基于納米探針的遺傳學(xué)檢驗(yàn)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域并涉及檢測(cè)靶核酸分子中的突變的方法。另外，本發(fā)明 涉及包含如本文所述的第一綴合物和第二綴合物的試劑盒以及此類試劑盒用于檢測(cè)靶核 酸分子中的突變或用于將基因型指定給靶核酸的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 全基因組關(guān)聯(lián)研究日益將人遺傳變體與個(gè)體對(duì)治療劑的應(yīng)答相聯(lián)系。該增長(zhǎng)的知 識(shí)大大加速了個(gè)性化醫(yī)學(xué)的進(jìn)展。通過鑒定與藥物功效和安全性相關(guān)聯(lián)的遺傳熱點(diǎn)，藥物 基因組學(xué)(PGx)策略允許基于患者遺傳組成的更加個(gè)體化的藥物療法。繼而，個(gè)體化藥物療 法可使副作用最小化并且改善結(jié)果(Daly,AK(2010)Nat Rev GenetJl ,241-246)。現(xiàn)如今， PGx信息已被納入許多藥物標(biāo)簽中以輔助臨床醫(yī)生做出治療決策。
[0003] -個(gè)實(shí)例是PGx指導(dǎo)的華法林給藥。華法林是得到最廣泛描述的口服抗凝藥。盡管 華法林有效，但其由于窄的治療指數(shù)和高度可變的個(gè)體間給藥要求而位列具有嚴(yán)重不良事 件報(bào)告的前10種藥物中。因此，重要的是用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)來頻繁監(jiān)測(cè)抗凝狀態(tài)，尤 其是在開始華法林療法后的早期。缺乏可用于鑒定適當(dāng)初始劑量的信息通常導(dǎo)致多次劑量 調(diào)整并增加血栓栓塞事件或出血的風(fēng)險(xiǎn)。在過去十年里，PGx研究揭示了華法林劑量要求與 若干遺傳學(xué)單核苷酸多態(tài)性（SNP)的存在之間的相關(guān)性。最顯著相關(guān)的SNP包括細(xì)胞色素 P450酶CYP2C9基因中的兩種編碼變異：CYP2C9*2(rsl799853)和CYP2C9*3(rsl057910);和 維生素 K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物I(VKORCl)基因中的一種變異：?jiǎn)?dòng)子SNP-1639G>A (rs9923231)(The International Warfarin Pharmacogenetics Consortium(2009)N Engl J Med,360,753-764)。這些SNP可解釋高達(dá)35%的患者間華法林劑量可變性。在2010 年，美國(guó)FDA更新了帶有PGx指導(dǎo)劑量范圍的華法林的標(biāo)簽規(guī)定（Highl ights of prescribing information·Coumadin(2010)http://packageinserts·bms·com/pi/pi_ coumadin. pdf)。可通過參考包含穩(wěn)定維持劑量的表格來預(yù)測(cè)起始劑量，所述穩(wěn)定維持劑量 是在具有CYP2C9和VK0RC1變體的不同組合的多位患者中觀察得到。結(jié)合了傳統(tǒng)臨床因素和 患者遺傳狀態(tài)的給藥算法也是可用的。近來，大規(guī)模的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)PGx指導(dǎo)的華法林療 法將剛開始華法林療法的患者的住院率降低了~30% (Epstein，RS等人，（2010) J Am Col 1 Cardiol，22，2804-2812)。隨機(jī)臨床試驗(yàn)CoumaGen-II為將基因型知識(shí)整合到劑量選擇中的 臨床益處提供了進(jìn)一步的證據(jù)(Anderson,JL等人，（2012)Circulation, 125，1997-2005) 〇 隨著華法林基因分型的價(jià)值被越來越多的臨床試驗(yàn)所支持，可預(yù)期PGx結(jié)果對(duì)臨床實(shí)踐的 重要性也會(huì)日益增加。快速且高性價(jià)比的基因型檢驗(yàn)將大大促進(jìn)此過程。
[0004] 當(dāng)前可用的基因分型平臺(tái)包括DNA微陣列、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、單堿基延伸 和高分辨率解鏈分析(Kim,S和Misra，A(2007)Annu Rev Biomed Eng，9,289-320)。盡管這 些平臺(tái)在高通量研究中非常有用，但其由于涉及到昂貴的儀器和試劑而在按需臨床檢驗(yàn)中 的性價(jià)比較低（Joyce,HS(2011)Expert Opin Pharmacol，12,435-441) ADA已批準(zhǔn)了四種 針對(duì)華法林敏感性基因分型的商業(yè)測(cè)定，包括無限（Inf ini ty)華法林測(cè)定(Autogenomics， Inc. ,Vista,CA,USA)、E感應(yīng)（eSensor)華法林敏感性試驗(yàn)（GenMark Diagnostics，Inc.， Carlsbad ,CA, USA)、eQ-PCR LC 華法林基因分型試劑盒(TrimGen ,Sparks ,MD ,USA)和威力基 因（Verigene)華法林代謝核酸試驗(yàn)(Nanosphere ,NorthBrook, IL,USA)。這些測(cè)定中的一些 以護(hù)理點(diǎn)(point-of-care)應(yīng)用為目標(biāo)，但需要專門的儀器來進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0005] 高度異質(zhì)樣本(例如腫瘤樣品）的基因型分析比SNP基因分型更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)轶w 細(xì)胞突變檢測(cè)必須在大的野生型DNA背景下進(jìn)行。對(duì)于雜合SNP樣品，MUT/WT等位基因比率 為50%，而對(duì)于腫瘤樣本中的體細(xì)胞突變而言，該比率可小于10%。需要高度敏感的檢測(cè)方 法來測(cè)量突變。通常，采用通過等位基因特異性PCR富集突變序列或PCR鉗制策略來實(shí)現(xiàn)高 敏感性(Mi lbury，CA( 2009) Cl in Chem ,55,632-640) 〇
[0006] 近來，制備出一種新型等離子體納米粒子(NP)探針：用非離子嗎啉代寡核苷酸 (MOR)功能化的金NP(Zu，Y等人，（2011 )Small，7,306-310)』ΝΑ靶的檢測(cè)基于雜交時(shí)納米探 針穩(wěn)定性的變化，即，納米探針在結(jié)合至帶負(fù)電的DNA靶時(shí)變得更加穩(wěn)定?？珊?jiǎn)單地通過向 溶液中添加鹽來揭示NP穩(wěn)定性變化。靶穩(wěn)定化的納米探針的顏色保持為紅色，而未附接DNA 的納米探針將聚集，從而導(dǎo)致溶液顏色改變?？赏ㄟ^靶-探針雜交體的多種解鏈轉(zhuǎn)變溫度 (Tm)(圖1)對(duì)具有類似序列的靶加以區(qū)分。極其尖銳的轉(zhuǎn)變確保了高檢測(cè)特異性。
[0007] 然而，由于基于納米探針的方法的低敏感性(檢測(cè)限~InM)，不能直接對(duì)基因進(jìn)行 分析。在檢測(cè)之前，需要通過PCR來擴(kuò)增靶序列。在本研究中，已發(fā)現(xiàn)，T m值高度依賴于靶濃 度并且可受到測(cè)定溶液中存在鹽的顯著影響。由于PCR產(chǎn)率通常是未知的并且不同的主溶 液可含有多種鹽組分，因此難以通過使用單組納米探針和不同的擴(kuò)增模板DNA分子來分析 PCR產(chǎn)物。此類檢測(cè)方法描述于WO 2011/087456中。
[0008] 因此，盡管近年來付出了較大的研究努力，但仍未開發(fā)出允許結(jié)合護(hù)理點(diǎn)應(yīng)用來 測(cè)定基因型的穩(wěn)健遺傳學(xué)檢驗(yàn)平臺(tái)。盡管如此，本領(lǐng)域中需要此類遺傳學(xué)檢驗(yàn)平臺(tái)來加速 個(gè)性化醫(yī)學(xué)的進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是通過提供一種組合物來滿足上述需求，所述組合物包含如本文所 述的第一綴合物和第二綴合物或由其組成。意外的是，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，使用至少兩種不同的 綴合物(這些綴合物中的每一者均包含寡核苷酸類似物和納米粒子)允許對(duì)SNP(單核苷酸 多態(tài)性)突變進(jìn)行檢測(cè)，而無需使用第二擴(kuò)增模板DNA分子，即所謂的對(duì)照或參比分子。在本 文中，提供一種基于雙納米探針測(cè)定的穩(wěn)健的遺傳學(xué)檢驗(yàn)平臺(tái)，由此采用一對(duì)納米探針以 允許對(duì)基因型的明確測(cè)定。所述平臺(tái)利用不對(duì)稱PCR(aPCR)進(jìn)行靶序列擴(kuò)增，并利用比色信 號(hào)進(jìn)行端點(diǎn)檢測(cè)。檢測(cè)所需的唯一設(shè)備是標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀。測(cè)定信號(hào)可通過肉眼觀察或通過 數(shù)碼相機(jī)記錄。因此，所述平臺(tái)顯著降低儀器和試劑的資本投資，并提供高性價(jià)比的檢驗(yàn)。
[0010] 在一個(gè)方面，本發(fā)明因此涉及一種檢測(cè)樣品中的靶核酸分子中的突變的方法，其 包括以下步驟：（i)使包含第一納米粒子和第一寡核苷酸類似物的第一綴合物與包含靶核 酸序列的等分試樣在允許所述第一綴合物和所述靶核酸分子彼此雜交的條件下接觸，以形 成第一綴合物:靶核酸分子復(fù)合物，其中所述第一寡核苷酸類似物為與所述第一納米粒子 共價(jià)偶聯(lián)的磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第一寡核苷酸類似物包含 與所述靶核酸的未突變序列互補(bǔ)的堿基序列；（ii)使包含第二納米粒子和第二寡核苷酸類 似物的第二綴合物與包含靶核酸序列的另一等分試樣在允許所述第二綴合物和所述靶核 酸分子彼此雜交的條件下接觸，以形成第二綴合物:靶核酸分子復(fù)合物，其中所述第二寡核 苷酸類似物為與所述第二納米粒子共價(jià)偶聯(lián)的磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)或其衍生物， 其中所述第二寡核苷酸類似物包含堿基序列，所述堿基序列與所述靶核酸的突變序列互補(bǔ) 并且與所述第一寡核苷酸類似物的所述堿基序列相差至少一個(gè)核堿基，并且其中所述第一 寡核苷酸類似物和所述第二寡核苷酸類似物具有至少85%的序列同一性;和（iii)測(cè)定步 驟(i)和（ii)的所述復(fù)合物的解鏈溫度T m并通過比較所述復(fù)合物的Tm來檢測(cè)所述靶核酸分 子是否包含所述突變。
[0011] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包含第一綴合物和第二綴合物，或由第 一綴合物和第二綴合物組成，所述第一綴合物包含第一納米粒子和第一寡核苷酸類似物， 其中所述第一寡核苷酸類似物為與所述第一納米粒子共價(jià)偶聯(lián)的磷酰二胺嗎啉代寡聚物 (PMO)或其衍生物，并且所述第二綴合物包含第二納米粒子和第二寡核苷酸類似物，其中所 述第二寡核苷酸類似物為與所述第二納米粒子共價(jià)偶聯(lián)的磷酰二胺嗎啉代寡聚物(PMO)或 其衍生物，其中所述第一寡核苷酸類似物與所述第二寡核苷酸類似物相差至少一個(gè)核堿 基，并且其中所述第一寡核苷酸類似物與所述第二寡核苷酸類似物具有至少85%的序列同 一性。
[0012] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及如本文所述的試劑盒用于檢測(cè)靶核酸分子中的突變或 用于將基因型指定給靶核酸的用途。
【附圖說明】
[0013] 當(dāng)與非限制實(shí)施例和附圖結(jié)合考慮時(shí)，參考詳細(xì)描述將更好地理解本發(fā)明。
[0014]圖1示出通過納米探針識(shí)別DNA靶的示意圖。當(dāng)靶序列與探針完全匹配時(shí)，納米粒 子在鹽的存在下得以穩(wěn)定。隨著溫度上升，靶/納米探針雜交體在被稱為1的溫度下解離， 導(dǎo)致納米粒子聚集以及溶液色變。單堿基錯(cuò)配導(dǎo)致T m下降5_15°C。當(dāng)靶序列為隨機(jī)的情況 下，納米探針溶液在與鹽一起溫育1分鐘后在室溫下轉(zhuǎn)成無色。
[0015]圖2示出作為靶序列的函數(shù)的Tm。納米探針和靶序列的單堿基錯(cuò)配導(dǎo)致1"降低5-15 °C。當(dāng)采用兩組納米探針WT和MUT探針時(shí)，每個(gè)靶可獲得一對(duì)Tmt3WT和MUT靶分別通過(TmWT_ WT、Im MUT_WT)和(Tm WT_MUT、Im mut_MUT)來表征。
[0016]圖3示出通過使用WT和MUT納米探針獲得的1"的代表性散點(diǎn)圖。根椐靶序列，數(shù)據(jù) 點(diǎn)（TmWT、TmMUT)位于其特定的線性區(qū)域(WT、MUT和雜合區(qū)域），這些線性區(qū)域幾乎彼此平 行。紅色虛線表示與異質(zhì)樣品中的MUT/WT比率變化對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)點(diǎn)的跡線。
[0017] 圖4示出（a)p53WT納米探針和(b)p53MUT納米探針的作為合成靶濃度的函數(shù)的Tm 值。Tm測(cè)量誤差=± 1°C。
[0018] 圖5示出通過使用P53WT和MUT納米探針和合成DNA靶獲得的Tm WT和Tm MUT的散點(diǎn) 圖。
[0019] 圖6示出當(dāng)合成DNA的MUT/WT序列比率變化時(shí)通過使用P53WT和MUT探針獲得的Tm 值。Tm測(cè)量誤差=± 1°C。
[0020]圖7示出針對(duì)p53基因分析的基于納米探針的遺傳學(xué)檢驗(yàn)的工作流程。
[0021 ] 圖8示出p53基因的319-bp DNA片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0022]圖9示出p53基因的基因分型密碼子280G>A的散點(diǎn)圖。gDNA樣品提取自細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-230。雜合樣品為WT和MUT gDNA的1:1混合物。每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)獲自六次獨(dú)立測(cè) 定(一些數(shù)據(jù)點(diǎn)彼此重疊）。
[0023] 圖10示出當(dāng)gDNA的MUT/WT序列比率變化時(shí)通過使用p53WT和MUT探針獲得的Tm值。
[0024] 圖 11示出靶向（a)CYP2C9*2SNP、（b)CYP2C9*3SNP和（c)VK0RCl-1639G>A SNP的WT 和MUT探針的作為合成