一種磁性納米顆粒生物探針及其制備方法和應(yīng)用
【專利說明】一種磁性納米顆粒生物探針及其制備方法和應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)與納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測HBV preSl抗 原的磁性納米顆粒生物探針、磁性免疫層析試紙條及其制備方法和使用方法。 【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎（HBV)是我國的高發(fā)病，我國人群中感染率達(dá)60%，且呈逐年上升趨勢， HBV表面抗原攜帶者有1. 3億以上，10%以上轉(zhuǎn)為慢性肝炎，部分演變?yōu)楦斡不?，進(jìn)而引 發(fā)肝癌。因此，對(duì)乙肝病毒在體內(nèi)是否有復(fù)制的準(zhǔn)確判斷及抗病毒治療后的準(zhǔn)確監(jiān)測就顯 得特別重要。臨床上應(yīng)用乙肝五項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)及其模式的動(dòng)態(tài)變化，監(jiān)測、監(jiān)控HBV感染者 的病情，判斷感染者的傳染性和評(píng)價(jià)抗病毒藥物的治療效果。20世紀(jì)80年代末期，隨著 PCR技術(shù)的出現(xiàn)及成熟，HBV-DNA定量已經(jīng)成為乙型肝炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是PCR技術(shù)由于 其實(shí)驗(yàn)要求的高標(biāo)準(zhǔn)及高成本，使其推廣利用大大受限。
[0003] 國內(nèi)外近年來的研宄表明，HBV前SI (preSl)抗原是病毒存在和復(fù)制的又一新標(biāo) 志，Pre-SlAg出現(xiàn)在急性HBV感染的最早期，并與HBV核心抗原（HBeAg)及HBV DNA顯著相 關(guān)。前Sl抗原與HBV-DNA檢出率兩者符合，前Sl抗原僅在HBV-DNA陽性血清中檢出。前 Sl蛋白隨HBeAg消失而消失，且與陰轉(zhuǎn)時(shí)間呈正相關(guān)，這樣，前Sl抗原可作為病毒清除與 病毒轉(zhuǎn)陰的指標(biāo)。前Sl抗原陽性的乙型肝炎患者傳播乙型肝炎病毒比前Sl抗原陰性和無 癥狀HbsAg攜帶者的危險(xiǎn)性更大，因而說明前Sl抗原可反映乙型肝炎病毒復(fù)制和傳染性的 指標(biāo)。如果前Sl抗原持續(xù)陽性，指示AHB向慢性轉(zhuǎn)變。比較急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、 和HBsAg陽性的患者血清中前Sl蛋白，前Sl抗原陰轉(zhuǎn)愈早，AHB患者的療程愈短，預(yù)后也 愈好。說明前Sl抗原及其抗體的檢測是急性乙型肝炎的臨床診斷，療效觀察和判數(shù)據(jù)預(yù)后 的良好指標(biāo)。
[0004] 一直以來，在中國檢測HBV采用的是傳統(tǒng)的ELISA檢測，由于ELISA檢測成本低， 收費(fèi)低，病人負(fù)擔(dān)相對(duì)較小。所以對(duì)于采用化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光檢測來說很難全面的推 廣到各地區(qū)的醫(yī)院，雖然化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光檢測相對(duì)于傳統(tǒng)的ELISA方法檢測HBV具 有明顯檢測靈敏度和檢測線性的優(yōu)勢，對(duì)于相同類的競爭化學(xué)發(fā)光和時(shí)間分辨熒光來說， 也具有設(shè)備更穩(wěn)定，結(jié)果更穩(wěn)定的優(yōu)勢，但是操作步驟和檢測時(shí)間與傳統(tǒng)ELISA方法相比 并沒有簡化太多，檢測成本昂貴，對(duì)臨床檢驗(yàn)醫(yī)師的技術(shù)要求也比較高，限制了其在臨床的 推廣使用。
[0005] 磁性納米探針法免疫層析檢測技術(shù)是借鑒目前已經(jīng)成熟的免疫膠體金層析技術(shù) 的基本原理，以磁性納米材料代替膠體金顆粒利用抗體、抗原在試紙條上的夾心反應(yīng)，實(shí)現(xiàn) 磁性納米探針標(biāo)記乙肝前Sl抗原的檢測技術(shù)，既克服了目前免疫膠體金層析技術(shù)定量困 難、檢測靈敏度低的不足，又具有快速、靈敏、高特異性，并可以實(shí)現(xiàn)定量檢測，是一種適合 于現(xiàn)場檢測的快速檢測技術(shù)，具有很好的發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景。
[0006] 磁性納米材料是以具有超順磁性的鐵氧化物(多為四氧化三鐵）為內(nèi)核，以氧化硅 為殼層，當(dāng)該鐵氧化物顆粒體積減小到某一數(shù)值時(shí)，熱擾動(dòng)能將與總的磁晶各向異性能相 當(dāng)，這樣，顆粒內(nèi)的磁矩方向就可能隨著時(shí)間的推移，整體保持平行地在一個(gè)易磁化方向和 另一個(gè)易磁化方向之間反復(fù)變化。從單疇顆粒集合體看，就具有超順磁性。在單疇顆粒集 合體出現(xiàn)超順磁性的溫度范圍內(nèi)，分別在不同的溫度下測量其磁化曲線，這些磁化曲線必 定是重合在一起的，且不會(huì)出現(xiàn)磁滯，即集合體的剩磁和矯頑力都為零。這種超順磁性也是 磁性納米材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的基本保障。
[0007] 由于磁性納米探針法檢測HBV preSl抗原可以做到病毒定量檢測，因此臨床醫(yī)生 可以根據(jù)HBV病毒的量的變化分析病人的病情發(fā)展，從而更好的知道臨床醫(yī)生的合理用 藥，節(jié)省病人對(duì)乙肝治療的費(fèi)用，尤其是對(duì)慢性乙肝更具有長期的監(jiān)測作用。當(dāng)然因其高的 靈敏度，使得磁性納米探針法檢測HBV preSl抗原，可以提高乙肝的檢測率，使檢測的窗口 期提前，防止出現(xiàn)ELISA法的假陰性而漏檢，所以磁性納米探針法檢測HBV preSl抗原還可 以廣泛用于體檢的檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中"兩對(duì)半"試劑不能很好的反映乙肝病毒的存在狀況，不能定 量檢測HBV，而HBV-DNA定量PCR檢測實(shí)驗(yàn)成本高、耗時(shí)長的缺陷，本發(fā)明提供一種用于檢 測HBV preSl抗原的磁性納米顆粒生物探針、磁性免疫層析試紙條及其制備方法和使用方 法，其磁性納米顆粒生物探針具有特異性強(qiáng)，信號(hào)靈敏且穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，其的磁性免疫層 析試紙條可以實(shí)現(xiàn)對(duì)人外周血清中HBV preSl抗原的快速定性和定量檢測。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種磁性納米顆粒生物探針的制備方法，具體包括以下步驟： 步驟1)對(duì)粒徑為100-200nm的磁性納米顆粒進(jìn)行表面氨基化處理，得到表面氨基化的 磁性納米顆粒；再對(duì)所述表面氨基化的磁性納米顆粒進(jìn)行羧基化處理，得表面羧基化的磁 性納米顆粒；步驟2)在緩沖液中將所述表面羧基化的磁性納米顆粒、碳化二亞胺（EDC，又 稱碳二亞胺）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)混合反應(yīng)，反應(yīng)后洗滌，得反應(yīng)物A ; 步驟3)在偶聯(lián)緩沖液中將所述反應(yīng)物A和HBV preSl的抗體混合反應(yīng)，得反應(yīng)物B ; 步驟4)將所述反應(yīng)物B與含氨基的化合物的溶液混合反應(yīng)，反應(yīng)后洗滌，即制得磁性 納米顆粒生物探針。
[0010] 進(jìn)一步的，步驟1)中，所述磁性納米顆粒可為納米材料領(lǐng)域中常規(guī)的磁性納米 顆粒；所述磁性納米顆粒具有超順磁性；所述磁性納米顆粒的比飽和磁化強(qiáng)度較佳地在 25-45emu/g ;所述磁性納米顆粒較佳地為具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性粒子/氧化娃復(fù)合材料，即： 所述的磁性納米顆粒的內(nèi)核為磁性粒子，所述的磁性納米顆粒的殼層為氧化硅；所述磁性 粒子較佳地為鐵氧化物，如四氧化三鐵。所述磁性粒子/氧化硅復(fù)合材料的殼層的厚度較 佳地為5-50nm。
[0011] 其中，所述磁性粒子可按現(xiàn)有文獻(xiàn)制備，例如：Magnetite Nanocrystal Clusters with Ultra-High Sensitivity in Magnetic Resonance Imagin (Fangjie Xu，Changming Cheng，Du-Xing Chen，Hongchen Gu，Chemphyschem，2012，13,336_341)D 所述磁性粒 子/氧化娃復(fù)合材料可按現(xiàn)有文獻(xiàn)制備，例如：Synthesis of Magnetic Microspheres with Immobilized Metal Ions for Enrichment and Direct Determination of Phosphopeptides by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (Xiuqing Xu，Chunhui Deng，Mingxia Gao,Wenjia Yu，Pengyuan Yang，and Xiangmin Zhang，Advanced Materials，2006,18,3289-3293.)。
[0012] 進(jìn)一步的，所述磁性納米顆粒優(yōu)選采用以下方法制得： (1)用溶劑熱法制備磁性粒子： 將無機(jī)鐵鹽、穩(wěn)定劑和乙二醇混合，于180-220°C下反應(yīng)8-24小時(shí)，洗滌，即得磁性粒 子；所述的穩(wěn)定劑為檸檬酸鈉或聚丙烯酸（PAA); 其中，所述的洗滌較佳地是在磁分離的輔助下用乙醇和/或去離子水洗滌多次；其中， 所述的溶劑熱法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備磁性粒子的方法；按本領(lǐng)域常識(shí)，所述的反應(yīng)在弱堿 性條件下進(jìn)行，當(dāng)所述的穩(wěn)定劑為聚丙烯酸時(shí)，在所述的混合時(shí)較佳地還添加尿素以控制 反應(yīng)體系的pH值； (2 )氧化娃包被磁性粒子： 將上述制得的磁性粒子和〇. 8-1. 2mol/L的強(qiáng)酸溶液混合，超聲10-40分鐘，在磁分離 的輔助下用去離子水洗滌5-7次，得活化后的磁性粒子；將所述活化后的磁性粒子和醇水 混合液混合，在攪拌狀態(tài)下加入堿和正硅酸烷基酯，所加入的堿使得混合后體系的pH值在 8. 0-10. 5,反應(yīng)8-24小時(shí)，在磁分離的輔助下用醇洗滌3-5次，即制得所述磁性納米顆粒； 其中，所述正硅酸烷基酯的用量為20-500 μ L/100mg所述磁性粒子；所述醇水混合液 中的醇水比例為60:40-90:10 ;所述的強(qiáng)酸為本領(lǐng)域常規(guī)使用的酸，一般為鹽酸；其中，所 述的堿為本領(lǐng)域常規(guī)使用的堿，較佳地為NH3 · H20 ;所述的醇水混合液中的醇可為本領(lǐng)域 常規(guī)使用的任意醇；所述的醇可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的醇，較佳地為乙醇。按本領(lǐng)域常識(shí)，所 述的正硅酸烷基酯可以分多批添加，