納米探針的nmr病毒快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種病毒的快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基本原理:單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，這種結(jié)合不會(huì)改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學(xué)特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會(huì)與特異性的抗原結(jié)合。KMnF4納米探針為抗體修飾改性的KMnF 4納米粒子，KMnF 4由于具有元素Mn，其最外層有未成對(duì)電子，因而具有持久的電子自旋。非成對(duì)電子自旋的總磁矩是質(zhì)子自旋的657倍。由于弛豫效率隨著磁矩的平方變化，所以電子弛豫效率是質(zhì)子弛豫效率的50萬(wàn)倍，因此，其粒子對(duì)周圍水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫時(shí)間的影響非常大。這也就是這類物質(zhì)作為核磁共振造影劑的機(jī)理。非常微量的納米KMnF4就會(huì)造成水的核磁共振自旋-晶格弛豫時(shí)間大幅下降，通過(guò)空白對(duì)照就能明確，是由于存在這種物質(zhì)引起的。因此可以構(gòu)建KMnF4納米探針生物傳感器，從磁共振的角度來(lái)做檢測(cè)特定物質(zhì)，本發(fā)明就是通過(guò)構(gòu)建抗體修飾的生物傳感器來(lái)對(duì)特異性的病毒進(jìn)行檢測(cè)。
[0003]其主要的步驟原理:1)檢測(cè)目標(biāo)病毒的特異性KMnF4納米探針的制備。從市場(chǎng)上購(gòu)買KMnF4納米材料，也可以通過(guò)其他化學(xué)合成方法制備納米級(jí)的KMnF 4。使用娃燒偶聯(lián)劑或PEG (聚乙二醇)，修飾提高生物相容性，其通式為:Y(CH2)nSiX3。此處，η為0_3 ;X為可水解的基團(tuán)4為有機(jī)官能團(tuán)。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，這些基團(tuán)水解時(shí)即生成硅醇(Si (0H)3)，而與無(wú)機(jī)物質(zhì)結(jié)合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、環(huán)氧基、甲基丙烯酰氧基、巰基。這些反應(yīng)基團(tuán)可與有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)而結(jié)合。因此，通過(guò)使用硅烷偶聯(lián)劑，可在無(wú)機(jī)物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)的界面之間架起“分子橋”，把兩種性質(zhì)懸殊的材料連接在一起提高復(fù)合材料的性能和增加粘接強(qiáng)度的作用。再通過(guò)修飾特異性抗體可實(shí)現(xiàn)表面功能化，形成特異性探針，再封閉多余的活性位點(diǎn)。2)采用常規(guī)方法將待檢目標(biāo)病毒的特異性單抗固定在酶標(biāo)板表面，并將多余活性位點(diǎn)封閉，備用。將單抗在酶標(biāo)板上固定，這已經(jīng)是業(yè)界的成熟技術(shù)。3)將待檢樣品加到第2)步制得的固定了目標(biāo)病毒單抗的酶標(biāo)板上孵育20mins，若樣品中存在目標(biāo)病毒，則目標(biāo)病毒會(huì)與酶標(biāo)板上的單抗結(jié)合，通過(guò)洗滌，則目標(biāo)病毒被固定在酶標(biāo)板上。4 )將第1)步所制的抗體修飾的KMnFjft米探針加入第3)步所得到的酶標(biāo)板上，此時(shí)，如果酶標(biāo)板上有目標(biāo)病毒，通過(guò)探針的特異性反應(yīng)，則探針會(huì)與酶標(biāo)板上的目標(biāo)病毒發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)，此時(shí)用無(wú)菌的去離子水清洗，就可以將沒(méi)有結(jié)合的探針洗去。在酶標(biāo)板上剩下的就只有結(jié)合目標(biāo)病毒的探針。若酶標(biāo)板上沒(méi)有目標(biāo)病毒，則所以探針都被洗去。5 )加入定量的洗脫液(30%甲醇)將酶標(biāo)板上的結(jié)合了目標(biāo)病毒的探針洗脫下來(lái)。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測(cè)定溶液的自旋-晶格弛豫時(shí)間。以無(wú)菌的去離子水重復(fù)上述步驟作為空白，溶液測(cè)得的自旋-晶格弛豫時(shí)間與空白相比較，有顯著差異，說(shuō)明溶液中有探針存在，從而說(shuō)明樣品中有目標(biāo)病毒，探針的量與自旋-晶格弛豫時(shí)間的下降值呈正比。下降的越多說(shuō)明探針越多，從而間接說(shuō)明目標(biāo)病毒越多，通過(guò)加標(biāo)驗(yàn)證定量檢測(cè)樣品中目標(biāo)病毒的數(shù)目。
[0004]該方法利用了酶標(biāo)板固定技術(shù)，雙抗夾心技術(shù)，核磁共振技術(shù)，其步驟設(shè)計(jì)主要是針對(duì)操作過(guò)量時(shí)的探針的有效分離，使檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。對(duì)于可以采用雙抗夾心技術(shù)分離的病毒可適用，對(duì)于一些特殊的病毒，不能采用雙抗夾心的，則不適用。
[0005]該方法的主要優(yōu)點(diǎn)就是快速、靈敏度高。相對(duì)于病毒的微生物培養(yǎng)2-3天甚至幾天的時(shí)間。此方法主要取決于樣品的預(yù)處理時(shí)間，核磁共振檢測(cè)只需幾分鐘。因此，用該方法可做大規(guī)模待檢樣品的陽(yáng)性篩選，一定程度上可以定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種基于KMnF4納米探針的NMR病毒快速檢測(cè)方法，用于對(duì)各種不同的樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。該方法是一種客觀有效的檢出樣品中病毒的方法，從而在某種程度上大大縮減了樣品病毒的篩選時(shí)間。
[0007]—種基于KMnFjft米探針的NMR病毒快速檢測(cè)方法，核磁共振儀對(duì)順磁物質(zhì)的響應(yīng)敏感性，提出核磁共振弛豫參數(shù)變化與KMnFjft米探針含量的相關(guān)性指標(biāo)。
[0008]本發(fā)明依賴于建立的可用于樣品中有害病毒特異性KMnFjfi米探針的分離，從核磁共振弛豫時(shí)間變化的角度，檢測(cè)出樣品中的有害病毒。由于核磁共振儀自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率對(duì)KMnF4納米探針?lè)浅Ｃ舾?，即在去離子水中，存在微量的KMnF4納米探針，則水的自旋-晶格弛豫時(shí)間和自旋-自旋弛豫就會(huì)顯著下降。通過(guò)定量檢測(cè)出樣品中的免疫探針含量，從而可以間接定量出樣品中的有害病毒含量。檢測(cè)出的病毒含量與探針含量線性相關(guān)，擬合度較好。最終以免疫探針與病毒間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為紐帶，確定樣品中的病毒數(shù)。因此，該方法可做大規(guī)模待檢樣品的陽(yáng)性篩選，一定程度上可以定量檢測(cè)。
[0009]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0010]本發(fā)明所述的一種基于KMnF4納米探針的NMR病毒快速檢測(cè)方法，步驟如下。
[0011 ] (1)檢測(cè)目標(biāo)病毒的特異性KMnFjfi米探針的制備。
[0012](2)將目標(biāo)病毒特異性單抗固定在酶標(biāo)板表面，并將多余的活性位點(diǎn)用牛血清蛋白封閉。
[0013](3)將待檢樣品加到步驟(2)制得的固定了目標(biāo)病毒單抗的酶標(biāo)板上孵育20mins，若樣品中存在目標(biāo)病毒，則目標(biāo)病毒會(huì)與酶標(biāo)板上的單抗結(jié)合，通過(guò)洗滌，則目標(biāo)病毒被固定在酶標(biāo)板上。
[0014]( 4 )將步驟(1)所制的抗體修飾的KMnF4納米探針加入步驟(3)所得到的酶標(biāo)板上，此時(shí)，如果酶標(biāo)板上有目標(biāo)病毒，通過(guò)探針的特異性反應(yīng)，則探針會(huì)與酶標(biāo)板上的目標(biāo)病毒發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)，此時(shí)用無(wú)菌的去離子水清洗，就可以將沒(méi)有結(jié)合的探針洗去。在酶標(biāo)板上剩下的就只有結(jié)合目標(biāo)病毒的探針。若酶標(biāo)板上沒(méi)有目標(biāo)病毒，則所以探針都被洗去。
[0015]( 5 )加入定量的洗脫液(30%甲醇)將酶標(biāo)板上的結(jié)合了目標(biāo)病毒的探針洗脫下來(lái)。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測(cè)定溶液的自旋-晶格弛豫時(shí)間。以無(wú)菌的去離子水重復(fù)上述步驟作為空白，溶液測(cè)得的自旋-晶格弛豫時(shí)間與空白相比較，有顯著差異，說(shuō)明溶液中有探針存在，從而說(shuō)明樣品中有目標(biāo)病毒，探針的量與自旋-晶格弛豫時(shí)間和自旋-自旋弛豫時(shí)間的下降值呈正比。下降的越多說(shuō)明探針越多，從而間接說(shuō)明目標(biāo)病毒越多，通過(guò)加標(biāo)驗(yàn)證定量檢測(cè)樣品中目標(biāo)病毒的數(shù)目。
[0016]所述探針為具有順磁特性的KMnF4納米材料，納米粒徑小于200納米。
[0017]所述的目標(biāo)病毒的最終檢出評(píng)價(jià)方法基于核磁共振弛豫時(shí)間的變化。
[0018]所述弛豫時(shí)間特性，是指自旋-晶格弛豫時(shí)間和自旋-自旋弛豫時(shí)間。
[0019]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種客觀的快速檢測(cè)出樣品中的有害病毒的方法，其特征是依賴于建立的可用于檢測(cè)KMnF4納米探針的核磁共振檢測(cè)方法。該方法可以客觀有效地對(duì)樣品中病毒進(jìn)行檢測(cè)，相比于病毒的生物培養(yǎng)確認(rèn)，該方法具有快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，可以用于大規(guī)模樣品的快速篩選。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0021]實(shí)施例1。
[0022]檢驗(yàn)樣品測(cè)定其是否含有病毒一一牛病毒性腹瀉病毒。
[0023]1.KMnF4納米粒子制備:KMnF 4納米粒子可以從市場(chǎng)購(gòu)買，也可以采用以下方法制備:稱取1.6mmol MnCl2*4H20加入到反應(yīng)釜中，再加入10mL的無(wú)水乙醇，攪拌溶液至完全溶解；稱取3mmol油酸鉀加入上述溶液，攪拌l_2min，使其混勻；稱取5_6g的氟化鉀(KF)研磨lOmin以上，當(dāng)其粒徑變小變細(xì)之后，稱取4.98mmol，將其加入之前的溶液中；再次加入無(wú)水乙醇，一般30mL ;夾套套緊，密封好后，將反應(yīng)釜放入烘箱，將溫度調(diào)制160°C，反應(yīng)24h ;當(dāng)反應(yīng)釜降至室溫時(shí)，一般是在關(guān)閉烘箱后的3-4h即可。打開反應(yīng)釜，將上清液倒去，用無(wú)水乙醇洗滌并攪拌；洗滌完一次就進(jìn)行一次離心，直到上清液澄清為止。轉(zhuǎn)速8000r/min，時(shí)間3min ;將洗滌好的樣品放入烘箱中，溫度調(diào)至60°C，所得顆粒粒徑一般是20nm ；
KMnF4納米粒子羧基修飾:將得到的1^必4與PEG-1500按質(zhì)量比1:10在無(wú)水乙醇的溶解下，加入反應(yīng)釜中，密封完畢后放入烘箱中，將溫度調(diào)至90°C，反應(yīng)12小時(shí)；當(dāng)反應(yīng)釜降至室溫時(shí)，一般是在關(guān)閉烘箱后的3-4h即可。打開反應(yīng)釜，將上清液倒去，用無(wú)水乙醇洗滌并攪拌；洗滌完一次就進(jìn)行一次離心，直到上清液澄清為止。轉(zhuǎn)速8000r/min，時(shí)間3min ;將洗滌好的最終產(chǎn)品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修飾的KMnF4納米粒子。
[0024]抗體修飾:稱取一定量的羧基修飾的腸必4納米粒子，加入2倍質(zhì)量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各lmL。放在混勻儀上，轉(zhuǎn)速15轉(zhuǎn)，反應(yīng)45mi