專利名稱：具有殼核結(jié)構(gòu)的磁性熒光納米顆粒的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料、生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磁性熒光復(fù)合納米顆粒的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中，標(biāo)記和富集分離是必不可少的步驟。稀土熒光納米顆粒具有熒光壽命長、Stokes位移大、激發(fā)譜較寬而發(fā)射峰尖銳等標(biāo)記優(yōu)勢，已逐步取代傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料，運用于生物標(biāo)記和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，但不具備采集和分離功能。磁性納米顆粒具有良好的超順磁性和表面易功能化等特點，能與欲分離的目標(biāo)物相結(jié)合，在外磁場的作用下定向集中，但本身不具備標(biāo)記的功能。隨著科技的進(jìn)步，單一的熒光納米材料或磁性納米材料已經(jīng)難以滿足學(xué)科發(fā)展需求。兼具熒光可示蹤性和超順磁響應(yīng)性的雙功能磁性熒光納米顆粒具有富集和標(biāo)記的雙重功能，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著更廣闊的應(yīng)用前景。運用傳統(tǒng)的自主裝、共沉淀等方法制備出的納米顆粒表面粗糙、均勻性較差、熒光易淬滅等缺陷。本發(fā)明將微乳液法和layer-by-layer自組裝法相結(jié)合，首先以!^e3O4納米粒子作為磁性核，外包二氧化硅殼，制備具有核殼結(jié)構(gòu)的二氧化硅磁性微球，再將稀土熒光物質(zhì)吸附在二氧化硅的殼層上，二氧化硅殼層表面可以結(jié)合大量的稀土熒光物質(zhì)。然后，再在其外面包裹上一層二氧化硅以提高其熒光磁性微球穩(wěn)定性，防止團(tuán)聚和熒光物質(zhì)泄漏。由于顆粒里包裹了大量的稀土熒光物質(zhì)，因此，所制備顆粒的熒光強度高。該磁性熒光納米顆粒的表面可進(jìn)行各種修飾，直接連接生物活性物質(zhì)，將在免疫分析、疾病診斷、定量檢測、磁共振成像、光動力治療等方面發(fā)揮重要作用，極大地推動生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種粒徑小、磁響應(yīng)性強、熒光信號強、抗光漂白性強、生物相容性好、易于表面修飾的單分散磁性熒光納米顆粒。該顆?？梢詰?yīng)用于生物標(biāo)記、分離、 富集、檢測等領(lǐng)域。本發(fā)明的磁性熒光納米顆粒是以磁性納米粒子為核，核外層包裹一層多孔性的 SiO2，熒光物質(zhì)通過共價、靜電吸附等方式固定在孔內(nèi)及顆粒表面，再在此顆粒的表面包裹一層Si02。其粒度控制在10-500nm之間。本發(fā)明提出的具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性熒光納米顆粒的磁性內(nèi)核可以是狗304、 Y -Fe203> MeFe2O4(Me = Co、Mn、Ni)、金屬 Ni，Co, Fe 及其合金 i^e-Co，Ni-Fe 等的一種或幾種，優(yōu)選Fii3O4。本發(fā)明提出的具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性熒光納米顆粒中含有的熒光物質(zhì)可以是稀土元素(如Eu3+、Sm3+、Dy3+、Tb3+等)與螯合劑形成的螯合物，該螯合物可以在紫外光激發(fā)下發(fā)射出明亮的特征性熒光。本發(fā)明提出的具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性熒光納米顆粒的制備過程中，運用的稀土元素螯合劑可以是多氨基多羧酸類螯合劑、菲咯啉類螯合劑、二酮類螯合劑、水楊酸類螯合劑、吡啶類螯合劑等化合物，能與三價稀土元素螯合形成螯合物、在紫外光激發(fā)下發(fā)射稀土元素特征性熒光。本發(fā)明提出的具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性熒光納米顆粒中的螯合物可以采用以下任一種方式固定在多孔二氧化硅的孔內(nèi)及表面共價偶聯(lián)、靜電吸附等，優(yōu)選共價偶聯(lián)。本發(fā)明提出的具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性熒光納米顆粒的最外層是SiA包覆層，既可通過正硅酸乙酯水解得到表面帶有羥基的硅層，又可通過硅烷偶聯(lián)劑水解得到表面帶有特定功能基團(tuán)的硅層，便于直接與生物分子共價偶聯(lián)或靜電吸附，制成生物分子探針。本發(fā)明提出的具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性熒光納米顆粒具有熒光量子效率高、激發(fā)光譜帶較寬、發(fā)射譜帶窄、StOkes位移大、熒光壽命長等特點。本發(fā)明提出的具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性熒光納米顆粒無生物毒性，可以用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的生物標(biāo)記、分離、富集、檢測等領(lǐng)域。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
圖1是磁性熒光納米顆粒透射電鏡照片(左圖)和發(fā)射光譜(右圖)
具體實施例方式盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對本發(fā)明專利的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進(jìn)行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1超順磁性納米顆粒的制備稱取2. 71g FeCl3 ·6Η20禾口 1. 18gFeCl2 ·4Η20溶于50ml蒸餾水中，攪拌混勻后，加入4mL濃氨水，室溫攪拌反應(yīng)30min，在磁場作用下，收集產(chǎn)物，去除上清。用去離子水洗滌產(chǎn)物3次，200mL/次。用去離子水將顆粒定容至50mL。實施例2i^e304@SiA納米顆粒的制備分別取7. 5mL環(huán)己烷、1. 77mL Triton X-100、1. 8mL正己醇于IOmL燒瓶中，混合均勻；加入480yL !^e3O4水溶液，攪拌5min以后形成油包水的微膠囊，隨后加入100 μ L TEOS, 攪拌混勻，加入60 μ L氨水；錫紙包裹，反應(yīng)Mh ；加入等體積的丙酮，渦旋，打破微乳液體系；置于磁場中，靜置片刻，吸棄液體；依次用丙酮、無水乙醇、水洗滌顆粒，50mL/次，洗滌過程中，渦旋、超聲破碎顆粒。將顆粒重懸于50mL IM鹽酸中，室溫靜置Mh。置于磁場中，靜置片刻，吸棄液體；用去離子水、無水乙醇各洗滌顆粒3次，50mL/次；將顆粒重懸于20mL 無水乙醇中。實施例3包覆稀土熒光絡(luò)合物往50 μ L 0. IM BHHCT溶液中加入6. 3 μ L三氨丙基三乙氧基硅烷，渦旋混勻，室溫靜置20min，加入50 μ L 0. IM EuCl3溶液，混勻，室溫靜置20min。將此液體轉(zhuǎn)至實施例2中所得的!^e3O4IgSiA無水乙醇懸液中，避光，80°C冷凝回流18h。置于磁場中，靜置片刻，吸棄液體；用去離子水、無水乙醇各洗滌顆粒3次，50mL/次。將顆粒置于60°C真空干燥箱中干燥約1 后，得到表面包覆有熒光絡(luò)合物的磁性納米顆粒。實施例4包覆SiO2層用乙醇、氨水混合液(無水乙醇氨水=10 1)將實施例4所得顆粒稀釋至1.2L，加入^mL TE0S，緩慢攪拌下，避光、室溫反應(yīng)Mh。置于磁場中，靜置片刻，吸棄液體； 用去離子水、無水乙醇各洗滌顆粒3次，50mL/次；將顆粒重懸于5mL無水乙醇中。即得磁性熒光納米顆粒，該顆粒的電鏡照片及發(fā)射光譜見圖1。實施例5稀土熒光納米顆粒的表面修飾(以引入環(huán)氧基為例)將實施例4中的顆粒置于45mL無水乙醇中，加入ImL 3_縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)，避光，80°C冷凝回流18h。置于磁場中，靜置片刻，吸棄液體；用去離子水、無水乙醇各洗滌顆粒3次，50mL/次。將顆粒置于60°C真空干燥箱中干燥約1 后，得到表面帶有環(huán)氧基基團(tuán)的磁性熒光納米顆粒。實施例6與生物分子共價偶聯(lián)(以抗體為例)取Img制備好的磁性熒光微球，PBS定容到4mL，加入水溶性0. 5mg抗體，37°C低速磁力攪拌濁，加入0. OlM Tris-HCl (pH8.0)，繼續(xù)攪拌lh，磁分離，IXPBS洗滌數(shù)次，加入
儲存液4°C保存待用。實施例7用于免疫層析檢測(以檢測大腸桿菌0157:H7為例)用點膜儀在硝酸纖維素膜上按照1 μ L/cm的量噴涂1. Omg/mL兔抗0157 :H7多抗和1. Omg/mL的羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質(zhì)控線。依次將硝酸纖維素膜、樣品墊、吸收墊粘貼于PVC襯板上，組裝成免疫層析試紙條。然后，切割成4mm寬的試紙條，置于密封袋中，加干燥劑，密封，4°C保存?zhèn)溆?。取ImL待測大腸桿菌0157 :H7菌液，加入20 μ L制備好的單抗-磁性熒光納米顆粒復(fù)合物溶液，室溫孵育5min，磁力吸附，除去上清。取60 μ L結(jié)合液重懸顆粒，將重懸液滴加到樣品墊上，室溫反應(yīng)lOmin，紫外燈下觀察檢測結(jié)果。試紙條檢測結(jié)果表明用該磁性熒光納米顆粒制備的E. coli 0157:H7檢測試紙條靈敏性為4. 0X104cell/mL，只與E. coli 0157:H7有交叉反應(yīng)，與E. coli026:Hll、E. coli 0111 :H8、沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、溶血性鏈球菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、板崎腸桿菌、霍亂弧菌等均無交叉反應(yīng)。檢測571份樣品，免疫層析法與實時PCR總符合率為95. 97%。實施例8用于核酸純化(以提取人血液DNA為例)取100 μ L正常人血，加入900 μ L裂解液(6Μ異硫氰酸胍，50mM Tris-HCl，pH7. 0) 和200 μ g磁性熒光納米顆粒，反應(yīng)lOmin，磁性分離，棄掉液體。用裂解液洗滌磁性熒光納米顆粒2次，再用75%乙醇洗滌磁性熒光納米顆粒2次，用IOmM Tris-HCl (pH8. 5)洗脫核酸，磁力吸附，取上清，即為DNA。將所得DNA用分光光度計進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表1。表16份血液DNA測定數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種磁性熒光納米顆粒的制備及其應(yīng)用方法，其特征在于以具有超順磁性的納米顆粒為核，外包二氧化硅，再通過共價鍵等方式將稀土納米顆粒固定在二氧化硅殼層上，再在其外面包裹上一層二氧化硅。
2.如權(quán)利1所述的磁性熒光納米顆粒，其特征在于其粒徑在10-500nm范圍內(nèi)。
3.如權(quán)利1所述的磁性熒光納米顆粒，其特征在于其內(nèi)核為狗304、Y-Fe2O3^ MeFe2O4 (Me = Co、Mn、Ni)、金屬 Ni，Co，F(xiàn)e 及其合金 Fe-Co，Ni-Fe 等的一種或幾種。
4.如權(quán)利1所述的磁性熒光納米顆粒，其特征在于含有的熒光物質(zhì)是稀土元素(如 Eu3+、Sm3+、Dy3+、Tb3+等)與螯合劑形成的螯合物，該螯合物可以在紫外光激發(fā)下發(fā)射出稀土元素的特征性熒光。
5.如權(quán)利1所述的磁性熒光納米顆粒，其特征在于其外殼層為Si02。
6.如權(quán)利1所述的磁性熒光納米顆粒，其特征在于所述顆粒熒光、磁性或同時兼具熒光和磁性。
7.如權(quán)利1所述的磁性熒光納米顆粒，其特征在于可以與生物分子共價偶聯(lián)，制成生物探針用于生物分析與檢測。
8.如權(quán)利1所述的磁性熒光納米顆?？捎糜谏锓蛛x與純化。
9.采用6至8所述的磁性熒光納米顆粒進(jìn)行快速生物分析方法，該方法包括以下步驟(1)將可識別待測目標(biāo)物的生物活性分子修飾于磁性熒光納米顆粒表面；(2)將步驟(1)獲得的磁性熒光納米材料加入待測溶液中；(3)磁性分離步驟( 得到磁性熒光納米顆粒-目標(biāo)物質(zhì)復(fù)合物，該磁性熒光納米顆粒-目標(biāo)物質(zhì)復(fù)合物可以直接用于下游生物學(xué)應(yīng)用，還可在特殊條件下，將磁性熒光納米顆粒與目標(biāo)物質(zhì)分離，得到高純度的目標(biāo)物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼核結(jié)構(gòu)的熒光磁性納米顆粒的制備方法和應(yīng)用。首先，以Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O4(Me＝Co、Mn、Ni)、金屬Ni、Co、Fe及其合金Fe-Co、Ni-Fe等納米粒子的一種或幾種作為內(nèi)核，外包二氧化硅殼，制備具有核殼結(jié)構(gòu)的二氧化硅磁性微球，再將熒光物質(zhì)(Eu3+、Sm3+、Dy3+、Tb3+等的螯合物)吸附在二氧化硅的殼層上。然后，再在其外面包裹上一層二氧化硅以提高其熒光磁性微球穩(wěn)定性，防止團(tuán)聚和熒光物質(zhì)外泄。由于殼層里包裹了大量的稀土熒光物質(zhì)，因此所制備樣品的熒光強度信號大大增強。該納米顆粒具有富集和標(biāo)記的雙重功能，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著更廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號H01F1/00GK102500291SQ20111029560
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者朱海, 李富榮, 李金峰, 王西麗, 蔣原 申請人:深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司