使用具有磁性性質(zhì)的顆粒的新診斷測定的制作方法
【專利摘要】一種包括非磁性多孔顆粒的顆粒，所述多孔顆粒包括至少一種聚合物并且具有外表面和由所述孔隙界定的內(nèi)表面。非磁性多孔顆粒具有位于其內(nèi)表面和外表面上的官能團。通過如下方式使也具有結(jié)合至其表面的官能團的磁性顆粒共價鍵合至非磁性多孔顆粒，使這兩種顆粒的官能團反應(yīng)并在它們之間形成共價鍵。磁性顆粒的最小平均直徑大于多孔顆粒的孔隙的平均直徑。按此方式，磁性顆粒不會阻礙非磁性多孔顆粒的孔隙。本申請還涉及利用磁性顆粒分析分子和細胞的新型系統(tǒng)和測定。位于非磁性顆粒上的磁性顆粒形成特征圖案、指紋或條形碼。
【專利說明】
使用具有磁性性質(zhì)的顆粒的新診斷測定
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本說明書一般地設(shè)及用于分析分子和細胞的新型系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括團簇，其中非 磁性顆粒補充有磁性顆粒從而形成特征圖案或條形碼(bar code)。還公開了此類顆粒和用 于它們的生產(chǎn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 用于分析體液中的生物分子和細胞的技術(shù)在諸如但不限于醫(yī)學、生物制藥和生物 技術(shù)的許多技術(shù)領(lǐng)域中是至關(guān)重要的。諸如酶聯(lián)免疫吸附測定化LISA)的傳統(tǒng)免疫學技術(shù) 仍然是主要的。然而，隨著世界范圍內(nèi)執(zhí)行的分析數(shù)量持續(xù)增加，對更快速且更高效的分析 方法的需求變得至關(guān)重要。依賴多重分析的系統(tǒng)代表著更高效的分析系統(tǒng)的一種解決方 案。數(shù)種使用多重檢測的商業(yè)技術(shù)是現(xiàn)在可得的。然而，現(xiàn)有多重分析系統(tǒng)有許多缺陷。在 運些缺陷當中，應(yīng)該提及的是儀器W及結(jié)果的評價的高成本。
[0003] 用在納米技術(shù)、診斷、研究和開發(fā)中的組件還需要微型化。在許多領(lǐng)域內(nèi)，需要將 信息存儲在顆粒上或者需要將各種分子附接在顆粒上。
[0004] 存在將信息存儲在較大顆粒上并對大顆粒進行衍生化的已知技術(shù)。在對較小顆粒 諸如具有低于100皿的直徑的顆粒的部分衍生化方面，出現(xiàn)了技術(shù)問題。一個問題是對顆粒 移動的控制。因而，本領(lǐng)域需要用于制造部分衍生化的較小顆粒的方法。
[0005] -個實例是在導(dǎo)電溶劑中對顆粒的彎曲表面進行部分衍生化的方法，該方法公開 在W02009074692中。所述方法包括W下步驟:a)通過施力使顆粒與至少一個表面緊密接觸， b)通過在所述至少一個表面與導(dǎo)電溶劑之間施加電位來在顆粒的至少一部分上誘導(dǎo)化學 反應(yīng)，W及C)使已在上面步驟b)的誘導(dǎo)下發(fā)生化學反應(yīng)的顆粒的所述至少一部分進一步反 應(yīng)。W02009074692還公開了部分衍生化的顆粒W及所述顆粒的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文陳述的一般概念和實施方案的目的在于減少現(xiàn)有技術(shù)的至少某些缺陷并提 供改進的分析用材料，所述材料包括其中多孔顆粒補充有位于多孔顆粒表面上的磁性顆粒 的顆粒，其中磁性顆粒不僅貢獻出磁性元件和它們的磁力，而且還創(chuàng)建了特征圖案或條形 碼，磁性顆粒也可W用來固定配體，使得多孔顆粒的大部分內(nèi)部空間不受磁性顆粒影響，并 且與已知磁性顆粒和顆粒聚集物相比較，維持或者甚至增大顆粒的容量。
[0007] 第一方面設(shè)及生產(chǎn)顆粒的方法，所述方法包括W下步驟：
[000引 a.提供
[0009] -非磁性多孔顆粒，所述多孔顆粒具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的連接的內(nèi) 表面，所述多孔顆粒包括至少一種聚合物，所述多孔顆粒包括位于所述外表面和內(nèi)表面上 的至少一種類型的官能團，W及
[0010] -磁性顆粒，所述磁性顆粒包括位于其表面上的至少一種類型的官能團，其中磁性 顆粒的至少95重量％的最小直徑大于多孔顆粒的孔隙的平均直徑；W及
[0011] b.使位于非磁性多孔顆粒的表面上的官能團與位于磁性顆粒的表面上的官能團 反應(yīng)從而形成共價鍵，
[0012] 從而獲得補充有磁性顆粒的顆粒，磁性顆粒共價結(jié)合至顆粒的外面部分。
[0013] 通過選擇具有不同尺寸、顏色和磁性性質(zhì)的磁性顆粒，賦予顆粒類似于特征圖案、 指紋或條形碼的唯一識別符。
[0014] 在第一方面的實施方案中，多孔顆粒包括選自由瓊脂糖、二氧化娃、纖維素、聚乙 締醇、聚乙二醇、聚苯乙締 W及它們的衍生物組成的組中的材料。
[0015] 在第一方面的另一個實施方案中，磁性顆粒具有比非磁性多孔顆粒的密度更高的 密度。
[0016] 在一個實施方案中，所有磁性顆粒的至少95重量％的最小直徑大于多孔顆粒的所 有孔隙的至少95 %的最大直徑。
[0017] 所有磁性顆粒的至少95重量％的最小直徑描述了所有磁性顆粒的至少95重量％ 的所有可能直徑的最小值。使用重量百分比而不是數(shù)目來減少非常小顆粒的相對重量。
[0018] 多孔顆粒的孔隙的平均直徑用表觀孔隙尺寸來衡量并且定義為表觀孔隙尺寸，如 在化gel,?s化er'g,Andersson,Jou;rnalof化;romatogra地yA，743卷，第l期，1996年8月30 日，第33-42頁中進一步詳細描述的。還存在針對一些市售聚合物的數(shù)據(jù)。例如，6%瓊脂糖 的平均或表觀孔隙直徑為24nm。
[0019] 當所有磁性顆粒的幾乎全部，優(yōu)選至少95重量％的最小直徑大于多孔顆粒的孔隙 的平均直徑時，磁性顆?？蒞在一定程度上進入多孔顆粒中，但沒有達到磁性顆粒妨礙多 孔顆粒的結(jié)合容量或妨礙識別條形碼的可能性的程度。通過允許磁性顆粒在一定程度上進 入多孔顆粒中，顆粒的總結(jié)合容量可能實際上有所增大，因為磁性顆粒在其表面上具有官 能團，運些官能團可直接用來增大結(jié)合容量或創(chuàng)建條形碼或者通過為結(jié)合其他分子進行的 進一步反應(yīng)來增大結(jié)合容量或創(chuàng)建條形碼。通過允許磁性顆粒中的一小部分進入顆粒中， 磁性材料的負載量增大，運使得顆粒對于分離更有用，因為如果它們在它們內(nèi)部具有更多 磁性材料，則分離它們更容易。
[0020] 對于許多應(yīng)用，特別是對于分離，期望顆粒具有高磁矩。顆粒的結(jié)合容量也應(yīng)當 高。運個問題用運樣的方式來解決，即，磁性顆?？蒞用官能團衍生化W便它們對顆粒的總 結(jié)合容量作出貢獻。顆粒的結(jié)合容量及磁矩都通過允許一些磁性顆粒進入多孔顆粒中W及 通過用對顆粒的總結(jié)合容量作貢獻并且有助于優(yōu)化條形碼的創(chuàng)建的官能團對磁性顆粒進 行衍生化來最大化
[0021 ]在一個實施方案中，磁性顆粒為20nm或更大。在一個實施方案中，磁性顆粒為4或 更小。在可替代的實施方案中，磁性顆粒為lOOnm或更小。在一個實施方案中，在制造工藝期 間利用穩(wěn)定的磁性顆粒膠體。使用各個磁性顆粒的直徑，如果磁性顆粒形成團簇，則整個團 簇的最大直徑可能要大得多
[0022] 設(shè)想到即使制造工藝是令人滿意的，在實際制造過程中也可能存在少數(shù)比預(yù)期尺 寸小或大的顆粒。
[0023] 在可替代的實施方案中，磁性顆粒的最小直徑等于或小于多孔顆粒的孔隙的平均 直徑。在運個實施方案中，磁性顆粒中的至少一部分將進入多孔顆粒的孔隙中。通過相對于 孔隙尺寸選擇磁性元件的尺寸，磁負荷可W根據(jù)需要加 W調(diào)整。
[0024] 磁性顆粒的最小直徑大于多孔顆粒的孔隙的平均直徑(表觀直徑）。磁性顆粒的最 小直徑意指基本上所有，或優(yōu)選至少95重量％的磁性顆粒的最小直徑，其中最小直徑是在 其中顆粒尺寸最小的維度上測量的。在此種可替代的實施方案中，基本上所有的磁性顆粒 都太大而不能進入多孔顆粒的平均孔隙中。設(shè)想到孔隙尺寸可W變化并且將具有一定的大 小分布，并且在此種實施方案中一些孔隙可供磁性顆粒進入。
[0025] 在又一個可替代的實施方案中，磁性顆粒的最小直徑大于多孔顆粒的所有孔隙的 直徑。在此種實施方案中，沒有孔隙可供磁性顆粒進入。
[00%]對于一些診斷應(yīng)用，期望磁性顆粒僅存在于多孔顆粒的外表面上。
[0027] 在第一方面的另一個實施方案中，位于多孔顆粒的外表面和內(nèi)表面上的官能團選 自由-細、-S-S-化晚、-C00H、-NH2、-C冊、-OH、苯酪、酢、環(huán)氧基、S-Au，W及酷胺、氨乙基、二 乙基氨乙基、季錠基乙基、簇基甲基、憐酷丙基和橫基丙基組成的組。
[0028] 在第一方面的另一個實施方案中，位于多孔顆粒的外表面和內(nèi)表面上的官能團包 括至少一種由于與至少一種選自由W下化合物組成的組中的化合物反應(yīng)而產(chǎn)生的基團：二 乙締諷、苯釀、咪挫、高艦酸鹽、Ξ氯-S-S嗦、甲苯橫酸鹽、重氮化合物、異脈鹽、碳化二亞 胺、阱、表氯醇、戊二醒、漠化氯、雙環(huán)氧乙燒、幾基二咪挫、N-徑基班巧酷亞胺、硅烷W及它 們的衍生物。
[0029] 在第一方面的另一個實施方案中，位于磁性顆粒上的官能團包括選自由-SH、-S- S-[i比晚、-C00H、-NH2、-C冊、-OH、苯酪、酢、環(huán)氧基、S-Au，W及酷胺、氨乙基、二乙基氨乙基、 季錠基乙基、簇基甲基、憐酷丙基和橫基丙基組成的組中的至少一者。
[0030] 在第一方面的另一個實施方案中，位于磁性顆粒的表面上的官能團包括至少一種 由于與至少一種選自由W下化合物組成的組中的化合物反應(yīng)而產(chǎn)生的基團：二乙締諷、苯 釀、咪挫、高艦酸鹽、Ξ氯-S-S嗦、甲苯橫酸鹽、重氮化合物、異脈鹽、碳化二亞胺、阱、表氯 醇、戊二醒、漠化氯、雙環(huán)氧乙燒、幾基二咪挫、N-徑基班巧酷亞胺、硅烷W及它們的衍生物。
[0031] 在第一方面的另一個實施方案中，在多孔顆粒、磁性顆?；蚨呱弦脒m合于分 子相互作用的分子。
[0032] 在第一方面的進一步實施方案中，適合于分子相互作用的分子是選自由有機分 子、蛋白質(zhì)、抗原、酶、酶抑制劑、輔因子、荷爾蒙、毒素、維他命、糖綴合物、核酸、凝集素及碳 水化合物組成的組中的至少一者。
[0033] 在可與上述實施方案自由組合的第一方面的另一個實施方案中，在選自由多孔顆 粒和磁性顆粒組成的組中的至少一者上引入適合于檢測的分子。
[0034] 在可與上述實施方案自由組合的第一方面的另一個實施方案中，適合于檢測的分 子是選自由有機分子、核酸、氨基酸、膚、蛋白質(zhì)和凝集素組成的組中的至少一者。
[0035] 在可與上述實施方案自由組合的第一方面的另一個實施方案中，磁性顆粒包括包 埋在聚合物基體中的至少一種磁性材料的顆粒，并且其中所述聚合物基體包括所述官能 團。
[0036] 第二方面設(shè)及包括非磁性多孔顆粒的顆粒，該多孔顆粒具有外表面、孔隙和由所 述孔隙界定的內(nèi)表面，所述多孔顆粒包括至少一種聚合物，所述顆粒具有至少一種共價結(jié) 合至外面部分的磁性顆粒，其中磁性顆粒的至少95重量％的最小直徑大于多孔顆粒的孔隙 的平均直徑。
[0037] 根據(jù)第二方面的實施方案，多孔顆粒包括至少一種選自由瓊脂糖、二氧化娃、纖維 素、聚乙締醇、聚乙二醇、聚苯乙締 W及它們的衍生物組成的組中的材料。
[0038] 根據(jù)第二方面的進一步實施方案，磁性顆粒具有比非磁性多孔顆粒的密度更高的 密度。
[0039] 根據(jù)可與上述實施方案自由組合的第二方面的進一步實施方案，選自由多孔顆粒 和至少一種磁性顆粒組成的組中的至少一者包括適合于分子相互作用的分子。
[0040] 根據(jù)可與上述實施方案自由組合的第二方面的進一步實施方案，選自由多孔顆粒 和至少一種磁性顆粒組成的組中的至少一者包括適合于檢測的分子。
[0041] 根據(jù)可與上述實施方案自由組合的第二方面的進一步實施方案，適合于檢測的分 子是選自由有機分子、核酸、抗原、酶、酶抑制劑、輔因子、荷爾蒙、毒素、糖綴合物、凝集素 W 及碳水化合物組成的組中的至少一者。
[0042] 根據(jù)可與上述實施方案自由組合的第二方面的進一步實施方案，磁性顆粒包括包 埋在聚合物基體中的至少一種材料的顆粒，并且其中所述聚合物基體包括所述官能團。
[0043] -種使用顆粒執(zhí)行測定的方法，其包括W下步驟：
[0044] -使所述顆粒與包含至少一種待分析的被分析物的樣本接觸，其中所述顆粒對所 述被分析物具有親和性，
[0045] -使所述顆粒與其上固定有對固定到顆粒上的被分析物具有生物親和性的分子的 表面接觸
[0046] -使所述顆粒暴露于i)磁場、ii)重力和iii)離屯、的至少一者中，接著沖洗來自非 特異性結(jié)合的顆粒的表面
[0047] -讀出來自固定到表面上的顆粒的可檢測信號。
[0048] 所述方法，其中所述測定是設(shè)及使用顆粒的亞組的多重測定，其中每個亞組中的 多孔顆粒攜帶具有不同尺寸的磁性顆粒。
[0049] 所述方法，其中所述測定是設(shè)及使用顆粒的亞組的多重測定，其中每個亞組中的 多孔顆粒攜帶具有不同顏色和或尺寸的磁性顆粒。
[0050] 運種方法的優(yōu)勢是在顆粒制備期間所有步驟都容易執(zhí)行，甚至在水溶液中并且在 中等溫度下，例如在大約20-60°C下。
[0051] 另一個優(yōu)勢是在反應(yīng)期間形成的牽設(shè)位于表面上和多孔顆粒內(nèi)部的基團的共價 鍵是穩(wěn)定的，甚至對于單一點附接的分子亦是如此。
[0052] 再一個優(yōu)勢是所述方法可W非常少的步驟執(zhí)行。所述方法與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法 相比較容易執(zhí)行并且利用簡單廉價的設(shè)備。
[0053] 根據(jù)本文所描述的方面和實施方案的顆粒具有數(shù)個優(yōu)勢。不僅可W設(shè)計由于特征 圖案、指紋或條形碼而容易識別的顆粒，而且該顆粒與已知磁性顆粒相比較還具有增大的 結(jié)合容量。補充有磁性顆粒的顆粒的形成維持和/或甚至提高了結(jié)合容量，配體也可W固定 在磁性顆粒上，使得多孔顆粒的內(nèi)容積的主要部分不受影響并且可供與待分離組分發(fā)生吸 附和結(jié)合反應(yīng)之用。因為多孔顆粒的大部分比表面積在內(nèi)部，所W如果磁性顆粒不是太小 并且沒有阻塞多孔顆粒的孔隙，那么反應(yīng)和/或吸附容量將得W維持。
【附圖說明】
[0054] 將參考W下各圖描述各個方面和實施方案，其中：
[0055] 圖1示意性地示出包括多孔非磁性顆粒(Pp)和分布在其整個表面上的多個磁性顆 粒(Mp)的顆粒(P)的橫斷面。
[0056] 圖2示意性地示出包括非磁性多孔顆粒(Pp)與磁性顆粒(Mp)的相似顆粒(P)的橫 斷面，該磁性顆粒(Mp)根據(jù)它們的尺寸與多孔顆粒中的孔隙直徑的關(guān)系或多或少地穿透到 所述顆粒中。
[0057] 圖3示出作為多孔顆粒的瓊脂糖珠的光學顯微鏡圖像，該瓊脂糖珠具有結(jié)合至其 表面的較小磁性顆粒，該瓊脂糖珠是由環(huán)氧化物活化的瓊脂糖與具有2μπι尺寸的 Microme愧Μ畑2顆粒(來自德國羅其if托克Micromod Partikeltechnologie Gm地的磁性聚 苯乙締顆粒)反應(yīng)而產(chǎn)生的。
[005引圖4示出磁性瓊脂糖顆粒的光學顯微鏡圖像，該磁性瓊脂糖顆粒是由環(huán)氧化物活 化的瓊脂糖與10皿Microine怖Μ畑2顆粒反應(yīng)而產(chǎn)生的。
[0059] 圖5示出包括兩種不同尺寸的磁性顆粒的磁性瓊脂糖顆粒的光學顯微鏡圖像，該 磁性瓊脂糖顆粒是由環(huán)氧化物活化的瓊脂糖與10皿Micromer?Μ Ν也顆粒反應(yīng)，并接著與5 皿Microme悚Μ畑2反應(yīng)而產(chǎn)生的。
[0060] 圖6示出包括Ξ種不同尺寸的磁性顆粒的磁性瓊脂糖顆粒的光學顯微鏡圖像，該 磁性瓊脂糖顆粒是由環(huán)氧化物活化的瓊脂糖與lOymMlcromer獲Μ Ν出顆粒反應(yīng)，接著與如m Micro姐er液Μ畑2反應(yīng)，并再進一步與2ym]Vii知畑閱濟Μ畑2顆粒反應(yīng)而產(chǎn)生的。
[0061] 圖7示出顆粒(Ρ)如何捕獲在情形A中存在于患者樣本中或在情形Β中不存在于患 者樣本中的被分析物的實例。如果該被分析物存在于樣本中，那么帶有具有特征顏色和尺 寸的磁性顆粒(Mp)的顆粒(P)將不會黏附至表面。如果被分析物不存在，那么顆粒(P)將黏 附至表面。運僅是實例，將產(chǎn)生其他結(jié)果的其他組合也是可能的。-
【具體實施方式】
[0062] 在詳細描述各個方面和實施方案之前，應(yīng)理解本說明書不局限于本文公開的具體 化合物、構(gòu)造、方法步驟、基質(zhì)和材料，因為此類化合物、構(gòu)造、方法步驟、基質(zhì)和材料可W有 些變化。還應(yīng)理解，本文采用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，而無意于限制，因為 本發(fā)明實施方案的范圍僅由所附權(quán)利要求書及其等價物限定。
[0063] 必須注意，如在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"一個"、"一種"和 "所述"包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另外明確規(guī)定。
[0064] 而且，術(shù)語"大約"用于指示在適當?shù)臅r候，偏離數(shù)值±10%，并且最優(yōu)選±5%。
[0065] 如貫穿說明書和權(quán)利要求書使用的，球體的直徑是穿過球體的中屯、并且其端點落 在球體外緣上的任何直線。
[0066] 如果沒有其他定義，包括本文使用的任何術(shù)語在內(nèi)的科學術(shù)語意在具有本公開所 屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。
[0067] 發(fā)明人已進行廣泛的研究并且發(fā)現(xiàn)權(quán)利要求中限定的顆粒容易W高產(chǎn)率形成并 且容易分離。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使生物分子與所述團簇結(jié)合W及從所述團簇中分離出生物分子 的能力比根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的相應(yīng)顆粒的任何出版數(shù)據(jù)都更高。
[0068] 根據(jù)實施方案的顆粒具有磁性并且在檢測生物分子的工藝中易于使用。與固定化 分子和/或細胞在一起的顆粒容易使用外部磁體來分離。它們也容易識別，運是由于具有不 同尺寸和性質(zhì)的磁性顆粒的組合賦予它們特征圖案、指紋或條形碼。進一步地，因為磁性顆 粒給顆粒帶來附加密度，所W所述分離可W通過離屯、或者利用重力通過靜態(tài)沉降來輔助。 基于密度的分離可W用作預(yù)分離步驟和/或作為磁性分離的一部分。
[0069] 第一方面提供了生產(chǎn)顆粒的方法，所述方法包括W下步驟：
[0070] a.提供
[0071] -非磁性多孔顆粒，所述多孔顆粒具有外表面、孔隙和由所述孔隙界定的連接的內(nèi) 表面，所述多孔顆粒包括至少一種聚合物，所述多孔顆粒包括位于所述外表面和內(nèi)表面上 的官能團，W及
[0072] -磁性顆粒，所述磁性顆粒包括位于其表面上的官能團，其中磁性顆粒的至少95重 量％的最小直徑大于多孔顆粒的孔隙的平均直徑；W及
[0073] b.使位于非磁性多孔顆粒的表面上的官能團與位于磁性顆粒的表面上的官能團 反應(yīng)從而形成共價鍵，
[0074] 從而獲得補充有磁性顆粒的顆粒，所述磁性顆粒共價結(jié)合至所述顆粒的外面部 分，
[0075] 優(yōu)選地，位于磁性顆粒的表面上的至少一種類型的官能團全部尚未與位于多孔顆 粒的外表面和內(nèi)表面上的至少一種類型的官能團反應(yīng)形成共價鍵，使得至少一種類型的官 能團的一部分在選自磁性顆粒和多孔顆粒的至少一者上仍然可利用
[0076] 所得顆?？蒞被認為是表面修飾的多孔顆粒，其中磁性顆粒結(jié)合至顆粒的表面和 外面部分。
[0077] 根據(jù)一個實施方案，多孔顆粒基本上是球形的，然而也包括其他形狀，并且多孔顆 粒不局限于任何特定形狀。所有形狀都包括在本文提供的實施方案的范圍內(nèi)。上述情況適 用于磁性顆粒。
[0078] 當所有磁性顆粒的幾乎全部，優(yōu)選至少95重量％的最小直徑大于多孔顆粒的孔隙 的平均直徑時，磁性顆粒可W在一定程度上進入多孔顆粒中，但沒有達到大到磁性顆粒妨 礙多孔顆粒的容量或使得閱讀條形碼困難的程度。通過允許磁性顆粒在一定程度上進入多 孔顆粒中，顆粒的總結(jié)合容量可能實際上有所增大，因為磁性顆粒在其表面上具有可利用 的官能團，其可直接用來增大結(jié)合容量或通過為結(jié)合其他分子進行的進一步反應(yīng)來增大結(jié) 合容量。通過允許磁性顆粒中的一部分進入，磁性材料在顆粒中的負載量增大，運使得顆粒 對于分離更有用，因為如果它們在它們內(nèi)部具有更多磁性材料，則分離它們更容易。
[0079] 對于許多應(yīng)用，特別是對于分離，期望顆粒具有高磁矩。顆粒P的結(jié)合容量也應(yīng)當 高。對此如下進行解決，磁性顆?？蒞用官能團衍生化W便它們對顆粒的總結(jié)合容量作出 貢獻。顆粒的結(jié)合容量及磁矩都通過允許一些磁性顆粒進入多孔顆粒中W及通過用對顆粒 的總結(jié)合容量作貢獻的官能團對磁性顆粒進行衍生化來最大化。
[0080] 在一個實施方案中，磁性顆粒為20nm或更大。在一個實施方案中，磁性顆粒為4μπι 或更小。在可替代的實施方案中，磁性顆粒為lOOnm或更小。在一個實施方案中，在制造工藝 期間利用穩(wěn)定的磁性顆粒膠體。使用各個磁性顆粒的直徑，但是如果磁性顆粒形成團簇，貝U 整個團簇的最大直徑可能要大得多。
[0081] 設(shè)想到即使制造工藝是令人滿意的，在實際制造過程中也可能存在少數(shù)比預(yù)期尺 寸小或大的顆粒。
[0082] 在可替代的實施方案中，磁性顆粒的最小直徑等于或小于多孔顆粒的孔隙的平均 直徑。在運個實施方案中，磁性顆粒中的至少一部分將進入多孔顆粒的孔隙中。通過相對于 孔隙尺寸選擇磁性元件的尺寸，磁負荷可W根據(jù)需要加 W調(diào)整。
[0083] 磁性顆粒的最小直徑大于多孔顆粒的孔隙的平均直徑(表觀直徑）。磁性顆粒的最 小直徑意指基本上所有，優(yōu)選至少95重量％的磁性顆粒的最小直徑，其中最小直徑是在其 中顆粒尺寸最小的維度上測量的。在此種可替代的實施方案中，基本上所有的磁性顆粒都 太大而不能進入多孔顆粒的平均孔隙中。設(shè)想到孔隙尺寸可W變化并且將具有一定的大小 分布，并且在此種實施方案中一些孔隙可供磁性顆粒進入。
[0084] 在又一個可替代的實施方案中，磁性顆粒的最小直徑大于多孔顆粒的所有孔隙的 直徑。在此種實施方案中，沒有孔隙可供磁性顆粒進入。
[0085] 對于一些診斷應(yīng)用，期望磁性顆粒僅存在于多孔顆粒的外表面上。
[0086] 根據(jù)一個實施方案，多孔顆?；旧鲜乔蛐蔚?，然而也包括其他形狀，并且多孔顆 粒不局限于任何特定形狀。所有形狀都包括在本文提供的實施方案的范圍內(nèi)。上述情況適 用于磁性顆粒。
[0087] 對于球形或基本上球形的顆粒，直徑容易根據(jù)常規(guī)定義測定。對于完美的球形顆 粒，最小直徑和最大直徑是相同的。然而，對于不規(guī)則形狀的顆粒，即，非球形顆粒，可在許 多不同的方向上從表面上的一點穿過質(zhì)量中屯、到表面上的另一個點來測量直徑。對于不規(guī) 則顆粒而言，一個運樣的直徑將是最小的，并且一個運樣的直徑將是最大的。倘若球體是均 勻的，那么球體的質(zhì)量中屯、是球體的中屯、。對于球體，直徑應(yīng)當穿過球體的中屯、。
[0088] 根據(jù)第一方面的一個實施方案，多孔顆粒包括選自由瓊脂糖、二氧化娃、纖維素、 聚乙締醇、聚乙二醇、聚苯乙締 W及它們的衍生物組成的組中的至少一者。顆粒材料的具體 但非限制性實例在工作實施例中給出。
[0089] 根據(jù)第一方面的一個實施方案，磁性顆粒包括至少一種選自磁性金屬、磁性金屬 合金和磁性氧化物或它們的組合的磁性材料。非限制性實例包括鐵、儀、鉆、禮、欽和衫W及 它們的氧化物和合金。
[0090] 在第一方面的一個實施方案中，磁性顆粒具有比非磁性多孔顆粒的密度更高的密 度。因而，磁性顆?？捎脕碓黾诱麄€顆粒的密度。在任何工藝中，如果應(yīng)當使用重力或離屯、 分離顆粒，則運可能是有用的。
[0091] 合適的磁性顆粒可W粗略地劃分為Ξ組：
[0092] -固體磁性微顆粒。運些顆粒經(jīng)常具有低磁力和低容量。它們目前不太適合用于本 文公開的工藝和系統(tǒng)中。實例包括Oynabeads? (Dynal/Invitrogen Co.)和Micro'取er@M (來自德國羅斯托克Micromod ^dAeltechnologie GmbH的磁性聚苯乙締顆粒）。
[0093] -多孔磁性顆粒。運些顆粒具有良好的磁性性質(zhì)和高容量。它們適合用于本文所公 開的工藝和系統(tǒng)中。實例包括來自GE胎althcare Life Sciences,Biovision,Inc的Mag Sepharose顆粒，來自Cube Biotech的化reCubeMagBeads飯，W及按照本說明書中概述并 在要求2013年9月9日提交的SE 1351038-3的優(yōu)先權(quán)的共同待審的國際申請中詳細描述的 方式生產(chǎn)的顆粒。
[0094] -固體磁性顆粒，例如鉆顆粒(來自瑞±蘇黎世的化rbobeads LLC的TiirboBea化麼 產(chǎn)品系列）w及類似物，其具有高磁力。
[00M]在一個實施方案中，位于多孔顆粒的表面上的官能團是選自由-SH、-S-S-化晚、- COOH、-N此、-CH0、-OH、苯酪、酢、環(huán)氧基、S-Au、酷胺、氨乙基、二乙基氨乙基、季錠基乙基、簇 基甲基、憐酷丙基和橫基丙基組成的組中的至少一者。
[0096] 在一個實施方案中，選自位于多孔顆粒的外表面和內(nèi)表面上的至少一種類型的官 能團及位于磁性顆粒的表面上的至少一種類型的官能團中的至少一者包括絡(luò)合結(jié)合基團 (complex binding group)。在一個實施方案中，絡(luò)合結(jié)合基團是選自由IDA(亞氨基二乙 酸)及其衍生物、T抓(Ξ(簇甲基）乙二胺)及其衍生物、CM-Asp(簇基甲基化天冬氨酸)及其 衍生物、NTA(次氮基Ξ乙酸)及其衍生物、TREN(S(2-氨基乙基)胺)及其衍生物、DPA(二甲 基化晚胺)及其衍生物、C6-S凝膠記基硫基)及其衍生物、EDTA(乙二胺四乙酸)及其衍生物 組成的組中的至少一者。運些絡(luò)合結(jié)合結(jié)構(gòu)可W例如與金屬離子結(jié)合，金屬離子進而可與 包括組氨酸的膚鏈相互作用。如果要純化包括組氨酸鏈或標簽的抗體，則適合使用此類基 團。
[0097] 在一個實施方案中，選自位于多孔顆粒的外表面和內(nèi)表面上的至少一種類型的官 能團及位于磁性顆粒(Mp)的表面上的至少一種類型的官能團中的至少一者包括疏水基團。 在一個實施方案中，疏水基團是選自由CnHm(l《n《20 4《m《42)、苯酪及其衍生物、硫代 苯酪及其衍生物W及琉基化晚及其衍生物組成的組中的至少一者。如果要在與疏水層析類 似的應(yīng)用中使用所述顆粒，則此類疏水基團是合適的。化血(120 4《m《42)是包括但 不局限于燒控化肥n+2的許多不同有機化合物的通式。
[0098] 在一個實施方案中，位于多孔顆粒(Pp)的表面上的官能團是至少一種由于與至少 一種選自由W下化合物組成的組中的化合物反應(yīng)而產(chǎn)生的基團：二乙締諷、苯釀、咪挫、高 艦酸鹽、Ξ氯-S-Ξ嗦、甲苯橫酸鹽、重氮化合物、異脈鹽、碳化二亞胺、阱、表氯醇、戊二醒、 漠化氯、幾基咪挫、N-徑基班巧酷亞胺、硅烷W及它們的衍生物。
[0099] 在一個實施方案中，位于磁性顆粒上的官能團是選自由-SH、-S-S-化晚、-C00H、- N出、-CH0、-OH、苯酪、酢、環(huán)氧基、S-Au、酷胺、氨乙基、二乙基氨乙基、季錠基乙基、簇基甲 基、憐酷丙基和橫基丙基組成的組中的至少一者。
[0100] 在一個實施方案中，位于磁性顆粒的表面上的官能團是至少一種由于與至少一種 選自由W下化合物組成的組中的化合物反應(yīng)而產(chǎn)生的基團：二乙締諷、苯釀、咪挫、高艦酸 鹽、Ξ氯-S-Ξ嗦、甲苯橫酷氯、重氮化合物、異脈鹽、碳化二亞胺和硅烷。
[0101] 對磁性顆粒上和非磁性多孔顆粒上的化學基團進行調(diào)整，使得磁性顆粒上的化學 基團與非磁性多孔顆粒上的化學基團之間可W發(fā)生反應(yīng)。因而，可W使適合于與另一種官 能團反應(yīng)的一種官能團附接至非磁性多孔顆粒，并且可使合適的相應(yīng)官能團附接至磁性顆 粒。一種官能團可W附接至非磁性多孔顆?；蛘吒浇又链判灶w粒，只要另一種顆粒上存在 可與它反應(yīng)的合適官能團即可。在一個實施方案中，使不同的數(shù)種化學基團附接至非磁性 多孔顆粒，并且使不同類型的具有相應(yīng)不同類型的合適官能團的磁性顆粒附接至多孔顆粒 上的不同官能團。
[0102] 在第一方面的一個實施方案中，在選自由多孔顆粒和磁性顆粒組成的組中的至少 一者上引入適合于分子相互作用的分子。在第一方面的一個實施方案中，適合于分子相互 作用的分子是選自由有機分子、蛋白質(zhì)、抗原、酶、酶抑制劑、輔因子、荷爾蒙、毒素、維他命、 糖綴合物、核酸、凝集素 w及碳水化合物組成的組中的至少一者。
[0103] 在第一方面的一個實施方案中，在選自由多孔顆粒和磁性顆粒組成的組中的至少 一者上引入適合于檢測的分子。在第一方面的一個實施方案中，適合于檢測的分子是選自 由有機分子、蛋白質(zhì)、核酸和凝集素組成的組中的至少一者。
[0104] 在第一方面的一個實施方案中，磁性顆粒包括包埋在聚合物基體中的至少一種磁 性材料的顆粒，并且其中所述聚合物基體包括所述官能團。
[0105] 在第二方面，提供了一種顆粒，所述顆粒包括非磁性多孔顆粒，其中所述多孔顆粒 包括孔隙，其中所述多孔顆粒包括至少一種聚合物，其中所述多孔顆粒具有至少一種共價 結(jié)合至其表面的磁性顆粒，其中磁性顆粒的最小直徑大于多孔顆粒的孔隙的平均直徑。
[0106] 在第二方面的一個實施方案中，多孔顆粒包括選自由瓊脂糖、二氧化娃、纖維素、 聚乙締醇、聚乙二醇、聚苯乙締 W及它們的衍生物組成的組中的至少一者。
[0107] 磁性顆粒包括至少一種磁性材料，例如但不限于，磁性金屬、磁性金屬合金及磁性 氧化物或它們的組合。
[0108] 在一個實施方案中，磁性顆粒具有比非磁性多孔顆粒的密度更高的密度。根據(jù)ISO 1183-1:2012測量密度。
[0109] 在一個實施方案中，多孔顆粒和至少一種磁性顆粒中的至少一者包括適合于分子 相互作用的分子。適合于相互作用的分子是具有通過包括但不限于與另一種分子形成鍵的 方式與另一種分子發(fā)生相互作用的能力的分子。
[0110] 在一個實施方案中，多孔顆粒和/或至少一種磁性顆粒中的至少一者包括適合于 檢測的分子。
[0111] 在一個實施方案中，適合于檢測的分子是選自由有機分子、核酸、抗原、酶、酶抑制 劑、輔因子、荷爾蒙、毒素、糖綴合物、凝集素 W及碳水化合物組成的組中的至少一者。適合 于檢測的分子是可通過任何方式檢測的分子。實例包括發(fā)出具有至少一種特定波長的光的 分子。
[0112] 在一個實施方案中，磁性顆粒包括包埋在聚合物基體中的至少一種材料的顆粒， 并且其中所述聚合物基體包括所述官能團。磁性顆粒中的材料的實例包括但不限于，磁性 金屬、磁性金屬合金及磁性氧化物，諸如鐵、鉆及它們的氧化物。
[0113] 本文還提供了執(zhí)行包括使用如第二方面中描述的顆粒的測定的方法，所述方法包 括W下步驟:a)使顆粒與至少一種待分析的被分析物接觸，b)使顆粒暴露于選自由i)磁場、 ii)重力和iii)離屯、組成的組中的至少一者中，C)讀出來自顆粒的可檢測信號。
[0114] 根據(jù)一個實施方案，所述測定用于在體外診斷的目的。本文所公開的顆粒還使得 構(gòu)建多重反應(yīng)和/或分析系統(tǒng)成為可能。
[0115] 多重測定使用如本文所公開的多孔顆粒和磁性顆粒構(gòu)建。供應(yīng)的磁性顆粒具有許 多不同尺寸，通過使具有第一直徑的磁性顆粒與多孔顆粒的一個亞組偶聯(lián)，并且使具有不 同于所述第一直徑的第二直徑的磁性顆粒與第二亞組偶聯(lián)，來獲得兩批具有不同的性質(zhì)的 顆粒。
[0116] 將瓊脂糖顆粒分為兩批。根據(jù)本文所公開的方法使具有10WI1的平均直徑的磁性顆 粒共價結(jié)合至第一批中的瓊脂糖顆粒，產(chǎn)生第一組顆粒，其稱為顆粒A。特異性地結(jié)合至第 一被分析物A的抗體附接至運個組中的顆粒上。使第二批瓊脂糖顆粒與具有2WI1的平均直徑 的磁性顆粒反應(yīng)，產(chǎn)生第二組具有共價結(jié)合的磁性顆粒的顆粒，其稱為B。特異性地結(jié)合至 第二被分析物B的第二抗體附接至運個第二組中稱為B的顆粒上。
[0117] 在抗體與被分析物結(jié)合所需的條件下使運兩組顆粒與樣本接觸。結(jié)合至瓊脂糖顆 粒的磁性顆粒的不同尺寸可用于區(qū)別運兩組顆粒W及結(jié)合至其上的被分析物。運兩組顆粒 也可W用代表不同顏色或不同顏色組合的不同標記進行標記，該標記例如但不限于巧光標 記。
[0118] 如果被分析物A存在于樣本中，則運種被分析物將結(jié)合至第一組顆粒。如果被分析 物B不存在，則它將不會結(jié)合至顆粒A或B。
[0119] 在下一步驟中，沖洗顆粒W消除過量的被分析物A或B。在接下來的步驟中，使顆粒 與被分析物A和B共價固定在其上的表面接觸。因為被分析物A結(jié)合至上面存在針對被分析 物A的抗體的來自組A的顆粒，所W運些顆粒將不會黏附至所述表面。表面上不存在來自組A 的顆粒指示被分析物A存在于樣本中。
[0120] 另一方面因為樣本中不存在被分析物B，所W顆粒B將黏附至所述表面，然后，然后 抗B抗體將與表面上的被分析物B反應(yīng)
[0121] 可替代的實例是使用運樣的顆粒A和顆粒B，其中顆粒A具有由例如藍色表示的特 定條形碼并且具有位于顆粒表面上的抗-A抗體，而顆粒B具有由例如黃色表示的特定條形 碼并且具有位于表面上的抗-B抗體。
[0122] 使運兩組顆粒A和B與含有被分析物A但不含被分析物B的樣本接觸。在沖洗該珠之 后，使顆粒與含有帶有生物素的抗A抗體和帶有生物素的抗B抗體的溶液接觸，該沖洗容易 執(zhí)行，因為顆粒具有磁性。在第二次沖洗之后，使該珠與具有巧光例如綠顏色的抗生物素蛋 白接觸。進行第Ξ次沖洗，然后檢查顆粒。如果在藍色顆粒A上檢測出具有綠顏色的顆粒，貝U 判斷被分析物A存在于樣本中。
[0123] 顆粒不具有綠色巧光W及特征條形碼，運指示那些被分析物不存在于樣本中
[0124] 顆粒A和B彼此之間可W容易地根據(jù)它們的磁性顆粒的不同尺寸或不同顏色或巧 光來區(qū)分。
[0125] 上述情況同樣適用于Ξ個或更多個組，條件是磁性顆粒具有不同尺寸或條形碼。 可W使用具有2ym、5wii和10WI1的平均直徑的顆粒。磁性顆粒也可W具有不同的顏色或顏色 組合W及其他可區(qū)分的性質(zhì)。
[0126] 應(yīng)注意，除非另外定義，否則本文所公開的各方面和實施方案可W自由組合。
[0127] 實施例
[01巧]實施例1.環(huán)氧化物活化的瓊脂糖顆粒的制備
[01巧]在玻璃過濾器上用蒸饋水洗涂瓊脂糖凝膠4B(GE Healthcare Life Sciences)， 并將其吸干。將3g干凝膠顆粒懸浮在2.4ml IM氨氧化鋼溶液中，并于室溫在攬拌下逐滴加 入0.45ml表氯醇。將溫度升高至60°C并維持2小時。在玻璃過濾器上用蒸饋水將環(huán)氧化物活 化的瓊脂糖凝膠洗涂至中性，最終按50%凝膠濃度將其再懸浮在蒸饋水中。該產(chǎn)品構(gòu)成如 本文所定義的多孔顆粒的一個實例，參見例如，圖1和圖2中的顆粒巧。
[0。0] 實施例2.用包括一種尺寸的磁性顆粒的磁性顆粒修飾的瓊脂糖顆粒的生產(chǎn)。
[0131]在運些調(diào)查中使用尺寸為2皿至ΙΟμπι的具有氨基(N此）官能度的市售磁性微顆粒 作為磁性顆粒。運些顆粒是如本文所定義的磁性顆粒的實例，參見，例如，圖1和圖2中的磁 性顆粒Mp。
[0132] 按如下方式使磁性顆粒Mi知詔臘禮M-NH2 (2皿和10皿)分別共價附接至多孔環(huán)氧 化物活化的瓊脂糖顆粒。將來自Micromod Partikelteknologie GmbH的Mi.cr〇mer@-M-NH2 (250化，7X108個顆粒/ml)用1000化PBSα5mM憐酸鹽，150mM化Cl，pH7.4)洗涂兩次，并 再懸浮在1000化PBS中。將環(huán)氧化物活化的瓊脂糖顆粒，即1ml沉降的凝膠，再懸浮在10ml 0.01M化OH溶液中，添加到磁性顆粒懸浮液中，并且于室溫在滿旋振蕩下反應(yīng)，對于2皿顆 粒反應(yīng)12小時，而對于ΙΟμηι顆粒反應(yīng)30分鐘。
[0133] 在燒結(jié)過濾漏斗中用50ml lOmM的抑7.4的憐酸鋼緩沖液0除去過量的具有氨基 官能度的磁性顆粒，從而產(chǎn)生具有如分別在圖3和圖4中示出的經(jīng)2WI1或10WI1磁性顆粒修飾 的瓊脂糖顆粒的溶液。運些顆粒是如本文所定義的顆粒的實例，并且在圖1和圖2中示意性 地表示為顆粒P。
[0134] 實施例3.用包括兩種尺寸的磁性顆粒的磁性顆粒修飾的瓊脂糖顆粒的生產(chǎn)
[0135] 按如下方式使磁性顆粒Micromer嚴Μ-ΝΗ2(5μηι和ΙΟμηι)共價附接至多孔環(huán)氧化物 活化的瓊脂糖顆粒：
[0136] 首先，將來自Micromod F*a;rt;Lkelteknologie Gm地的 10皿Micromer瑕-Μ_ΝΗ2(250 化，7X108個顆粒/ml)用1000化PBS(15mM憐酸鹽，150mM化Cl，pH7.4)洗涂兩次，并再懸 浮在1000化PBS中。將環(huán)氧化物活化的瓊脂糖顆粒，即1ml沉降的凝膠，再懸浮在10ml 0.01M NaO田容液中，添加到10皿磁性顆粒懸浮液中，并于室溫在滿旋振蕩下反應(yīng)30分鐘。
[0137] 其次，將來自Micromod F*a;rt;Lkelteknologie GmbH的扣mMicronier教-Μ_ΝΗ2(250μ L，7X108個顆粒/ml)用1000化PBSα5mM憐酸鹽，150mM化Cl，pH7.4)洗涂兩次，并再懸浮 在1000化PBS中。然后將扣m磁性顆粒添加到瓊脂糖ΙΟμπι磁性顆粒懸浮液中，并于室溫在滿 旋振蕩下反應(yīng)30分鐘。
[013引在燒結(jié)過濾漏斗中用50ml lOmM的抑7.4的憐酸鋼緩沖液除去過量的磁性顆粒， 從而產(chǎn)生具有如圖5中所示的經(jīng)如m和10M1磁性顆粒修飾的瓊脂糖顆粒的溶液。
[0。9] 實施例4.用包括Ξ種尺寸的磁性顆粒的磁性顆粒修飾的瓊脂糖顆粒的生產(chǎn) [0140] 按如下方式使磁性顆粒M.沁romer數(shù)M-NH2 (2皿、5皿和10皿)共價附接至多孔環(huán)氧 化物活化的瓊脂糖顆粒：
[0141 ]首先，將來自Micromod 化；rUkelteknologie GmbH的 10皿Micromer夠-M-NH2(250 化，7X108個顆粒/ml)用1000化PBS(15mM憐酸鹽，150mM化Cl，pH7.4)洗涂兩次，并再懸 浮在1000化PBS中。將環(huán)氧化物活化的瓊脂糖顆粒，即1ml沉降的凝膠，再懸浮在10ml 0.01M NaO田容液中，添加到10皿磁性顆粒懸浮液中，并于室溫在滿旋振蕩下反應(yīng)30分鐘。
[0142] 其次，將來自Micromod 化；rUkelteknologie GmbH的如m-Micromer忠:.-Μ-ΝΗ2(250μ L，7X108個顆粒/ml)用1000化PBSα5mM憐酸鹽，150mM化Cl，pH7.4)洗涂兩次，并再懸浮 在1000化PBS中。然后將扣m磁性顆粒添加到瓊脂糖ΙΟμπι磁性顆粒懸浮液中，并于室溫在滿 旋振蕩下反應(yīng)30分鐘。
[0143] 第Ξ，將來自Micromod I^dikelteknologie Gm地的2ymMiciOmer影-Μ-ΝΗ2(250μ L，7X108個顆粒/ml)用1000化PBSα5mM憐酸鹽，150mM化Cl，pH7.4)洗涂兩次，并再懸浮 在1000化PBS中。然后將2μπι磁性顆粒添加到瓊脂糖10μπι/5μπι磁性顆粒懸浮液中，并于室溫 在滿旋振蕩下反應(yīng)30分鐘。
[0144] 在燒結(jié)過濾漏斗中用50ml lOmM的抑7.4的憐酸鋼緩沖液除去過量的磁性顆粒， 從而產(chǎn)生具有如圖6中所示的經(jīng)2μηι、5]im和1 Ojim磁性顆粒修飾的瓊脂糖顆粒的溶液。
[0145] 實施例5.琉基化蛋白A在磁性瓊脂糖顆粒上的固定化
[0146] 吸取大約60μ1沉降的磁性瓊脂糖顆粒(2皿巧Ijl .5ml Eppendorf管中。用永久性磁 體將磁性瓊脂糖顆粒吸移至化pendorf管壁上，除去溶液并且將顆粒再懸浮在1ml琉基化蛋 白A溶液（Img/ml，在15mM pH 8的憐酸鹽緩沖液中）中。于室溫和緩慢混合下反應(yīng)1小時后， 通過用永久性磁體將顆粒從溶液中分離出來W收集上清液。上清液中蛋白A的含量利用Uv/ Vis光譜法通過測量280nm處的吸光度(A280nm)來評價，見表1。
[0147] 表1.通過測量上清液在280nm處的吸光度來評價在磁性瓊脂糖顆粒上的蛋白A的 配體濃度。
[014 引
[0149] 通過將上清液(0.6mg/ml)中的蛋白A含量從所添加的蛋白A溶液（Img/ml)中的蛋 白A含量中扣除來確定60μ1顆粒上的蛋白A含量。確定蛋白A標記的量為大約6.5mg/ml沉降 的磁性顆粒。
[01加]實施例6.使用攜帶不同尺寸的磁性顆粒的多孔顆粒的多重分析
[0151] 通過使用包括經(jīng)不同尺寸的磁性顆粒修飾的多孔顆粒的磁性顆粒對樣本混合物 中的人血清白蛋白化SA)和免疫球蛋白G(IgG)的存在W及溶菌酶的缺失進行檢測。如實施 例2中所描述的那樣利用不同的磁性顆粒尺寸生產(chǎn)磁性顆粒，從而產(chǎn)生如圖3和圖4中所示 的磁性顆粒。使經(jīng)2μπι磁性顆粒修飾的顆粒的內(nèi)容積與抗-HAS抗體共價偶聯(lián)，產(chǎn)生抗-HSA-2 皿-磁性顆粒。
[0152] W類似方式生產(chǎn)抗-IgG-5皿-磁性顆粒和抗-溶菌酶-10皿-磁性顆粒。2皿-磁性顆 粒、5μπι-磁性顆粒和ΙΟμπι-磁性顆粒在光學顯微鏡下容易區(qū)分，因為獨特的磁性修飾物包括 具有不同尺寸的顆粒。
[0153] 將顆粒添加到含有都用異硫氯酸巧光素（FITC)標記的IgG和HAS的蛋白混合物 (1ml)中，并于室溫在緩慢混合下溫育。15分鐘后，通過利用磁性分離用5 X 1ml PBS洗涂磁 性顆粒，W將未結(jié)合材料從磁性顆粒懸浮液中除去。將磁性顆粒再懸浮在25化1 PBS中并且 在巧光顯微鏡下進行觀察。在2μπι-磁性顆粒上W及在如m-磁性顆粒上觀察到來自FITC的巧 光，而10皿-磁性顆粒沒有顯示出任何巧光，運指示樣本混合物中存在HAS和IgG，而不存在 溶菌酶。
[0154] 所描述的包括不同磁性顆粒尺寸的磁性瓊脂糖顆粒的使用消除了使用Ξ種不同 巧光團進行檢測的需要，因為在上述實驗中僅使用了一種巧光團。
[0155] 通過使用在光學顯微鏡下容易區(qū)分的Ξ種不同尺寸的磁性顆粒，瓊脂糖顆?？蒞 按W下六(6)種組合進行"修飾"。運些已經(jīng)被生產(chǎn)出來并隨后已在多重分析測定中用作條 形碼：
[0156] 1號條形碼，包括2皿磁性顆粒的瓊脂糖顆粒，圖3。
[0157] 2號條形碼，包括如m磁性顆粒的瓊脂糖顆粒。
[0158] 3號條形碼，包括10皿磁性顆粒的瓊脂糖顆粒，圖4。
[0159] 4號條形碼，包括2μπι和ΙΟμπι磁性顆粒的瓊脂糖顆粒。
[0160] 5號條形碼，包括2μηι、5μηι和lOjim磁性顆粒的瓊脂糖顆粒，圖6。
[0161 ] 6號條形碼，包括如m和lOjim磁性顆粒的瓊脂糖顆粒，圖5。
[0162] 因而，可使用本文描述的方法獲得簡單而又可靠且容易區(qū)分的條碼或指紋。
[0163] 盡管為了理解清晰起見用說明和舉例的方式相當詳細地描述了前述發(fā)明，但是本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)將容易明了，可在不背離所附權(quán)利要求書的精神或范 圍的情況下對本發(fā)明作出某些改變和修改。
【主權(quán)項】
1. 一種包括非磁性多孔顆粒的顆粒，所述非磁性多孔顆粒具有外表面、孔隙和由所述 孔隙界定的內(nèi)表面，所述多孔顆粒包括至少一種聚合物，所述顆粒具有共價結(jié)合至其外面 部分的至少一種磁性顆粒，其中所有磁性顆粒的至少95重量％的最小直徑大于所述多孔顆 粒的所述孔隙的至少95%的最大直徑，并且其中所述至少一種磁性顆粒構(gòu)成能夠區(qū)分一組 顆粒與另一組顆粒的特征。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的顆粒，其中所述多孔顆粒包括至少一種選自由瓊脂糖、二氧化 硅、纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯以及它們的多種衍生物組成的組中的材料。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項所述的顆粒，其中選自由所述多孔顆粒和所述至少一種 磁性顆粒組成的組中的至少一者包括適合于分子相互作用的分子。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的顆粒，其中適合于檢測的所述分子是選自由有機分子、氨基 酸、肽、蛋白質(zhì)、核酸、抗原、酶、酶抑制劑、輔因子、荷爾蒙、毒素、糖綴合物、凝集素以及碳水 化合物組成的組中的至少一者。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的顆粒，其中所述磁性顆粒包括包埋在聚合物基體 中的至少一種磁性材料的顆粒，并且其中所述聚合物基體包括官能團。6. -種使用根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的顆粒執(zhí)行測定的方法，所述方法包括以 下步驟： -使所述顆粒與包括至少一種待分析的被分析物的樣本接觸，其中所述顆粒對所述被 分析物具有親和性， -使所述顆粒與一個表面接觸，所述表面上固定有對固定到顆粒上的所述被分析物具 有生物未和性的分子 -使所述顆粒暴露于i)磁場、ii)重力和iii)離心的至少一者中，接著沖洗來自非特異 性結(jié)合的顆粒的表面 -讀出來自固定到表面上的顆粒的可檢測信號。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述測定是用于診斷目的的體外測定。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述測定是涉及使用顆粒的亞組的多重測定，其中 每個亞組中的所述多孔顆粒攜帶不同尺寸的磁性顆粒。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法，其中所述測定是涉及使用顆粒的亞組的多 重測定，其中每個亞組中的多孔顆粒攜帶具有不同的顏色、不同顏色組合和或尺寸的磁性 顆粒。10. -種制造顆粒的方法，所述方法包括以下步驟： a. 提供 -顆粒，所述顆粒包括至少一種聚合物及位于外表面和內(nèi)表面上的官能團，以及 -磁性顆粒(Mp)，所述磁性顆粒包括位于其表面上的官能團，所有磁性顆粒的至少95重 量％的最小直徑大于所述多孔顆粒的所述孔隙的至少95%的最大直徑。；以及 b. 使位于非磁性多孔顆粒的表面上的官能團與位于所述磁性顆粒的表面上的官能團 反應(yīng)從而形成共價鍵， 從而獲得補充有磁性顆粒(Mp)的顆粒(P)，所述磁性顆粒共價結(jié)合至所述顆粒的外表 面部分。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述多孔顆粒包括選自由瓊脂糖、二氧化硅、纖 維素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚苯乙烯以及它們的衍生物組成的組中的材料。12. 根據(jù)權(quán)利要求10-11中任一項所述的方法，其中所述磁性顆粒具有比所述非磁性多 孔顆粒的密度更高的密度。13. 根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，其中位于所述多孔顆粒的所述外表面和 內(nèi)表面上的官能團選自由-SH、-S-S-吡啶、-COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酚、酐、環(huán)氧基、S-Au、 酰胺、氨乙基、二乙基氨乙基、季銨基乙基、羧基甲基、磷酰丙基和磺基丙基組成的組。14. 根據(jù)權(quán)利要求10-13中任一項所述的方法，其中位于所述多孔顆粒的所述外表面和 內(nèi)表面上的官能團包括至少一種由于與至少一種選自由以下化合物組成的組中的化合物 反應(yīng)而產(chǎn)生的基團：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸鹽、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸鹽、重氮化合 物、異脲鹽、碳化二亞胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、雙環(huán)氧乙烷、羰基二咪唑、N-羥基琥珀 酰亞胺、硅烷以及它們的衍生物。15. 根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項所述的方法，其中位于所述磁性顆粒(Mp)上的官能團 包括選自由-SH、吡陡、 -COOH、-NH2、-CHO、-OH、苯酸、酉干、環(huán)氧基、S~Au，以及醜胺、氛乙 基、二乙基氨乙基、季銨基乙基、羧基甲基、磷酰丙基和磺基丙基組成的組中的至少一者。16. 根據(jù)權(quán)利要求10-15中任一項所述的方法，其中位于所述磁性顆粒的表面上的官能 團包括至少一種由于與至少一種選自由以下化合物組成的組中的化合物反應(yīng)而產(chǎn)生的基 團：二乙烯砜、苯醌、咪唑、高碘酸鹽、三氯-S-三嗪、甲苯磺酸鹽、重氮化合物、異脲鹽、碳化 二亞胺、肼、表氯醇、戊二醛、溴化氰、雙環(huán)氧乙烷、羰基二咪唑、N-羥基琥珀酰亞胺、硅烷以 及它們的衍生物。17. 根據(jù)權(quán)利要求10-16中任一項所述的方法，其中在所述多孔顆粒、所述磁性顆粒或 二者上引入適合于分子相互作用的分子。18. 根據(jù)權(quán)利要求10-17中任一項所述的方法，其中適合于分子相互作用的所述分子是 選自由有機分子、蛋白質(zhì)、抗原、酶、酶抑制劑、輔因子、荷爾蒙、毒素、維他命、糖綴合物、核 酸、凝集素以及碳水化合物組成的組中的至少一者。19. 根據(jù)權(quán)利要求10-18中任一項所述的方法，其中在選自由所述多孔顆粒和所述磁性 顆粒組成的組中的至少一者上引入適合于檢測的分子。20. 根據(jù)權(quán)利要求10-19中任一項所述的方法，其中適合于檢測的所述分子是選自由有 機分子、核酸、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和凝集素組成的組中的至少一者。21. 根據(jù)權(quán)利要求10-20中任一項所述的方法，其中所述磁性顆粒(Mp)包括包埋在聚合 物基體中的至少一種磁性材料的顆粒，并且其中所述聚合物基體包括所述官能團。
【文檔編號】B01J20/281GK105980046SQ201480059099
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年9月9日
【發(fā)明人】斯文·奧斯卡爾森, 克里斯托弗·埃里克松, 彼得·斯韋德林德
【申請人】微球?qū)嶒灩?br>