本文提供用于測(cè)序分析物單元的方法和系統(tǒng)。一般而言，測(cè)序可如下發(fā)生。在天然狀態(tài)，分析物單元能通過納米孔的開口轉(zhuǎn)位。分析物通過孔隙的轉(zhuǎn)位可對(duì)于溶解分析物單元的組合物太快。阻攔構(gòu)建體用于修飾分析物，使得修飾的分析物不再能通過開口擬合。各阻攔構(gòu)建體允許修飾的分析物在開口中止，使得可檢測(cè)離子電流水平及與特定單元關(guān)聯(lián)。然后可改變阻攔構(gòu)建體，以提供現(xiàn)在能通過開口前進(jìn)的修飾的分析物。修飾的分析物包含至少第2阻攔構(gòu)建體，其導(dǎo)致開口中修飾的分析物的第2次中止，使得可檢測(cè)相關(guān)于下一單元的下一離子電流水平。第2阻攔構(gòu)建體的改變?cè)试S修飾的分析物再次通過開口前進(jìn)。修飾的分析物中有多少阻攔構(gòu)建體就可重復(fù)幾次過程，使得對(duì)各分析物單元測(cè)序。因此，一些實(shí)施方式提供對(duì)2個(gè)或更多用至少第I阻攔構(gòu)建體和第2阻攔構(gòu)建體修飾的分析物單元進(jìn)行測(cè)序的方法，其包括(a)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和修飾的分析物的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的納米孔，其中納米孔包含提供順式側(cè)和反式側(cè)之間的液體交通的開口 ；(b)使修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開口后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生第I離子電流水平，其中第I離子電流水平代表第I單元，其可為修飾的分析物中的第I單元；(c)改變修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)；(d)使修飾的分析物的第2阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開口后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生代表第2單元的第2離子電流水平；及&)將第I離子電流水平和第2離子電流水平與已知的單元的已知的離子電流水平進(jìn)行比較，由此對(duì)2個(gè)或更多分析物單元進(jìn)行測(cè)序。本文中的此或任何其他方法可根據(jù)需要通過使用修飾的分析物中第3，第4，第5，等，阻攔構(gòu)建體來重復(fù)修飾的分析物中的序列第3，第4，第5，等，單元。 在一些實(shí)施方式中，修飾的分析物包含修飾的核酸，修飾的肽或修飾的蛋白。在一些實(shí)施方式中，修飾的分析物包含修飾的核酸。在一些實(shí)施方式中，修飾的核酸包含修飾的DNA,修飾的RNA，修飾的PNA或其組合。在一些實(shí)施方式中，修飾的分析物包含使分析物與阻攔構(gòu)建體接合的接頭。修飾的分析物可還被定義為包含使核酸與阻攔構(gòu)建體接合的接頭的修飾的核酸。在一些實(shí)施方式中，修飾的分析物包含具有IMDa或更小分子量的無機(jī)部分。在其他實(shí)施方式中，修飾的分析物包含具有IMDa或更小分子量的有機(jī)部分。任選地，至少一個(gè)阻攔構(gòu)建體是插入物阻攔構(gòu)建體。在一些實(shí)施方式中，插入物阻攔構(gòu)建體是雙鏈核酸。在其他實(shí)施方式中，至少一個(gè)阻攔構(gòu)建體是懸吊物阻攔構(gòu)建體。各阻攔構(gòu)建體可相同或不同。在一些實(shí)施方式中，2個(gè)或更多阻攔構(gòu)建體不同。在一些實(shí)施方式中，修飾的分析物包含轉(zhuǎn)位起始尾。任選地，修飾的分析物是用至少2個(gè)各還被定義為雙鏈DNA的插入物阻攔構(gòu)建體修飾的ssDNA，其中各雙鏈體可相同或不同，且其中各單元是單核苷酸(例如，C)或重復(fù)核苷酸(例如，CCC)。本文公開的方法可用于鑒定分析物中的重復(fù)單元，諸如重復(fù)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)阻攔構(gòu)建體中止修飾的分析物以允許離子電流水平測(cè)定單元的同一性和另一阻攔構(gòu)建體中止修飾的分析物以產(chǎn)生不同于任何單元-特異性離子電流水平及定義為分隔物水平的離子電流水平。在一些實(shí)施方式中，分隔物水平區(qū)別分析物的連續(xù)單元。在一些實(shí)施方式中，分隔物水平區(qū)別分析物的連續(xù)及重復(fù)的單元。在一些實(shí)施方式中，周期性地設(shè)計(jì)分隔物水平以產(chǎn)生不同離子電流水平以提供檢查和。任選地，至少2個(gè)分隔物水平用于提供二進(jìn)制碼以代表分析物單元。任選地，至少一個(gè)分隔物水平提供校驗(yàn)位。當(dāng)對(duì)一個(gè)或更多修飾的分析物測(cè)序多次時(shí)，測(cè)序保真度可改善，以產(chǎn)生允許平均及共有讀數(shù)的多個(gè)電流圖案。電場(chǎng)的施加可導(dǎo)致修飾的分析物進(jìn)入開口或另外導(dǎo)致修飾的分析物移動(dòng)，諸如修飾的分析物在改變之后通過納米孔的開口移動(dòng)。在一些實(shí)施方式中，物理壓力導(dǎo)致修飾的分析物進(jìn)入開口或另外導(dǎo)致修飾的分析物移動(dòng)。在一些實(shí)施方式中，磁珠附接于反式側(cè)上的修飾的分析物，及改變由導(dǎo)致修飾的分析物進(jìn)入或通過開口行進(jìn)的磁力所導(dǎo)致，或另外導(dǎo)致修飾的分析物移動(dòng)。例如，磁珠不通過孔隙擬合，但一旦轉(zhuǎn)位起始尾使其通過孔隙，則其可使用。在一些實(shí)施方式中，改變由電壓脈沖，電壓漸變，光脈沖，或機(jī)械力脈沖所導(dǎo)致。改變可還被定義為阻攔構(gòu)建體的解離。改變可還被定義為阻攔構(gòu)建體的構(gòu)象變化。一些方法可還包括隨著其進(jìn)入開口變化修飾的分析物速度或通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的PH來改變測(cè)序靈敏度。一些方法可還包括隨著其進(jìn)入開口變化修飾的分析物速度或通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的離子強(qiáng)度來改變測(cè)序靈敏度。一些方法可還包括隨著其進(jìn)入開口變化修飾的分析物速度或通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的離子類型來改變測(cè)序靈敏度。一些方法可還包括隨著其進(jìn)入開口變化修飾的分析物速度或通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的溫度來改變測(cè)序靈敏度。一些方法可還包括隨著其進(jìn)入開口變化修飾的分析物速度或通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的粘度來改變測(cè)序靈敏度。一些方法可還包括隨著其進(jìn)入開口變化修飾的分析物速度或通過采用雙鏈-結(jié)合劑來改 變測(cè)序靈敏度。一些實(shí)施方式還包含獲得修飾的分析物。納米孔可包含固態(tài)材料，諸如氮化硅，修飾的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其組合。在一些實(shí)施方式中，納米孔是在插入雙層，膜，薄膜，或固態(tài)孔后形成隧道的蛋白。在一些實(shí)施方式中，納米孔包含在脂質(zhì)雙層中。在一些實(shí)施方式中，納米孔包含在包含分枝菌酸的人工膜中。納米孔可為具有定義隧道的前庭和收縮區(qū)域的恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白。Msp孔蛋白可為突變MspA孔蛋白。在一些實(shí)施方式中，突變MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。一些實(shí)施方式可包含通過移出，添加或取代Msp孔蛋白的至少一個(gè)氨基酸來改變修飾的分析物速度或測(cè)序靈敏度。納米孔可為α-溶血素或其變體。一些實(shí)施方式可包含通過移出，添加或取代a -溶血素或其變體的至少一個(gè)氨基酸來改變修飾的分析物速度或測(cè)序靈敏度。也提供的是對(duì)核酸的2個(gè)或更多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法，其包括(a)提供包含至少2個(gè)各定義為Xn的未知的核苷酸或未知的重復(fù)核苷酸組的核酸，其中n=l 1，000，000,且其中各X和各η可相同或不同；將第I插入物阻攔構(gòu)建體和第2插入物阻攔構(gòu)建體放入核酸，各包含雙鏈核酸和各與Xn相鄰，以提供修飾的核酸；(c)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和修飾的核酸的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的突變MspA孔蛋白；(d)使第I插入物阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入突變MspA孔蛋白的隧道后中止修飾的核酸，由此產(chǎn)生第I離子電流水平，其中第I離子電流水平代表第IXn ;(e)改變第I插入物阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的核酸向反式側(cè)前進(jìn)；(f)使修飾的核酸的第2插入物阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開口后中止，由此產(chǎn)生代表第2Xn的第2離子電流水平；及化)將第I離子電流水平和第2離子電流水平與已知的Xn的離子電流水平進(jìn)行比較，由此對(duì)核酸的2個(gè)或更多核苷酸進(jìn)行測(cè)序。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)插入物阻攔構(gòu)建體中止修飾的核酸以允許離子電流水平測(cè)定核苷酸的同一性，和另一插入物阻攔構(gòu)建體中止修飾的核酸以產(chǎn)生不同于任何核苷酸-特異性離子電流水平及定義為分隔物水平的離子電流水平。在一些實(shí)施方式中，分隔物水平區(qū)別核酸的連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，分隔物水平區(qū)別核酸的連續(xù)及重復(fù)的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，周期性地設(shè)計(jì)分隔物水平以產(chǎn)生不同離子電流水平以提供檢查和。任選地，至少2個(gè)分隔物水平用于提供二進(jìn)制碼以代表分析物單元。任選地，至少一個(gè)分隔物水平提供校驗(yàn)位。還提供的是將離子電流水平與已知的分析物單元關(guān)聯(lián)的方法，其包括(a)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和用2個(gè)或更多阻攔構(gòu)建體修飾且含有全部已知的目標(biāo)單元的分析物的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的納米孔，其中納米孔包含提供順式側(cè)和反式側(cè)之間的液體交通的開口 ；(b)使修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開口后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生離子電流水平，其中離子電流水平代表第I已知的分析物單元；(c)改變修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)；(d)使修飾的分析物的第2阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開口后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生代表第2單元的第2離子電流水平 '及(e)用含有全部單元及對(duì)應(yīng)目標(biāo)離子電流水平的已知的修飾的分析物校準(zhǔn)納米孔和任選地獲得分隔物水平，由此將各離子電流水平與已知的分析物單元關(guān)聯(lián)?？芍貜?fù)此或任何其他方法，以通過使用第3，第4，第5，等，阻攔構(gòu)建體來對(duì)修飾的分析物的第3，第4，第5，等，已知的單元進(jìn)行測(cè)序。在一些實(shí)施方式中，各阻攔構(gòu)建體相同，及在一些實(shí)施方式中，各阻攔構(gòu)建體不同。 還提供的是減緩或促進(jìn)修飾的分析物通過納米孔的開口轉(zhuǎn)位的速度的方法，其包括Ca)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和修飾的分析物的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的納米孔；(b)使修飾的分析物的阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開口后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生一個(gè)或更多離子電流水平，其中各離子電流水平是可區(qū)分的；及((3)改變至少修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)；其中修飾的分析物具有小于分析物在修飾和改變的缺失下通過隧道轉(zhuǎn)位的平均轉(zhuǎn)位速度的經(jīng)開口平均轉(zhuǎn)位速度。也在本文提供系統(tǒng)，諸如包含具有開口的納米孔的系統(tǒng)，其中納米孔定位在第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和第2導(dǎo)電液體介質(zhì)之間，其中至少一個(gè)液體介質(zhì)包含修飾的分析物，諸如修飾的核酸。在一些實(shí)施方式中，修飾的核酸還被定義為修飾的DNA，且修飾的DNA的各阻攔構(gòu)建體是含有相同的數(shù)的核苷酸的雙鏈DNA，且各雙鏈DNA相同。在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)運(yùn)作以使修飾的核酸的阻攔復(fù)合物在進(jìn)入開口后解離。系統(tǒng)可運(yùn)作以對(duì)修飾的核酸進(jìn)行測(cè)序。包含在系統(tǒng)中的納米孔可包含在雙層，膜，薄膜，或固態(tài)孔中。在一些實(shí)施方式中，納米孔還被定義為恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白或a -溶血素或其變體。系統(tǒng)可還包含膜片鉗放大器，光學(xué)膜片鉗，數(shù)據(jù)獲取裝置，或一個(gè)或更多與第I液體介質(zhì)，第2液體介質(zhì)，或其任何組合交通的溫度調(diào)控裝置。關(guān)于光學(xué)膜片鉗，電流可翻譯為熒光，其可讀取及以類似樣式作為電流關(guān)聯(lián)。可制備系統(tǒng)以允許在多個(gè)納米孔，諸如數(shù)千或數(shù)百萬個(gè)納米孔中并行讀數(shù)。因此，任何系統(tǒng)的組分可功能性地重復(fù)，以倍增測(cè)序通量。任何系統(tǒng)也可與微流體學(xué)或自動(dòng)化適應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，用于分析物單元的離子電流水平，雖然必需彼此不同，不必需先驗(yàn)已知。由于電流水平可每個(gè)實(shí)驗(yàn)不同，可首先運(yùn)行校準(zhǔn)構(gòu)建體。例如為DNA測(cè)序，會(huì)運(yùn)行構(gòu)建體修飾的分析物，其含有全部4種核苷酸和任選地非標(biāo)準(zhǔn)(修飾的)核苷酸，諸如甲基化的C (mC)。使用本文公開的方法，各修飾的分析物單元產(chǎn)生獨(dú)特及鑒定的電流水平(例如，各離子電流水平的幅度或特征對(duì)于各分析物單元類型是獨(dú)特的)。維持各該電流水平，直到修飾的分析物前進(jìn)一個(gè)單元。分析物的序列是直接標(biāo)位進(jìn)離子電流記錄。在一些實(shí)施方式中，雙鏈核酸可暴露于第I酶，其在一條核酸鏈的每nth核苷酸的位置選擇性地切口，以暴露另一鏈的每nth核苷酸，以影響離子電流。得到的核酸可被認(rèn)為是具有多個(gè)雙鏈體的修飾的核酸，其中各雙鏈體被認(rèn)為是阻攔構(gòu)建體?？蓪?dǎo)致雙鏈體，以在進(jìn)入納米孔的開口后中止，以產(chǎn)生離子電流水平，其中各離子電流水平代表暴露的核苷酸。雙鏈體可然后被解離以提供改變的核酸，其然后可通過開口前進(jìn)，直到下一雙鏈體中止移動(dòng)，以允許待檢測(cè)的另一離子電流水平與下一單元相關(guān)。各離子電流水平可然后與已知的核苷酸的已知的離子電流水平比較，而已知的雙鏈終止，由此測(cè)序每nth核苷酸。與第I雙鏈核酸具有同一性的第2雙鏈核酸可然后暴露于第2 (或相同的)酶，其選擇性地在每nth核苷酸的位置切口，以暴露每nth核苷酸，但具有不同起始位置(nth+i，其中i是恒定偏移)?？蓪?duì)第2核酸執(zhí)行如上相同的過程。此過程可根據(jù)需要用至少η切口的核酸(及可能η/2切口的核酸，由于也可鑒定終止的堿基對(duì))重復(fù)，使得各核苷酸測(cè)序。
"分析物"指稱具有2個(gè)或更多單元的序列的分子，其中各單元可相同或不同。分析物單元的尺寸是可通過納米孔的開口轉(zhuǎn)位，使得單元進(jìn)入開口的一側(cè)及移動(dòng)通過及移動(dòng)出另一側(cè)。一般而言，分析物在與納米孔接觸的至少一個(gè)導(dǎo)電液體介質(zhì)中是可溶性的或部分可溶性的。非限制性例包括核酸，肽和蛋白，以及各種烴聚合物(例如，聚乙烯，聚苯乙烯)及官能化的烴聚合物，其中聚合物主鏈包含碳鏈(例如，聚氯乙烯，聚甲基丙烯酸酯)。單元可為單一部分(例如，單核苷酸，Τ)或其可為是重復(fù)子或改變的多部分(例如，TTT三核苷酸或TGC三核苷酸)。在一些實(shí)施方式中，分析物是具有I 1，000，000個(gè)核苷酸長的單元的核酸。分析物也包括聚合物，諸如共聚物，嵌段共聚物及分支的聚合物諸如星狀聚體和樹狀聚體。分析物可包含納米粒子。可在本文實(shí)施方式中采用分析物的混合物。分析物可由阻攔構(gòu)建體修飾，以產(chǎn)生以下描述的"修飾的分析物”。修飾的分析物可改變，如下文所述。"阻攔構(gòu)建體"是用來修飾分析物，使得修飾的分析物不再通過納米孔的開口擬合的實(shí)體。由于阻攔構(gòu)建體的一種或更多性質(zhì)(例如，取向，尺寸或電荷)，阻攔構(gòu)建體導(dǎo)致轉(zhuǎn)位期間修飾的分析物在納米孔的開口中中止。阻攔構(gòu)建體可將插入一個(gè)或更多分析物單元之間("插入物阻攔構(gòu)建體")或可用于修飾單元本身("懸吊物阻攔構(gòu)建體")。由此，阻攔構(gòu)建體可位于待測(cè)序的單元的相鄰處，或其可蓋(即，掩罩)所述單元，如下所述。阻攔構(gòu)建體也可取代單元，其中阻攔構(gòu)建體與單元關(guān)聯(lián)。阻攔構(gòu)建體可為單分子或分子組合(例如，雙鏈DNA)。阻攔構(gòu)建體可為蛋白。阻攔構(gòu)建體可包含納米粒子。如本文所用，"納米粒子"指稱具有一個(gè)或更多IOOnm或更小量級(jí)的尺度的粒子。另外的阻攔構(gòu)建體在以下描述。阻攔構(gòu)建體也能被改變，或改變納米孔的開口，或兩者，使得轉(zhuǎn)位持續(xù)前進(jìn)修飾的分析物一個(gè)單元。改變可由各種手段發(fā)生。在一些實(shí)施方式中，改變通過施加刺激諸如電壓(例如，電壓脈沖或電壓漸變)，輻射(例如，光脈沖)，溫度變化(例如，溫度脈沖)或物理運(yùn)動(dòng)(例如，超聲波，使用磁珠以產(chǎn)生力脈沖)來誘導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，改變使承擔(dān)阻攔構(gòu)建體的部分或全部的解離，諸如雙鏈核酸的一條鏈的解離。改變可使承擔(dān)構(gòu)象變化，諸如形狀或取向的變化。構(gòu)象變化可使承擔(dān)手性反轉(zhuǎn)。作為構(gòu)象變化的一例，阻攔構(gòu)建體可為施加刺激后變化形狀的蛋白。改變可使承擔(dān)取向變化，諸如由阻攔構(gòu)建體的輻射導(dǎo)致的取向變化。阻攔構(gòu)建體可導(dǎo)致納米孔的開口形狀或電荷的變化。相反，由納米孔的開口提供的力可導(dǎo)致阻攔構(gòu)建體的改變，諸如尺寸的變化。阻攔構(gòu)建體也可涉及這些方面的任何組合(例如，阻攔構(gòu)建體可變化形狀，如其也變化開口形狀；由納米孔的開口提供的力可導(dǎo)致阻攔構(gòu)建體的形狀和取向的變化)。插入物阻攔構(gòu)建體位于與單元相鄰處，及由可自彼此解離或另外改變的配對(duì)的部分組成。插入物阻攔構(gòu)建體導(dǎo)致修飾的分析物在開口中中止，由此允許待檢測(cè)的離子電流水平與相鄰單元相關(guān)。在已檢測(cè)離子電流水平之后，插入物阻攔構(gòu)建體的改變導(dǎo)致變化(例如，配對(duì)之一解離)，使得修飾的分析物的殘留物可向反式側(cè)前進(jìn)。下一阻攔構(gòu)建體的改變?cè)试S可檢測(cè)的下一離子電流水平的產(chǎn)生，等等。插入物阻攔構(gòu)建體可由可解離的結(jié)合對(duì)組成。結(jié)合對(duì)具有對(duì)于彼此的親和性。是結(jié)合對(duì)的插入物阻攔構(gòu)建體的非限制性例包括核酸，諸如雙鏈核酸(例如，雙鏈DNA)，可將其插入分析物單元，諸如核苷酸單元之間，以產(chǎn)生修飾的分析物。雙鏈核酸可導(dǎo)致修飾的分析物由于雙鏈體的尺寸而在納米孔的開口中中止，其后解離導(dǎo)致雙鏈體的一條鏈解離，使得修飾的分析物的殘留物可向反式側(cè)前進(jìn)。雙鏈核酸可，在一些實(shí)施方式中，含有I IOObp0插入物阻攔構(gòu)建體可為與I-IOObp雙鏈核酸約相同的長度。可采用的其他已知的結(jié)合對(duì)包括單鏈DNA結(jié)合蛋白，RNA，PNA和RNA，PNA和DNA的組合。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或更多核苷酸形成插入物阻攔構(gòu)建體。例如，可將一個(gè)或更多核苷酸插入分析物單元之間，以提供修飾的分析物，及液體介質(zhì)中包含的與修飾的分析物接觸的游離的核苷酸可與核苷酸原位結(jié)合，然后解離。在一些實(shí)施方式中，作為插入物阻攔構(gòu)建體可采用介電彈性體，光學(xué)機(jī)械材料或溫度-響應(yīng)聚合物。這些類為本領(lǐng)域熟知。見，例如，美國專利No. 7，594，359和7，625，764，各通過引用以其整體并入本文，及J Mech Physics Solids 57:1103 (2009)。除了結(jié)合對(duì)之外，也可采用由光解鍵接合的分子，使得輻射自另一分子光切割一個(gè)分子。該光解鍵為本領(lǐng)域熟知。非限制性例包括補(bǔ)骨脂素和衍生物，DNA-測(cè)序策略中使用的光切割性染料，化合物I-(4，5-二甲氧基-2-硝基-苯基)乙基酯(Photochem Photobio81:953 (2005))，及光敏氨基酸，諸如L-光-亮氨酸。其他插入物阻攔構(gòu)建體包括肽，蛋白，納米粒子和聚電解質(zhì)(例如，硫酸葡聚糖和聚(丙烯酸))。懸吊物阻攔構(gòu)建體涵蓋單元及由可如上述改變的懸吊部分組成。懸吊物阻攔構(gòu)建體一般修飾連續(xù)單元。懸吊物阻攔構(gòu)建體導(dǎo)致修飾的分析物在納米孔的開口中中止。在懸吊物阻攔構(gòu)建體改變之后，之前被懸吊物阻攔構(gòu)建體覆蓋的單元變得暴露。因?yàn)榱硪粦业跷镒钄r構(gòu)建體位于與現(xiàn)在-暴露的單元相鄰處，現(xiàn)在-暴露的單元在開口中止，使得離子電流水平可檢測(cè)。下一懸吊物阻攔構(gòu)建體的改變?cè)试S產(chǎn)生可檢測(cè)的下一離子電流水平，等等。懸吊物阻攔構(gòu)建體的非限制性例包括與上述插入物阻攔構(gòu)建體相同的例和類的構(gòu)建體。例如，懸吊物阻攔構(gòu)建體可，與分析物單元一起，形成結(jié)合對(duì)。懸吊物阻攔構(gòu)建體可，與分析物單元一起，構(gòu)成介電彈性體，光學(xué)機(jī)械材料或溫度-響應(yīng)聚合物。懸吊物阻攔構(gòu)建體可由光解鍵與單元接合。懸吊物阻攔構(gòu)建體可包含肽，蛋白，納米粒子或聚電解質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，核苷酸是懸吊物阻攔構(gòu)建體。例如，在液體介質(zhì)中包含的與分析物接觸的游離的核苷酸可與核苷酸單元原位結(jié)合，然后解離。用阻攔構(gòu)建體修飾的分析物提供"修飾的分析物"。修飾的分析物由于阻攔構(gòu)建體的性質(zhì)(例如，取向，尺寸或電荷)而不隨通過納米孔的開口轉(zhuǎn)位前進(jìn)，除非修飾的分析物改變。而修飾的分析物一般會(huì)包含插入物阻攔構(gòu)建體或懸吊物阻攔構(gòu)建體，修飾的分析物也可包含兩種類型。各插入物阻攔構(gòu)建體可在相同的修飾的分析物之內(nèi)相同或不同。各懸吊物阻攔構(gòu)建體可在相同的修飾的分析物之內(nèi)相同或不同。修飾的分析物可以各種方式獲得，包括獲得分析物及要求商業(yè)實(shí)體制備修飾的分析物。DNA修飾方案起初開發(fā)以希望對(duì)自由地轉(zhuǎn)位的擴(kuò)展進(jìn)許多相同的類型的核苷酸以產(chǎn)生足夠長電流標(biāo)記的DNA測(cè)序。此修飾一般使用DNA限制和連接酶的循環(huán)應(yīng)用來實(shí)現(xiàn)。Meller等人假定了用由2個(gè)12聚體寡聚體組成的轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟ǘM(jìn)制碼的各核苷酸使用該DNA修飾方案的光學(xué)-納米孔測(cè)序策略("New High Throughput Technologies for DNASequencing and Genomics, " ed K. Mitchelson (Elsevier, Oxford, UK), pp 245264;ClinChem 53:1996(2007) ;Nano Lett. 10:2237 (2010))。自動(dòng)化的，大規(guī)模-并行過程(見美國專利No. 6，723，513和WO 2006/092582,各通過引用以其整體并入本文)需要 24h用于將完全 人基因組轉(zhuǎn)變?yōu)橛善危鲗?duì)應(yīng)于原基因組的24bp段組成的DNA混合物(Nat Biotechnol26:1146 (2008))。例如，LingVitae Corp. (Oslo,挪威)可制備具有是選擇的雙鏈核酸的插入物阻攔構(gòu)建體的修飾的核酸。DI測(cè)序需要的DNA轉(zhuǎn)變是欠需求的，因?yàn)楦鞑迦氲腄NA可相同和獨(dú)立于分析物核苷酸。相比之前建議的涉及轉(zhuǎn)變的DNA的測(cè)序方法，DI測(cè)序不需要另外的硬件諸如熒光檢測(cè)或轉(zhuǎn)變?yōu)槎M(jìn)制碼。工作目前在進(jìn)行中以開發(fā)用減少的轉(zhuǎn)變時(shí)間的原基因組的長段的廉價(jià)，低-誤差轉(zhuǎn)變(Nano Lett 10:2237(2010))。相比依賴于連接反應(yīng)的通過連接技術(shù)的測(cè)序，通過大量并行化可達(dá)到轉(zhuǎn)變成本和速度進(jìn)一步減小。接頭可將阻攔構(gòu)建體接合于分析物以提供修飾的分析物。一般而言，接頭是無特定活性的二價(jià)分子，而非將阻攔構(gòu)建體接合于分析物或保存該物種之間的一些最小距離或其他空間關(guān)系。但是，可選擇接頭，以影響連接的物種的一些性質(zhì)，諸如3-維構(gòu)象，凈電荷，或疏水性。適合的接頭為本領(lǐng)域所知，及包括在阻攔構(gòu)建體和分析物之間形成鍵的接頭，所述鍵選自共價(jià)鍵(例如，二硫化物或碳-碳鍵)，氫鍵(例如，Watson-Crick或Hoogstein堿基配對(duì))，離子鍵或其他靜電誘導(dǎo)的鍵。"納米孔"指稱具有其最窄點(diǎn)具有約O.3nm 約2nm的直徑的開口的孔隙。例如，納米孔可為固態(tài)納米孔，石墨烯納米孔，彈性體納米孔，或可為在插入雙層，薄膜，膜(例如，本文公開的膜)，或固態(tài)孔后形成隧道的天然存在的或重組蛋白，也在本文稱之為蛋白孔或蛋白納米孔(例如，跨膜孔隙)。如果蛋白插入膜，則蛋白是隧通-形成蛋白。測(cè)定是否蛋白是隧通-形成蛋白的方法為本領(lǐng)域熟知。例如，可通過測(cè)定是否蛋白插入雙層來測(cè)定是否Msp孔蛋白形成隧道，諸如描述于美國臨時(shí)申請(qǐng)系列No. 61/098, 938和其相關(guān)的PCT申請(qǐng)，W02010/034018，各通過引用以其整體并入本文，及 Proc Natl Acad Scil05:20647(2008)。一般而言，隧通形成通過觀察導(dǎo)電性的離散變化來檢測(cè)。見，例如，Mol Microbiol 33:933(1999)。開口是一般處于與膜或納米孔的順式和反式側(cè)液體或氣體交通。納米孔可包含固態(tài)材料，諸如氮化硅，修飾的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其組合(例如，納米孔可通過制造弟ISiN孔來制備，將石墨稀片材放到其上，然后在石墨稀中制造納米孔)。蛋白納米孔的非限制性例包括α -溶血素和其變體(以下定義的)，恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白(以下定義的)或OmpATb。"改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)"一此短語指稱修飾的分析物的阻攔構(gòu)建體的改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)的作用，使得(a )修飾的分析物的整個(gè)殘留物可通過開口轉(zhuǎn)位，如果無進(jìn)一步阻攔構(gòu)建體中止轉(zhuǎn)位，或(b)另一阻攔構(gòu)建體迎對(duì)開口及導(dǎo)致被改變，由此允許另一修飾的分析物單元產(chǎn)生離子電流水平。由于修飾的分析物與納米孔的開口相互作用，通過開口的電流變化。當(dāng)阻攔的構(gòu)建體暫時(shí)防止修飾的分析物單元免于通過開口轉(zhuǎn)位，離子電流水平產(chǎn)生。即，離子電流水平關(guān)聯(lián)于，或代表，分析物單元。對(duì)于具有雙鏈DNA阻攔構(gòu)建體的DNA分析物，用Ml-NNN-MspA分析的，本文所述的簡單分析揭示了被2pA分離的平均電流水平及延續(xù)大于I. 5ms可鑒定分析物單元DNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能建立其他分析物單元的離子電流水平。離子電流水平一般是平均離子電流。在一些實(shí)施方式中，通過孔隙的離子電流幅度可轉(zhuǎn)化為熒光光學(xué)系統(tǒng)，如本領(lǐng)域熟知。見，例如，J Amer Chem Soc 13:1652 (2009)。當(dāng)一個(gè)阻攔構(gòu)建體中止修飾的分析物以允許離子電流水平測(cè)定單元的同一性，和 另一阻攔構(gòu)建體中止修飾的分析物以產(chǎn)生不同于任何單元-特異性離子電流水平的離子電流水平時(shí)，后來的離子電流水平定義為分隔物水平。分隔物水平可區(qū)別分析物的連續(xù)單元。分隔物水平區(qū)別分析物的連續(xù)及重復(fù)的單元?？稍O(shè)計(jì)分隔物水平以產(chǎn)生不同離子電流水平以提供檢查和。任選地，至少2個(gè)分隔物水平用于提供二進(jìn)制碼以代表分析物單元。任選地，至少一個(gè)分隔物水平用于提供構(gòu)成基本上校驗(yàn)位。轉(zhuǎn)位起始尾是可隨附于修飾的分析物以起始通過納米孔的開口轉(zhuǎn)位的任何線性荷電的聚合物。由此，尾直徑必需相比開口更小。尾可位于修飾的分析物的任一端或兩端。尾的非限制性例包括多核苷酸諸如單鏈DNA。其他尾包括雜多聚體，同多聚體，堿性和/或堿性殘基的核酸(例如，DNA或RNA)。在一些實(shí)施方式中，尾是聚腺嘌呤，諸如聚-dAm，其中m在1-100的范圍[SEQ ID N0:53]。尾可包含聚(丙烯酸)。其他聚(酸)可包括酸基-C00H，-SO3H或-PO3H2。尾也可包括荷電的聚-L賴氨酸或其他荷電的氨基酸。雙鏈體結(jié)合劑用于增強(qiáng)雙鏈核酸的形成。該試劑增加產(chǎn)生成功的雙鏈體的頻度，其，當(dāng)雙鏈體用作阻攔構(gòu)建體時(shí)，可改善測(cè)序靈敏度。非限制例包括二價(jià)陽離子諸如Mg2+，主要和少數(shù)DNA凹槽結(jié)合蛋白和化學(xué)品，鏈間DNA交聯(lián)劑，及DNA嵌入劑。"液體介質(zhì)"包括水性，有機(jī)-水性和僅有機(jī)液體介質(zhì)。有機(jī)介質(zhì)包括，例如，甲醇，乙醇，二甲基亞砜和其混合物。在本文所述的方法中可采用的液體為本領(lǐng)域熟知。該介質(zhì)，包括導(dǎo)電液體介質(zhì)的描述和例提供于美國專利No. 7，189，503，例如，通過引用以其整體并入本文。可將鹽,去污劑或緩沖劑加入該介質(zhì)。可采用該劑來改變液體介質(zhì)的pH或離子強(qiáng)度。粘度-改變物質(zhì)，諸如甘油或其各種聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，聚乙烯基醇，纖維素聚合物)和混合物，可包括在液體介質(zhì)中。測(cè)量粘度的方法為本領(lǐng)域熟知?？杉尤胍后w介質(zhì)的任何劑也可變化待研究的修飾的分析物的速度。如此，速度-改變劑可為鹽，去污劑，緩沖劑，粘度-改變物質(zhì)，或添加到液體介質(zhì)的增加或降低分析物或修飾的分析物的速度的任何其他劑。任何實(shí)施方式中采用的第I和第2液體介質(zhì)可相同或不同，及任意者或兩者可包含一種或更多鹽，去污劑，或緩沖劑。的確，本文所述的任何液體介質(zhì)可包含一種或更多鹽，去污劑，或緩沖劑。任選地，至少一個(gè)液體介質(zhì)是導(dǎo)電的。任選地，至少一個(gè)液體介質(zhì)不是導(dǎo)電的。液體介質(zhì)可包含本文所述的任何分析物。如本文所用，"氨基酸"指稱見于蛋白的20種天然存在的氨基酸的任何，天然存在的氨基酸的D-立體異構(gòu)體(例如，D-蘇氨酸)，非天然的氨基酸，及化學(xué)修飾的氨基酸。氨基酸的各這些類型不是相互排他的。α-氨基酸包含氨基，羧基，氫原子，及稱之為"側(cè)鏈"的特征性的基團(tuán)所鍵合的碳原子。天然存在的氨基酸的側(cè)鏈為本領(lǐng)域熟知及包括，例如，氫(例如，如在甘氨酸)，烷基(例如，如在丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸)，取代的烷基(例如，如在蘇氨酸，絲氨酸，甲硫氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，精氨酸和賴氨酸)，芳基烷基(例如，如在苯丙氨酸和色氨酸)，取代的芳基烷基(例如，如在酪氨酸)，及雜芳基烷基(例如，如在組氨酸)。以下縮寫用于20種天然存在的氨基酸丙氨酸(Ala;A)，天冬酰胺(Asn;N)，天冬 氨酸(Asp;D)，精氨酸(Arg;R)，半胱氨酸(Cys;C)，谷氨酸(Glu;E)，谷氨酰胺(Gln;Q)，甘氨酸(Gly;G)，組氨酸(His;H)，異亮氨酸(116;1)，亮氨酸(1^11丄)，賴氨酸(1^8;10，甲硫氨酸(Met;M),苯丙氨酸(Phe;F)，月甫氨酸(Pro;P)，絲氨酸(Ser; S)，蘇氨酸(Thr;T),色氨酸(Trp; W),酪氨酸(Tyr; Y),及纟顏氨酸(Val; V)。 非天然的氨基酸(S卩，不天然地見于蛋白的那些)也為本領(lǐng)域熟知，如見于，例如，Mol Cell Biol 9:2574 (1989)；J Amer Chem Socll2:4011-4030 (1990)；J Amer Chem Soc56:1280-1283 (1991)；JAmer Chem Soc 113:9276-9286 (1991);及該文引用的全部參考文獻(xiàn)。及Y-氨基酸為本領(lǐng)域所知及也涵蓋在本文為非天然的氨基酸。以下表顯示在本文涵蓋的非天然的氨基酸的非限制性例。表I.例示非天然的氨基酸
氨基酸rrnM氨基酸
Aad2-氨基己二酸EtAsnN-乙基天冬酰胺
Baad 3-氨基己二酸H^l輕基賴氨酸
Bala P-丙氨酸，P-氨基-丙酸Mil別-羥基賴氨酸
Ib^2-氨基丁酸3-羥脯氨酸
4Abu 4-氨基丁酸，哌啶酸4H^4-羥脯氨酸
6-氨基己酸Id^異鎖鏈素
2-氨基庚酸別-異亮氨酸
Hb2-氨基異丁酸N-甲基甘氨酸，肌氨酸
Baib 3-氨基異丁酸MeIleN-甲基異亮氨酸
Apm2-氨基庚二酸MeLys6N-甲基賴氨酸
權(quán)利要求
1.對(duì)2個(gè)或更多用至少第I阻攔構(gòu)建體和第2阻攔構(gòu)建體修飾的分析物単元進(jìn)行測(cè)序的方法，其包括 (a)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和修飾的分析物的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的納米孔，其中納米孔包含提供順式側(cè)和反式側(cè)之間的液體交通的開Π ； (b)使修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生第I離子電流水平，其中第I離子電流水平代表第I単元； (c)改變修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)； Cd)使修飾的分析物的第2阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生代表第2単元的第2離子電流水平；以及(e)將第I離子電流水平和第2離子電流水平與已知的單元的已知的離子電流水平進(jìn)行比較，由此對(duì)2個(gè)或更多分析物単元進(jìn)行測(cè)序。
2.權(quán)利要求I的方法，其中修飾的分析物包含修飾的核酸，修飾的肽或修飾的蛋白。
3.權(quán)利要求2的方法，其中修飾的分析物包含修飾的核酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中修飾的核酸包含修飾的DNA，修飾的RNA，修飾的PNA或其組ムロ ο
5.權(quán)利要求I的方法，其中修飾的分析物包含使分析物與阻攔構(gòu)建體接合的接頭。
6.權(quán)利要求5的方法，其中修飾的分析物還被定義為包含使核酸與阻攔構(gòu)建體接合的接頭的修飾的核酸。
7.權(quán)利要求I的方法，其中修飾的分析物包含具有IMDa或更小分子量的無機(jī)部分。
8.權(quán)利要求I的方法，其中修飾的分析物包含具有IMDa或更小分子量的有機(jī)部分。
9.權(quán)利要求I的方法，其中至少ー個(gè)阻攔構(gòu)建體是插入物阻攔構(gòu)建體。
10.權(quán)利要求9的方法，其中插入物阻攔構(gòu)建體是雙鏈核酸。
11.權(quán)利要求I的方法，其中至少ー個(gè)阻攔構(gòu)建體是懸吊物阻攔構(gòu)建體。
12.權(quán)利要求I的方法，其中各阻攔構(gòu)建體相同。
13.權(quán)利要求I的方法，其中2個(gè)或更多阻攔構(gòu)建體不同。
14.權(quán)利要求I的方法，其中修飾的分析物包含轉(zhuǎn)位起始尾。
15.權(quán)利要求I的方法，其中修飾的分析物是用至少2個(gè)各還被定義為雙鏈DNA的插入物阻攔構(gòu)建體修飾的ssDNA，且其中各單元是單核苷酸或重復(fù)核苷酸。
16.權(quán)利要求I的方法，其中 第I阻攔構(gòu)建體中止修飾的分析物以允許離子電流水平測(cè)定單元的同一性，和任選地與第I阻攔構(gòu)建體連續(xù)的第2阻攔構(gòu)建體中止修飾的分析物以產(chǎn)生不同于任何単元-特異性離子電流水平及定義為分隔物水平的離子電流水平。
17.權(quán)利要求16的方法，其中分隔物水平區(qū)別分析物的連續(xù)單元。
18.權(quán)利要求17的方法，其中分隔物水平區(qū)別分析物的連續(xù)及重復(fù)的單元。
19.權(quán)利要求16的方法，其中周期性地設(shè)計(jì)分隔物水平以產(chǎn)生不同離子電流水平以提供檢查和。
20.權(quán)利要求16的方法，其中至少2個(gè)分隔物水平用于提供ニ進(jìn)制碼以代表分析物單元。
21.權(quán)利要求20的方法，其中至少ー個(gè)分隔物水平提供校驗(yàn)位。
22.權(quán)利要求I的方法，其中當(dāng)對(duì)ー個(gè)或更多修飾的分析物測(cè)序多次時(shí)測(cè)序保真度改善，以產(chǎn)生允許平均及共有讀數(shù)的多個(gè)電流圖案。
23.權(quán)利要求I的方法，其中電場(chǎng)的施加導(dǎo)致修飾的分析物進(jìn)入開ロ。
24.權(quán)利要求I的方法，其中物理壓カ導(dǎo)致修飾的分析物進(jìn)入開ロ。
25.權(quán)利要求I的方法，其中磁珠附接于反式側(cè)上的修飾的分析物，及改變由導(dǎo)致修飾的分析物移動(dòng)通過開ロ的磁力所導(dǎo)致。
26.權(quán)利要求I的方法，其中改變由電壓脈沖，電壓漸變，光脈沖，或機(jī)械カ脈沖所導(dǎo)致。
27.權(quán)利要求I的方法，其中改變還被定義為阻攔構(gòu)建體的解離。
28.權(quán)利要求I的方法，其中改變還被定義為阻攔構(gòu)建體的構(gòu)象變化。
29.權(quán)利要求I的方法，其還包括通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的pH來改變修飾的分析物速度或測(cè)序靈敏度。
30.權(quán)利要求I的方法，其還包括通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的離子強(qiáng)度來改變修飾的分析物速度或測(cè)序靈敏度。
31.權(quán)利要求I的方法，其還包括通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的離子類型來改變修飾的分析物速度或測(cè)序靈敏度。
32.權(quán)利要求I的方法，其還包括通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的溫度來改變修飾的分析物速度或測(cè)序靈敏度。
33.權(quán)利要求I的方法，其還包括通過調(diào)整第I或第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的粘度來改變修飾的分析物速度或測(cè)序靈敏度。
34.權(quán)利要求I的方法，其還包括通過采用雙鏈-結(jié)合劑來改變修飾的分析物速度或測(cè)序靈敏度。
35.權(quán)利要求I的方法，其還包括獲得修飾的分析物。
36.權(quán)利要求I的方法，其中納米孔包含固態(tài)材料。
37.權(quán)利要求36的方法，其中固態(tài)材料還被定義為氮化硅，修飾的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其組合。
38.權(quán)利要求I的方法，其中納米孔是在插入雙層，膜，薄膜，或固態(tài)孔后形成隧道的蛋白。
39.權(quán)利要求I的方法，其中納米孔包含在脂質(zhì)雙層中。
40.權(quán)利要求38的方法，其中納米孔包含在包含分枝菌酸的人工膜中。
41.權(quán)利要求38的方法，其中納米孔是具有定義隧道的前庭和收縮區(qū)域的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白。
42.權(quán)利要求41的方法，其中Msp孔蛋白是突變MspA孔蛋白。
43.權(quán)利要求42的方法，其中突變MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。
44.權(quán)利要求41的方法，其還包括隨著其進(jìn)入開ロ改變修飾的分析物速度或通過移出，添加或取代Msp孔蛋白的至少ー個(gè)氨基酸來改變測(cè)序靈敏度。
45.權(quán)利要求38的方法，其中納米孔是α-溶血素或其變體。
46.權(quán)利要求45的方法，其還包括隨著其進(jìn)入開ロ改變修飾的分析物速度或通過移出，添加或取代α-溶血素或其變體的至少ー個(gè)氨基酸來改變測(cè)序靈敏度。
47.對(duì)核酸的2個(gè)或更多核苷酸進(jìn)行測(cè)序的方法，其包括 (a)提供包含至少2個(gè)各定義為Xn的未知的核苷酸或未知的重復(fù)核苷酸組的核酸，其中n=l 1，000，000，且其中各X和各η可相同或不同； (b)將第I插入物阻攔構(gòu)建體和第2插入物阻攔構(gòu)建體放入核酸，各包含雙鏈核酸和各與Xn相鄰，以提供修飾的核酸； (c)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和修飾的核酸的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的突變MspA孔蛋白； Cd)使第I插入物阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入突變MspA孔蛋白的隧道后中止修飾的核酸，由此產(chǎn)生第I離子電流水平，其中第I離子電流水平代表第IXn ； Ce)改變第I插入物阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的核酸向反式側(cè)前進(jìn)； (f)使修飾的核酸的第2插入物阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止，由此產(chǎn)生代表第2Xn的第2離子電流水平；以及 (g)將第I離子電流水平和第2離子電流水平與已知的Xn的離子電流水平進(jìn)行比較，由此對(duì)核酸的2個(gè)或更多核苷酸進(jìn)行測(cè)序。
48.權(quán)利要求47的方法，其中 第I插入物阻攔構(gòu)建體中止修飾的核酸以允許離子電流水平測(cè)定核苷酸的同一性，和任選地與第I插入物阻攔構(gòu)建體連續(xù)的第2插入物阻攔構(gòu)建體中止修飾的核酸以產(chǎn)生不同于任何核苷酸-特異性離子電流水平及定義為分隔物水平的離子電流水平。
49.權(quán)利要求48的方法，其中分隔物水平區(qū)別核酸的連續(xù)核苷酸。
50.權(quán)利要求49的方法，其中分隔物水平區(qū)別核酸的連續(xù)及重復(fù)的核苷酸。
51.權(quán)利要求48的方法，其中周期性地設(shè)計(jì)分隔物水平以產(chǎn)生不同離子電流水平以提供檢查和。
52.權(quán)利要求48的方法，其中至少2個(gè)分隔物水平用于提供ニ進(jìn)制碼以代表分析物單J Li ο
53.權(quán)利要求48的方法，其中至少ー個(gè)分隔物水平提供校驗(yàn)位。
54.將離子電流水平與已知的分析物單元關(guān)聯(lián)的方法，其包括 Ca)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和用2個(gè)或更多阻攔構(gòu)建體修飾且含有全部已知的目標(biāo)單元的分析物的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的納米孔，其中納米孔包含提供順式側(cè)和反式側(cè)之間的液體交通的開ロ； (b)使修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生離子電流水平，其中離子電流水平代表第I已知的分析物単元； (c)改變修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)； Cd)使修飾的分析物的第2阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生代表第2単元的第2離子電流水平；以及 (e)用含有全部単元及對(duì)應(yīng)目標(biāo)離子電流水平的已知的修飾的分析物校準(zhǔn)納米孔和任選地獲得分隔物水平， 由此將各離子電流水平與已知的分析物單元關(guān)聯(lián)。
55.減緩或促進(jìn)修飾的分析物通過納米孔的開ロ轉(zhuǎn)位的速度的方法，其包括 (a)提供在包含第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和修飾的分析物的順式側(cè)和包含第2導(dǎo)電液體介質(zhì)的反式側(cè)之間定位的納米孔； (b)使修飾的分析物的阻攔構(gòu)建體在進(jìn)入開ロ后中止修飾的分析物，由此產(chǎn)生ー個(gè)或更多離子電流水平，其中各離子電流水平是可區(qū)分的；以及 (C)改變至少修飾的分析物的第I阻攔構(gòu)建體，所述改變?cè)试S修飾的分析物向反式側(cè)前進(jìn)； 其中修飾的分析物具有小于分析物在修飾和改變的缺失下通過隧道轉(zhuǎn)位的平均轉(zhuǎn)位速度的經(jīng)開ロ平均轉(zhuǎn)位速度。
56.系統(tǒng)，其包含具有開ロ的納米孔，其中納米孔定位在第I導(dǎo)電液體介質(zhì)和第2導(dǎo)電液體介質(zhì)之間，其中至少ー個(gè)液體介質(zhì)包含定義為修飾的核酸的修飾的分析物。
57.權(quán)利要求56的系統(tǒng)，其中修飾的核酸還被定義為修飾的DNA，且修飾的DNA的各阻攔構(gòu)建體是含有相同的數(shù)的核苷酸的雙鏈DNA，且各雙鏈DNA相同。
58.權(quán)利要求56的系統(tǒng)，其中系統(tǒng)運(yùn)作以使修飾的核酸的阻攔復(fù)合物在進(jìn)入開ロ后解離。
59.權(quán)利要求56的系統(tǒng)，其中系統(tǒng)運(yùn)作以對(duì)修飾的核酸進(jìn)行測(cè)序。
60.權(quán)利要求56的系統(tǒng)，其中納米孔包含在雙層中。
61.權(quán)利要求56的系統(tǒng)，其中納米孔還被定義為恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白或α -溶血素或其變體。
62.權(quán)利要求56的系統(tǒng)，其還包含膜片鉗放大器，光學(xué)膜片鉗，數(shù)據(jù)獲取裝置，或ー個(gè)或更多與第I液體介質(zhì)，第2液體介質(zhì)，或其任何組合交通的溫度調(diào)控裝置。
63.權(quán)利要求56的系統(tǒng)，其中功能性地重復(fù)系統(tǒng)組分以倍增測(cè)序通量。
64.權(quán)利要求56的系統(tǒng),其中系統(tǒng)與微流體學(xué)或自動(dòng)化適應(yīng)。
全文摘要
本文提供屬于使用納米孔測(cè)序分析物單元的方法和系統(tǒng)。一般而言，阻攔構(gòu)建體用于修飾分析物使得修飾的分析物在納米孔的開口中中止。該中止期間，獲得對(duì)應(yīng)于分析物單元的離子電流水平。在改變修飾的分析物使得修飾的分析物通過開口前進(jìn)之后，另一阻攔構(gòu)建體再次中止分析物，允許獲得代表第2分析物單元的第2離子電流水平。此過程可重復(fù)直到對(duì)各分析物單元測(cè)序。也公開實(shí)施該方法的系統(tǒng)。
文檔編號(hào)B82Y15/00GK102834527SQ201180018449
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者J·H·古德拉徹, I·M·德靈頓, M·D·科林斯 申請(qǐng)人:華盛頓大學(xué)